تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.

يمكن للخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية تجديد الذات والتمييز في أنواع الخلايا العصبية المختلفة، ودعم تطوير الجهاز العصبي وتقديم مورد للطب التجديدي. هذه الخلايا غير متجانسة، ونحن بحاجة إلى معرفة علامات سطح الخلايا المحددة من أجل الحصول على مجموعات الخلايا النقية وفهم وظائفها. يوفر بروتوكولنا تقنية بسيطة وحساسة وفعالة لتحليل البروتينات الغشاء للخلايا العصبية الأولية والخلايا السلف، مما يساعد على تحديد علامات سطح جديدة لهذه الخلايا.

الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي قدرته على تحليل البروتيم السطحي للخلايا العصبية الأولية والخلايا السلفية مع تحسين الحساسية وخصوصيتها. ويتحقق ذلك من خلال توسيعها من خلال ثقافة المشتركة داخل الخلايا البطانية في المختبر وارتفاع tractin المسالك في مسار التخليل المضمن MAPK-ERK لتسمية المسام السطح. مع المسام الموالية التعديلات على توسيع الخلايا الجذعية في المختبر، بروتوكول لدينا يمكن بسهولة أن تطبق لتحديد علامات سطح أنواع الخلايا الجذعية الأخرى.

لإعداد الخلايا البطانية، إعادة تعليق بيليه خلية BEN3 من طبق بيتري 10 سنتيمتر في التقاء 90٪ مع تسعة ملليلتر من متوسطة خلية BEN3. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية في واحد إدراج دعم نفاذية. إضافة اثنين ملليلتر آخر من BEN3 المتوسطة في بئر في الغرفة السفلية من المصفوفة.

مواصلة ثقافة الخلايا ليوم واحد في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يوم واحد من طلاء الخلايا في إدراج، pirate بلطف المتوسطة، أولا من الغرفة السفلية ومن ثم من إدراج. غسل وجه إدراج ثلاث مرات مع DMEM قبل الدافئة.

اغسل السطح الخارجي للدرجات عن طريق الشطف مع DMEM مسبقًا. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من قبل الدفء AM في إدراج واحد. قم بنقل المستحضرات إلى الآبار باستخدام الخلايا القشرية الأولية.

احتضان الثقافة المشتركة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة. قم بحل Ac4ManAz في DMSO لتحقيق تركيز مخزون 200 ملليمولار. استرداد لوحة الثقافة المشتركة العصبية endothelial من الحاضنة.

إضافة ميكرولتر واحد من الأسهم Ac4ManAz إلى كل غرفة أسفل و 0.5 ميكرولترات لكل إدراج في ثقافة المشاركة. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. في حين أن الخلايا هي زراعة إضافة 100 microliters من جمهورية مقدونيا لكل إدراج و 200 microliters من جمهورية مقدونيا في غرفة أسفل لإعادة تغذية الخلايا البطانية والثنائية كل يومين.

أولا إزالة إدراج من لوحات الثقافة المشتركة وpirate المتوسطة الثقافة من الجزء السفلي من الآبار. بعد غسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مسخ مسبقا. التعرق برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من ما قبل مبردة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لكل بئر.

إصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة. pirate برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من البيوتين الطازجة المعدة مترافق العازلة 1 في كل بئر.

احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد هذا، التعرق في العازلة رد فعل من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من مخزن البقعة إلى كل بئر من الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

المقبل، الطامح العازلة تلطيخ من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة. إضافة ملليلتر واحد من العازلة حظر إلى كل بئر من الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل بئر.

احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من الآبار. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني مبرد مسبقًا.

استلهم برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، الطامح الحل من الآبار وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة.

أولا، إعداد BTTAA كبريتات كوبريك مجمع 2، كامل البروتين إعادة تعليق العازلة، وغسل البروتين العازلة 1، وغسل البروتين العازلة 2 والبروتين الغسيل العازلة 3 كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. التعرق المتوسط الثقافة من الآبار السفلية وغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة.

التعرق برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة ريبا ما قبل المبردة إلى كل بئر. احتضان لوحات على الجليد لمدة خمس دقائق ثم جمع البروتين تحلل في أنابيب 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 12000 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه حطام الخلية.

