تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan
سبتمبر 7, 2019
يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.
يمكن للخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية تجديد الذات والتمييز في أنواع الخلايا العصبية المختلفة، ودعم تطوير الجهاز العصبي وتقديم مورد للطب التجديدي. هذه الخلايا غير متجانسة، ونحن بحاجة إلى معرفة علامات سطح الخلايا المحددة من أجل الحصول على مجموعات الخلايا النقية وفهم وظائفها. يوفر بروتوكولنا تقنية بسيطة وحساسة وفعالة لتحليل البروتينات الغشاء للخلايا العصبية الأولية والخلايا السلف، مما يساعد على تحديد علامات سطح جديدة لهذه الخلايا.
الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي قدرته على تحليل البروتيم السطحي للخلايا العصبية الأولية والخلايا السلفية مع تحسين الحساسية وخصوصيتها. ويتحقق ذلك من خلال توسيعها من خلال ثقافة المشتركة داخل الخلايا البطانية في المختبر وارتفاع tractin المسالك في مسار التخليل المضمن MAPK-ERK لتسمية المسام السطح. مع المسام الموالية التعديلات على توسيع الخلايا الجذعية في المختبر، بروتوكول لدينا يمكن بسهولة أن تطبق لتحديد علامات سطح أنواع الخلايا الجذعية الأخرى.
لإعداد الخلايا البطانية، إعادة تعليق بيليه خلية BEN3 من طبق بيتري 10 سنتيمتر في التقاء 90٪ مع تسعة ملليلتر من متوسطة خلية BEN3. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية في واحد إدراج دعم نفاذية. إضافة اثنين ملليلتر آخر من BEN3 المتوسطة في بئر في الغرفة السفلية من المصفوفة.
مواصلة ثقافة الخلايا ليوم واحد في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يوم واحد من طلاء الخلايا في إدراج، pirate بلطف المتوسطة، أولا من الغرفة السفلية ومن ثم من إدراج. غسل وجه إدراج ثلاث مرات مع DMEM قبل الدافئة.
اغسل السطح الخارجي للدرجات عن طريق الشطف مع DMEM مسبقًا. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من قبل الدفء AM في إدراج واحد. قم بنقل المستحضرات إلى الآبار باستخدام الخلايا القشرية الأولية.
احتضان الثقافة المشتركة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة. قم بحل Ac4ManAz في DMSO لتحقيق تركيز مخزون 200 ملليمولار. استرداد لوحة الثقافة المشتركة العصبية endothelial من الحاضنة.
إضافة ميكرولتر واحد من الأسهم Ac4ManAz إلى كل غرفة أسفل و 0.5 ميكرولترات لكل إدراج في ثقافة المشاركة. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. في حين أن الخلايا هي زراعة إضافة 100 microliters من جمهورية مقدونيا لكل إدراج و 200 microliters من جمهورية مقدونيا في غرفة أسفل لإعادة تغذية الخلايا البطانية والثنائية كل يومين.
أولا إزالة إدراج من لوحات الثقافة المشتركة وpirate المتوسطة الثقافة من الجزء السفلي من الآبار. بعد غسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مسخ مسبقا. التعرق برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من ما قبل مبردة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لكل بئر.
إصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة. pirate برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من البيوتين الطازجة المعدة مترافق العازلة 1 في كل بئر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد هذا، التعرق في العازلة رد فعل من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من مخزن البقعة إلى كل بئر من الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
المقبل، الطامح العازلة تلطيخ من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة. إضافة ملليلتر واحد من العازلة حظر إلى كل بئر من الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل بئر.
احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من الآبار. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني مبرد مسبقًا.
استلهم برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، الطامح الحل من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة.
أولا، إعداد BTTAA كبريتات كوبريك مجمع 2، كامل البروتين إعادة تعليق العازلة، وغسل البروتين العازلة 1، وغسل البروتين العازلة 2 والبروتين الغسيل العازلة 3 كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. التعرق المتوسط الثقافة من الآبار السفلية وغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة.
التعرق برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة ريبا ما قبل المبردة إلى كل بئر. احتضان لوحات على الجليد لمدة خمس دقائق ثم جمع البروتين تحلل في أنابيب 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 12000 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه حطام الخلية.
