والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية
أكتوبر 4, 2018
ويرد هنا، بروتوكولا لتحليل الإنتاجية متوسطة إلى عالية البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي. والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.
هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات بيولوجيا الخلايا وعلم المناعة مثل كيف تتأثر مسارات الإشارة بمحفزات مختلفة أو أدوية مختلفة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لك لأداء خلية واحدة الإشارات التحليل في المتوسطة إلى عالية الأزياء الإنتاجية. بعد إعادة تعليق الخلايا في 16/40 16/40 متوسطة 16/40 مُكملة، قم بنقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية إلى آبار لوحة V-السفلية 96 بئرًا.
نقل لوحة إلى حمام مائي محمّى 37 درجة مئوية واسمحوا لها أن تستريح هناك لمدة 10 دقائق. ثم إضافة 60 microliters من المخزن المؤقت ثابت واحد إلى كل بئر من لوحة جديدة 96 جيدا لإعداد لوحة الإصلاح. ضع هذه اللوحة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
نقل عينة التحكم 50 ميكرولتر إلى لوحة ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. اختياريا، إضافة 10 ميكرولترتر لكل ملليلتر المضادة IgM إلى الخلايا لبدء دورة محاكاة الوقت ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل عينة ميكرولتر 50 إلى لوحة الإصلاح في كل نقطة زمنية، خلط كل عينة كما هو مضاف.
بعد إضافة آخر عينة، اترك لوحة الإصلاح في حمام الماء لمدة 10 دقائق. أولاً، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق.
المقبل، وإعداد جديدة 96 بئر V-القاع لوحة مع الكواشف الباركود، عن طريق الأنابيب خمسة microliters من كل كاشف باركودينغ في كل بئر ملء عدد الآبار المطلوبة لطخة كل من العينات. في لوحة الخلية الثابتة، resuspend الخلايا في كل بئر مع 190 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم، نقل كل بئر من الخلايا إلى بئر المقابلة في لوحة الباركودينغ، وخلط كل جيدا جيدا.
اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. بعد هذا، وغسل الخلايا في كل بئر مرتين مع غسل تدفق.
ثم إضافة 190 ميكرولترات من تدفق غسل إلى كل بئر من الخلايا. الجمع بين كل من العينات الباركود في أنبوب واحد 15 ملليلتر ونقل كل عنصر تحكم التعويض إلى أنبوب 1.7 ملليلتر منفصلة. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق.
للبدء، نقل مليلترين من بيرم العازلة ثلاثة إلى أنبوب 15 ملليلتر. تخزين في ناقص 20 درجة مئوية لذلك سيكون الجليد الباردة عند استخدامها. عندما تكون جاهزة، إضافة 1.5 ملليلتر من الجليد الباردة بيرم العازلة إلى أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على السكان الخلايا الباركود قطرة أثناء دوامة لتجنب تكتل الخلايا.
إضافة 100 ميكرولترات من الجليد الباردة بيرم العازلة لكل من الضوابط التعويض بنفس الطريقة. نقل الخلايا فورا إلى ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. عندما تكون جاهزة للبدء في تلطيخ المستضد، قم بإزالة الخلايا من الفريزر ونقلها إلى صندوق من الثلج.
غسل الخلايا ثلاث مرات مع زيادة تدفق الغسيل. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق السكان خلية الباركود في حجم تدفق غسل، وهذا هو أن هناك 25 ميكرولترات من تعليق الخلية في وصمة عار الجسم المضاد فوسفو.
إعادة تعليق ضوابط التعويض في 200 ميكرولترات من تدفق الغسيل. للبدء في إعداد الأجسام المضادة لتلطيخ، إضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة فوسفو محددة، المخفف في تدفق غسل، إلى كل بئر من 96 بئر 96 لوحة V القاع. إضافة 15 ميكرولترات من علامة السطح، المخفف في غسل التدفق و 25 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر لحجم النهائي من 50 ميكرولترات لكل بئر.
دع الخلايا ترتاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك، يغسل الخلايا الملطخة مرتين مع تدفق غسل. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G لمدة خمس دقائق.
تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا في 150 ميكرولترات من تدفق الغسيل. ثم قم بإجراء تحليل تدفق cytometry كما هو موضح في بروتوكول النص. في البروتوكول المقدم ، يتم تنفيذ التكويد ثلاثي الأبعاد من خلال الجمع بين ثلاثة أصباغ الباركودينغ.
ثم يتم إزالة الالتواء من العينات الفردية عن طريق البوابات اللاحقة على كل كاشف اكواف مقابل منطقة تشتت جانبية. ثم تتميز مستويات الفوسفور القاعدي والتحفيز الناجم عن 20 جزيئات إشارة في مجرى مستقبلات الخلية B في الخلايا B من مرضى CLL والضوابط العادية في ظل ظروف مختلفة. وينظر إلى stat3 التيروزين phospho 705 أن تكون إلى حد كبير حتى ينظم.