نقل عظمى إلى أنابيب 1.5 ملليلتر جديدة وتحديد تركيز البروتين مع مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ثم، ضبط تركيز البروتين إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر. إضافة 100 ميكرومولار ألكايد البيوتين، 2.5 ملليمولار الصوديوم أسكوربات و 1XBTTAA كبريتات كوبريك مجمع 2 إلى ملليلتر واحد من تحلل البروتين.

اخلطي المحلّل جيداً وحضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، نقل حل التفاعل إلى 20 ملليلتر من الميثانول المبردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تخلط جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في ناقص 30 درجة مئوية لتسريع البروتينات.

أجهزة الطرد المركزي في 4500 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ل بيليه يترسب البروتين. غسل بيليه مرتين باستخدام 20 ملليلتر من الميثانول قبل المبردة في غسل. المقبل, الطامح من عظمى وإعادة تعليق بيليه البروتين في أربعة ملليلتر من العازلة إعادة تعليق.

نقل البروتين إعادة تعليق إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. غسل 50 ميكرولترات من الخرز streptavidin ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الخرز غسلها إلى البروتين إعادة تعليق واحتضان الحل في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على دوار عمودي بسرعة دوران 20 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك، قم بغسل الخرز بشكل متسلسل مع كل عازل غسيل يظهر هنا. إعادة تعليق الخرز غسلها مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 20 ميكرولترات من 2X تخزين مؤقت لتحميل البروتين وعلاج في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم معالجة عينات البروتين مع SDS-PAGE وصمة عار لهم مع Coomassie الأزرق الرائعة كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة يتم توسيع NSPCs الجنينية الأولية وتسمية الأيضية في المختبر. يؤدي الثقافة المشتركة البطانية الناجحة إلى تشكيل NSPCs لاستنساخ مستنسخات كبيرة تشبه الورقة.

المناعة مع الأجسام المضادة يكشف أن في استنساخ, معظم الخلايا هي NSPCs NSPCs إيجابية نستين, في حين أن عدد قليل جدا من بيتا tubulin 3 الخلايا العصبية الإيجابية. في المقابل، فإن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية نستين وبيتا tubulin 3 الخلايا العصبية الإيجابية في استنساخ تشكلت في نظام غير المشتركة الثقافة هي نفسها تقريبا. المراسل الكيميائي Ac4ManAz هو تمثيلي استقلابي ويمكن دمجه في مسار sialylation البروتين الجوهري.

يتم استخدام تركيز وضع العلامات المحسنة لـ 100 من المغذيات الدقيقة لـ NSPCs الأولية، ويشير التقييم الجمعي لموت الخلايا المشار إليه في مورفولوجيا الخلايا والنوى إلى أن تركيز التسميات هذا لا يسبب تأثيرات واضحة للسمية للخلايا وقادرة على تسمية NSPCs بكفاءة. ولا تتأثر المورفولوجيا المنعزلة، وإمكانية التجديد الذاتي والتمايز التي تتمتع بها المراكز غير الناحية لديها في كل من نظام الثقافة المشتركة البطانية ونظام غير الثقافة المشتركة. عينات البروتين التي أعدت من Ac4ManAz المسمى الثقافة من قبل conjugation البيوتين وتنقية streptavidin الخرز تظهر قوية Coomassie الأزرق الرائعة إشارة التلوين في المواد الهلامية SDS-PAGE.

وفي الوقت نفسه لم تكن هناك سوى خلفية تلطيخ وإشارات ملزمة غير محددة في الممرات المحملة بعينات البروتين من مجموعة التحكم في DMSO. يشير هذا أيضاً إلى وضع العلامات الفعالة لـ NSPCs بواسطة Ac4ManAz. عند محاولة هذا البروتوكول، ينبغي إعداد جميع الحلول اللازمة للتفاعل الخلوي الحيوي حديثا وينبغي السيطرة على وقت رد الفعل بإحكام لمنع أكثر من رد فعل غير كاف.

بعد بروتوكول لدينا هيكل الخلايا الجذعية العصبية الغنية الجلكان السطحي يمكن تحليلها. لدينا بروتوكول الجذعية العصبية والخلايا السلف المخصبة السطح البروتينات ليس فقط ارتفاع علامات ولكن أيضا تلعب وظائف هامة على استراتيجية تنقية نمط أثار والتوضيح من الدوائر إشارة جامدة لهذه الخلية السكان.