والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

ويرد هنا، بروتوكولا لتحليل الإنتاجية متوسطة إلى عالية البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي. والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات بيولوجيا الخلايا وعلم المناعة مثل كيف تتأثر مسارات الإشارة بمحفزات مختلفة أو أدوية مختلفة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لك لأداء خلية واحدة الإشارات التحليل في المتوسطة إلى عالية الأزياء الإنتاجية. بعد إعادة تعليق الخلايا في 16/40 16/40 متوسطة 16/40 مُكملة، قم بنقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية إلى آبار لوحة V-السفلية 96 بئرًا.

نقل لوحة إلى حمام مائي محمّى 37 درجة مئوية واسمحوا لها أن تستريح هناك لمدة 10 دقائق. ثم إضافة 60 microliters من المخزن المؤقت ثابت واحد إلى كل بئر من لوحة جديدة 96 جيدا لإعداد لوحة الإصلاح. ضع هذه اللوحة في حمام الماء 37 درجة مئوية.

نقل عينة التحكم 50 ميكرولتر إلى لوحة ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. اختياريا، إضافة 10 ميكرولترتر لكل ملليلتر المضادة IgM إلى الخلايا لبدء دورة محاكاة الوقت ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل عينة ميكرولتر 50 إلى لوحة الإصلاح في كل نقطة زمنية، خلط كل عينة كما هو مضاف.

بعد إضافة آخر عينة، اترك لوحة الإصلاح في حمام الماء لمدة 10 دقائق. أولاً، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق.

المقبل، وإعداد جديدة 96 بئر V-القاع لوحة مع الكواشف الباركود، عن طريق الأنابيب خمسة microliters من كل كاشف باركودينغ في كل بئر ملء عدد الآبار المطلوبة لطخة كل من العينات. في لوحة الخلية الثابتة، resuspend الخلايا في كل بئر مع 190 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم، نقل كل بئر من الخلايا إلى بئر المقابلة في لوحة الباركودينغ، وخلط كل جيدا جيدا.

اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. بعد هذا، وغسل الخلايا في كل بئر مرتين مع غسل تدفق.

ثم إضافة 190 ميكرولترات من تدفق غسل إلى كل بئر من الخلايا. الجمع بين كل من العينات الباركود في أنبوب واحد 15 ملليلتر ونقل كل عنصر تحكم التعويض إلى أنبوب 1.7 ملليلتر منفصلة. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق.

للبدء، نقل مليلترين من بيرم العازلة ثلاثة إلى أنبوب 15 ملليلتر. تخزين في ناقص 20 درجة مئوية لذلك سيكون الجليد الباردة عند استخدامها. عندما تكون جاهزة، إضافة 1.5 ملليلتر من الجليد الباردة بيرم العازلة إلى أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على السكان الخلايا الباركود قطرة أثناء دوامة لتجنب تكتل الخلايا.

إضافة 100 ميكرولترات من الجليد الباردة بيرم العازلة لكل من الضوابط التعويض بنفس الطريقة. نقل الخلايا فورا إلى ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. عندما تكون جاهزة للبدء في تلطيخ المستضد، قم بإزالة الخلايا من الفريزر ونقلها إلى صندوق من الثلج.

غسل الخلايا ثلاث مرات مع زيادة تدفق الغسيل. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق السكان خلية الباركود في حجم تدفق غسل، وهذا هو أن هناك 25 ميكرولترات من تعليق الخلية في وصمة عار الجسم المضاد فوسفو.

إعادة تعليق ضوابط التعويض في 200 ميكرولترات من تدفق الغسيل. للبدء في إعداد الأجسام المضادة لتلطيخ، إضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة فوسفو محددة، المخفف في تدفق غسل، إلى كل بئر من 96 بئر 96 لوحة V القاع. إضافة 15 ميكرولترات من علامة السطح، المخفف في غسل التدفق و 25 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر لحجم النهائي من 50 ميكرولترات لكل بئر.

دع الخلايا ترتاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك، يغسل الخلايا الملطخة مرتين مع تدفق غسل. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G لمدة خمس دقائق.

تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا في 150 ميكرولترات من تدفق الغسيل. ثم قم بإجراء تحليل تدفق cytometry كما هو موضح في بروتوكول النص. في البروتوكول المقدم ، يتم تنفيذ التكويد ثلاثي الأبعاد من خلال الجمع بين ثلاثة أصباغ الباركودينغ.

ثم يتم إزالة الالتواء من العينات الفردية عن طريق البوابات اللاحقة على كل كاشف اكواف مقابل منطقة تشتت جانبية. ثم تتميز مستويات الفوسفور القاعدي والتحفيز الناجم عن 20 جزيئات إشارة في مجرى مستقبلات الخلية B في الخلايا B من مرضى CLL والضوابط العادية في ظل ظروف مختلفة. وينظر إلى stat3 التيروزين phospho 705 أن تكون إلى حد كبير حتى ينظم.

يتم تحفيز الخلايا مع المضادة لIgM لمدة تصل إلى 30 دقيقة من أجل تحديد الانحرافات إشارة الناجمة عن طريق مسار مستقبلات الخلية B. في حين أن الخلايا CLL من المرضى الذين يعانون من عدم تحويلها عرض IGVH زيادة الحساسية تجاه التحفيز المضادة لIgM, أنها ليست سوى ذات دلالة إحصائية ل AKT الفوسفور سيرين 473. ثم تتعرض الخلايا لPI 3-kinase دلتا المانع idelalisib لاختبار ما إذا كان يمكن عكس إشارة AKT pS473 شاذ.

كما هو مبين هنا، يتم تخفيض مستويات شاذة بشكل كبير على العلاج بطريقة تعتمد على التركيز مما يدل على أن مثبطات كيناز يمكن تطبيقها لتطبيع إشارات شاذة في الخلايا CLL. قبل محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن titrate الكواشف ومضادات، والتحقق من أن علامات السطح المحددة متوافقة مع الكواشف التثبيت و Permeabilization. الخلايا تحتاج إلى أن تكون في تعليق لتحليل الفوسفور، لا يزال يمكن تكييف البروتوكول إلى الخلايا أو الأنسجة الشاذة بعد إجراءات للحصول على تعليق خلية واحدة، مثل trypzination كامل.