يتم تحفيز الخلايا مع المضادة لIgM لمدة تصل إلى 30 دقيقة من أجل تحديد الانحرافات إشارة الناجمة عن طريق مسار مستقبلات الخلية B. في حين أن الخلايا CLL من المرضى الذين يعانون من عدم تحويلها عرض IGVH زيادة الحساسية تجاه التحفيز المضادة لIgM, أنها ليست سوى ذات دلالة إحصائية ل AKT الفوسفور سيرين 473. ثم تتعرض الخلايا لPI 3-kinase دلتا المانع idelalisib لاختبار ما إذا كان يمكن عكس إشارة AKT pS473 شاذ.
كما هو مبين هنا، يتم تخفيض مستويات شاذة بشكل كبير على العلاج بطريقة تعتمد على التركيز مما يدل على أن مثبطات كيناز يمكن تطبيقها لتطبيع إشارات شاذة في الخلايا CLL. قبل محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن titrate الكواشف ومضادات، والتحقق من أن علامات السطح المحددة متوافقة مع الكواشف التثبيت و Permeabilization. الخلايا تحتاج إلى أن تكون في تعليق لتحليل الفوسفور، لا يزال يمكن تكييف البروتوكول إلى الخلايا أو الأنسجة الشاذة بعد إجراءات للحصول على تعليق خلية واحدة، مثل trypzination كامل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً للتحليل متوسط إلى عالي الإنتاجية لأحداث فسفرة البروتين على المستوى الخلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي للفسفرة. وتعد هذه الطريقة فعالة في توصيف الانحرافات في إشارات الخلية، وتحديد المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها، وتقييم الديناميكا الدوائية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- نقل الإشارة
خلفية علمية
- يتيح قياس التدفق الخلوي الفسفوري تحليل الإشارات على مستوى الخلية الواحدة.
- يمكن لهذه التقنية معالجة كيفية تأثر مسارات نقل الإشارات بمختلف المحفزات أو العقاقير.
- تعد هذه الطريقة مناسبة للتحليلات ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية.
- تعزز هذه الطريقة القدرة على دراسة الاستجابات الخلوية بمستوى تفصيلي.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول موثوق لتحليل فسفرة البروتين.
- تسهيل تحديد المؤشرات الحيوية في التأشير الخلوي.
- تقييم الديناميكا الدوائية للعلاجات المختلفة.
الطرق المستخدمة
- يتم إعادة تعليق الخلايا في وسط RPMI 16/40 المدعم.
- تُنقل كمية محددة من معلق الخلايا إلى طبق بـ 96 بئر ذات قاع على شكل حرف V.
- يُحضن الطبق في حمام مائي مسخن مسبقاً عند 37 °C.
- يُضاف محلول التثبيت (Fixed buffer) لتجهيز طبق التثبيت للتحليل.
النتائج الرئيسية
- تتيح هذه الطريقة تحليلاً فعالاً لمسارات التأشير.
- توفر رؤى حول تأثيرات الأدوية على التأشير الخلوي.
- يعزز تحليل الدقة على مستوى الخلية الواحدة من فهم الاستجابات الخلوية.
- يمكن أن تؤدي النتائج إلى تحديد أهداف علاجية محتملة.
الاستنتاجات
- يُعد قياس التدفق الخلوي للبروتينات المفسفرة أداة قيمة لدراسة فسفرة البروتين.
- يتيح هذا البروتوكول إجراء تحليلات عالية الإنتاجية، مما يجعله متاحاً لمختلف التطبيقات البحثية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذه الطريقة لاستكشاف شبكات الإشارات المعقدة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح قياس التدفق الخلوي الفسفوري مع الترميز الشريطي الخلوي الفلوري تحليلاً أحادي الخلية متوسط إلى عالي الإنتاجية لفسفرة البروتين، مما يدعم التحقق من الأهداف واكتشاف المؤشرات الحيوية في مجالي علم الأورام وعلم المناعة. ومن خلال تحديد التغيرات في الإشارات المستحثة بالأدوية بدقة أحادية الخلية، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية وتدعم اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف في التطوير العلاجي. كما أن توافقها مع أجهزة قياس التدفق الخلوي القياسية يسمح بدمجها القابل للتوسع في سير عمل الاكتشاف لاستجواب المسارات والتقييم الديناميكي الدوائي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس ديناميكيات الفسفرة لبروتينات الإشارة الموجودة في المصب من المستقبلات مثل مستقبل الخلايا البائية في الخلايا ذات الصلة بالمرض.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الكشف المتعدد لـ 20 جزيئاً من جزيئات الإشارة في الخلايا الأولية المشتقة من المرضى تحت ظروف التحفيز والتثبيط.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز المحفظة الدوائية من خلال تحديد العقد الشاذة مثل AKT pS473 و STAT3 pY705 التي ترتبط بحساسية الدواء وآليات المقاومة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يتيح التشفير الشريطي الفلوري للخلايا تجميع عينات وظروف متعددة في أنبوب واحد، مما يزيد من الإنتاجية ويقلل من التباين بين التشغيلات في أجهزة قياس التدفق الخلوي القياسية.