نقل عظمى إلى أنابيب 1.5 ملليلتر جديدة وتحديد تركيز البروتين مع مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ثم، ضبط تركيز البروتين إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر. إضافة 100 ميكرومولار ألكايد البيوتين، 2.5 ملليمولار الصوديوم أسكوربات و 1XBTTAA كبريتات كوبريك مجمع 2 إلى ملليلتر واحد من تحلل البروتين.
اخلطي المحلّل جيداً وحضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، نقل حل التفاعل إلى 20 ملليلتر من الميثانول المبردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تخلط جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في ناقص 30 درجة مئوية لتسريع البروتينات.
أجهزة الطرد المركزي في 4500 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ل بيليه يترسب البروتين. غسل بيليه مرتين باستخدام 20 ملليلتر من الميثانول قبل المبردة في غسل. المقبل, الطامح من عظمى وإعادة تعليق بيليه البروتين في أربعة ملليلتر من العازلة إعادة تعليق.
نقل البروتين إعادة تعليق إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. غسل 50 ميكرولترات من الخرز streptavidin ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الخرز غسلها إلى البروتين إعادة تعليق واحتضان الحل في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على دوار عمودي بسرعة دوران 20 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، قم بغسل الخرز بشكل متسلسل مع كل عازل غسيل يظهر هنا. إعادة تعليق الخرز غسلها مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 20 ميكرولترات من 2X تخزين مؤقت لتحميل البروتين وعلاج في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم معالجة عينات البروتين مع SDS-PAGE وصمة عار لهم مع Coomassie الأزرق الرائعة كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة يتم توسيع NSPCs الجنينية الأولية وتسمية الأيضية في المختبر. يؤدي الثقافة المشتركة البطانية الناجحة إلى تشكيل NSPCs لاستنساخ مستنسخات كبيرة تشبه الورقة.
المناعة مع الأجسام المضادة يكشف أن في استنساخ, معظم الخلايا هي NSPCs NSPCs إيجابية نستين, في حين أن عدد قليل جدا من بيتا tubulin 3 الخلايا العصبية الإيجابية. في المقابل، فإن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية نستين وبيتا tubulin 3 الخلايا العصبية الإيجابية في استنساخ تشكلت في نظام غير المشتركة الثقافة هي نفسها تقريبا. المراسل الكيميائي Ac4ManAz هو تمثيلي استقلابي ويمكن دمجه في مسار sialylation البروتين الجوهري.
يتم استخدام تركيز وضع العلامات المحسنة لـ 100 من المغذيات الدقيقة لـ NSPCs الأولية، ويشير التقييم الجمعي لموت الخلايا المشار إليه في مورفولوجيا الخلايا والنوى إلى أن تركيز التسميات هذا لا يسبب تأثيرات واضحة للسمية للخلايا وقادرة على تسمية NSPCs بكفاءة. ولا تتأثر المورفولوجيا المنعزلة، وإمكانية التجديد الذاتي والتمايز التي تتمتع بها المراكز غير الناحية لديها في كل من نظام الثقافة المشتركة البطانية ونظام غير الثقافة المشتركة. عينات البروتين التي أعدت من Ac4ManAz المسمى الثقافة من قبل conjugation البيوتين وتنقية streptavidin الخرز تظهر قوية Coomassie الأزرق الرائعة إشارة التلوين في المواد الهلامية SDS-PAGE.
وفي الوقت نفسه لم تكن هناك سوى خلفية تلطيخ وإشارات ملزمة غير محددة في الممرات المحملة بعينات البروتين من مجموعة التحكم في DMSO. يشير هذا أيضاً إلى وضع العلامات الفعالة لـ NSPCs بواسطة Ac4ManAz. عند محاولة هذا البروتوكول، ينبغي إعداد جميع الحلول اللازمة للتفاعل الخلوي الحيوي حديثا وينبغي السيطرة على وقت رد الفعل بإحكام لمنع أكثر من رد فعل غير كاف.
بعد بروتوكول لدينا هيكل الخلايا الجذعية العصبية الغنية الجلكان السطحي يمكن تحليلها. لدينا بروتوكول الجذعية العصبية والخلايا السلف المخصبة السطح البروتينات ليس فقط ارتفاع علامات ولكن أيضا تلعب وظائف هامة على استراتيجية تنقية نمط أثار والتوضيح من الدوائر إشارة جامدة لهذه الخلية السكان.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً يستخدم نظامًا مشتركًا للزراعة في المختبر للخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة لتوسيع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة الأولية. يتضمن النهج تمييز بروتينات الغليكوزيدات السياليه السطحية من خلال الدمج الأيضي مع مجموعات وظيفية حيوية، مما يسهل التصوير وتحليل الطيف الكتلي لتحديد علامات سطح الخلية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- تمتلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة قدرات التجديد الذاتي والتمايز.