- المخرجات الكمية: يولد بيانات بدقة الخلية الواحدة حول مستويات الفسفرة، مما يسمح بتحليل الاستجابة للجرعة لمثبطات الكيناز مثل idelalisib في نماذج CLL.
- إعادة استخدام المنصة: تدعم خطوات التثبيت والنفاذية وتلوين الأجسام المضادة الموحدة التكيف عبر أنواع الخلايا المناعية وأنماط التحفيز لحملات الفرز الطولية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يستخدم خلايا أولية من مرضى CLL لنمذجة الانحرافات في نقل الإشارات، مما يوفر نظامًا ذا صلة سريريًا لتقييم العلاجات الموجهة.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط الاستجابة الدوائية خارج الجسم الحي (ex vivo) باكتشاف المؤشرات الحيوية من خلال ربط انخفاض pS473 بحالة طفرة IGVH، مما يدعم استراتيجيات تصنيف المرضى.
- الحد من المخاطر الميكانيكية: يثبت عكس مسار نقل الإشارات المنحرف عن طريق تثبيط PI3Kδ، مما يؤكد ارتباط الهدف وآلية العمل لمثبطات الكيناز في النماذج قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وتدفق العمليات
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة مراحل الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف، مروراً بتحسين المركبات الرائدة، وصولاً إلى اختبارات الفعالية قبل السريرية، لا سيما في برامج المناعة والأورام التي تركز على معدلات نقل الإشارة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس تغيرات الفسفرة المستحثة بالمنبهات في الخلايا البائية البشرية الأولية، مما يوضح حالات تنشيط المسارات في الظروف الأساسية والظروف المعالجة بالعقاقير.
- الفحص: يتيح تقييماً قابلاً للتكرار ومتعدد الإشارات لتأثيرات المركبات على شبكات التأشير، حيث تسهل عملية الترميز الشريطي المقارنة جنباً إلى جنب بين الجرعات، والنقاط الزمنية، والخلفيات الجينية.
- التحليلات: يوفر قراءات كمية للفسفرة على مستوى الخلية الواحدة، مما يسمح بإجراء مقارنة إحصائية لحالات التأشير عبر الظروف المختلفة، ويدعم تحديد عتبات المؤشرات الحيوية وتصنيف الاستجابة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط الاستجابة للعقار في المختبر (in vitro) بالتحقق من المؤشرات الحيوية خارج الجسم (ex vivo) باستخدام عينات أولية من سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، بما يتماشى مع معايير الانتقال من المرحلة قبل السريرية إلى المرحلة السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تسمح مجموعة الكواشف الموحدة واستراتيجية الترميز الشريطي بإعادة الاستخدام في المشاريع التي تدرس تأشير السيتوكينات، أو تنشيط مستقبلات المستضد، أو آلية عمل العقاقير في مجموعات الخلايا المناعية والخبيثة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال ربط تحفيز المستقبلات بفسفرة المؤثرات النهائية بدقة الخلية الواحدة في عينات الخلايا الأولية غير المتجانسة.
- القيمة التشغيلية: يزيد سير العمل الموحد باستخدام الترميز الشريطي (barcoding) من إنتاجية العينات، ويقلل التباين التقني، ويرفع كفاءة استخدام الأجهزة في منصات قياس التدفق الخلوي الحالية.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تقديم أدلة مبكرة على تعديل الهدف وتثبيط المسار، مما يقلل الاستثمار في المركبات ذات النشاط البيولوجي غير الكافي.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد الأولويات للمركبات الرائدة بناءً على تعديل المخاطر، وذلك استناداً إلى ارتباط الهدف وتطبيع الإشارات في الخلايا البشرية ذات الصلة بالمرض.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي، ومعايرة الأجسام المضادة، والتحقق من صحة الكواشف الخاصة بالفوسفور لضمان خصوصية الإشارة وتقليل الخلفية.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي ذات تكوينات الليزر والكواشف الكافية للوحات العلامات السطحية والفوسفورية المتعددة.
- يستلزم توحيد خطوات التثبيت، والنفاذية، والغسيل بين المستخدمين والمواقع للحفاظ على إمكانية تكرار إشارات الفسفرة.
- يتطلب تحسين تركيزات كواشف الترميز الشريطي (barcoding) لتجنب التداخل الطيفي وضمان فك تشابك العينات بدقة أثناء التحليل.
- يقتصر على الخلايا العالقة؛ وتتطلب العينات المعتمدة على الالتصاق أو عينات الأنسجة تفكيكاً مسبقاً إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام طرق إنزيمية أو ميكانيكية معتمدة.