- فهم علامات السطح أمر بالغ الأهمية لتنقية مجموعات الخلايا.
- يوفر البروتوكول طريقة حساسة وفعالة لتحليل بروتينات الغشاء.
- يمكن أن يؤدي تحديد علامات سطح جديدة إلى تعزيز فهمنا لوظائف الخلايا.
هدف الدراسة
- للتحقيق في علامات السطح الخاصة بالخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة الأولية.
- لتعزيز تحليل بروتين السطح بحساسية وخصوصية محسنتين.
- لتطوير طريقة يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من الخلايا الجذعية.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الدراسة نظامًا مشتركًا للزراعة في المختبر للخلايا العصبية البطانية.
- تتم توسيع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة الأولية من خلال الزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية.
- يتم تمييز علامات السطح من خلال الدمج الأيضي للجليكوزيل السالي.
- يتم إجراء زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون على مدار عدة أيام.
- يتم تحديد الخطوات التفصيلية لتحضير الخلايا البطانية وتحليل الخلايا العصبية.
النتائج الرئيسية
- يسمح البروتوكول بالتحليل المباشر لبروتين سطح الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة.
- يتم تحقيق تحسينات في الحساسية والخصوصية لتحديد علامات السطح.
- يتم تمييز التطبيقات المحتملة لتحديد علامات سطح أنواع أخرى من الخلايا الجذعية.
الاستنتاجات
- تُمكّن الدراسة من التعرف الفعال على علامات سطح الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السليفة.
- على الرغم من عدم إشراك أي تحليل متعدد الكائنات، تدعم الطريقة التطور في الطب التجديدي.
- تساهم هذه الأبحاث في فهم آليات الخلايا العصبية والتفاعلات الخلوية داخل الجهاز العصبي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Identifying specific cell surface markers for primary neural stem and progenitor cells (NSPCs) addresses a critical bottleneck in regenerative medicine and cell therapy development. The lack of defined surface markers hinders purification, functional characterization, and scalable manufacturing of NSPC-based therapeutics. This protocol enables sensitive detection of low-abundance membrane proteins, supporting target de-risking and assay readiness for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying NSPC-enriched surface proteins for target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through comparative sialoglycoproteome analysis between self-renewing and differentiating states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing mechanistic insight into NSPC identity and function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining surface marker panels.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through metabolic labeling and biotin-streptavidin capture.
- Scalability: Supports platform reuse across stem cell types with appropriate modifications to the labeling workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking surface marker expression to NSPC self-renewal and differentiation potential.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent phenotypic readouts.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in cell identity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling biomarker-aligned progression to preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating NSPC-specific surface proteomes.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible outputs compatible with mass spectrometry and imaging.
- Analytics: Generates comparative protein expression data that enable condition-to-condition benchmarking and target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating surface markers in expanded, functional NSPC populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for surface marker discovery across multiple stem cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives in marker identification.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined metabolic labeling and purification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of cellular therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through objective, data-driven surface marker selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural cell culture, metabolic labeling, and bioorthogonal chemistry.
- Depends on instrumentation for cell culture, protein lysis, biotinylation, streptavidin purification, and mass spectrometry.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture conditions, labeling duration, and reagent preparation.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-neural stem cell systems.
- Includes practical limitations such as the need for fresh reagent preparation and strict reaction timing to avoid incomplete labeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Preparation of Mouse Endothelial Culture in Permeable Support Inserts
1:55
Set-up of Neural-endothelial Co-culture and Ac4ManNAz Labeling System
3:25
Immunofluorescent Staining of Sialoglycoproteins in Expanded Primary NSPCs and Differentiated Neurons
5:25
Purification of Sialoglycoproteins from Expanded Primary NSPCs and Differentiated Neurons
8:45
Results: Identifying Cell Surface Markers by Metabolic Labeling of Sialoglycan
10:47
Conclusion
