جمع بيانات البلورات النيوترونية ومعالجتها لنمذجة ذرات الهيدروجين في هياكل البروتين
December 1st, 2020
البلورات البروتين النيوتروني هو تقنية الهيكلية التي تسمح توطين ذرات الهيدروجين، وبالتالي توفير تفاصيل ميكانيكية هامة من وظيفة البروتين. نقدم هنا سير العمل لتركيب بلورة البروتين، وجمع بيانات الحيود النيوتروني، وصقل الهيكل وتحليل خرائط كثافة طول النيوترون المتناثرة.
علم البلورات النيوترونية هو تقنية هيكلية لتحديد مواضع ذرات الهيدروجين في الجزيئات البيولوجية الكبيرة. تكشف الهياكل النيوترونية عن حالات البروتونات وتوجهات جزيئات الماء لتوضيح آليات التفاعل وتفاعلات الربط. على عكس حيود الأشعة السينية ، يتميز حيود النيوترونات بكونه تقنية غير مدمرة.
يمكن دراسة البروتينات ذات المجموعات الحساسة للضوء أو أجهزة الاستشعار المعدنية دون المعاناة من تلف الإشعاع. لإجراء علم البلورات البروتين النيوتروني ، يتم تركيب بلورات البروتين الهشة الكبيرة في الشعيرات الدموية الكوارتز لجمع بيانات درجة حرارة الغرفة. لا يتم إجراء تركيب الشعيرات الدموية الكريستالية بشكل روتيني ، مما يجعل عرض هذه التقنية مفيدا.
لحصاد البلورات ، افتح صندوق الساندويتش المغلق الذي يحتوي على بلورات البروتين في صفيحة زجاجية كبيرة الحجم من السيليكون من تسعة آبار واستخدم ماصة دقيقة لنقل 10 إلى 20 ميكرولترا من محلول خزان التبلور إلى شريحة زجاجية. قم بتقييم البلورات بالمجهر. استخدم حلقة ميكرولوب ذات حجم مناسب لحصاد بلورة ووضع البلورة في قطرة محلول الخزان.
للتركيب البلوري ، خذ شعريا من الكوارتز بقطر ملليمترين بطول 50 ملم ، وقم بسحب مخزن مؤقت للخزان بماصة واملأ أحد طرفي الشعيرات الدموية بمخزن مؤقت للخزان. استخدم حلقة تثبيت لوضع البلورة برفق في المخزن المؤقت للخزان داخل الشعيرات الدموية الكوارتز. اضغط على الأنبوب لتحريك المخزن المؤقت للخزان والكريستال لأسفل الشعيرات الدموية واستخدم ماصة رفيعة طويلة لشفط المحلول من حول البلورة.
استخدم فتيلا ورقيا رفيعا لتجفيف البلورة بعناية وتجفيف الجدران الشعرية وإضافة 20 إلى 50 ميكرولترا من محلول العازلة المنزوع إلى نهاية الشعيرات الدموية. استخدم عصا حرارية لإذابة جزء من شمع العسل وأدخل الشعيرات الدموية برفق في شمع العسل المذاب حتى يتشكل ختم محكم الإغلاق. استبدل المخزن المؤقت الملقب ب 20 إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج الملقب في الأيام الثانية والسادسة والعاشرة بعد تركيب البلورة وأعد إغلاق الشعيرات الدموية بشمع العسل المذاب الطازج بعد كل تبادل بخار كما هو موضح.
بعد أسبوعين على الأقل من تبادل البخار ، استخدم المعجون لتأمين الشعيرات الدموية الكوارتز على عصا عينة مقياس الزوايا لمقياس حيود النيوترونات IMAGINE التي تم تثبيتها في مرحلة عينة الأداة وخفض العينة والالتصاق بالحزمة النيوترونية ومنطقة الكاشف. افتح برنامج الحصول على البيانات على كمبيوتر التحكم Beamline وانقر فوق علامة تبويب الإعداد لإعداد استراتيجية جمع البيانات وأدخل معلمات التجربة بما في ذلك اسم الأداة واسم الصور المراد جمعها. انقر فوق علامة التبويب تجميع وأدخل معلمات جمع البيانات بما في ذلك وقت التعرض وعدد الإطارات المراد جمعها.
ضمن واجهة مستخدم رسومات البصريات ، انقر فوق 2.78 للحد الأدنى ل lambda و 4.5 للحد الأقصى لامدا لتعيين شبه النطاق لجمع البيانات. انقر فوق بدء الفحص لبدء جمع البيانات. بعد جمع بيانات النيوترونات ، اجمع مجموعة بيانات الأشعة السينية المقابلة على نفس البلورة عند نفس درجة الحرارة.
قبل جمع بيانات التبريد ، قم بإزالة محلول الخزان من صندوق الساندويتش واملأ صندوق الساندويتش بمحلول عازلة للخزان المنزوع ، واتركه يتوازن لمدة أسبوع واحد وكرر ثلاث مرات. بعد ثلاث جولات أخرى من تبادل محلول الخزان ، قم بحصاد البلورة باستخدام حلقة دقيقة واغمر البلورة في محلول تجميد لمدة ساعتين قبل تركيب البلورة في حلقة ميكروبية متصلة بحامل بلوري بالتبريد. اغمر الكريستال المركب وحامل التبريد في النيتروجين السائل.
عندما يتم تجميد البلورة ، قم بتركيب البلورة على مرحلة عينة مقياس حيود النيوترونات الجزيئية المزودة بتيار تبريد. تحقق من تحميل البلورة وتوسيطها لجمع البيانات، وأكمل معلومات الاقتراح، وانقر فوق أيقونة المجلد لتحميل جدول استراتيجية جمع البيانات، ثم انقر فوق إرسال لبدء جمع البيانات. ستصبح النيوترونات المنحرفة مرئية في الوقت الفعلي حيث يتم اكتشافها بواسطة كاشفات وقت الرحلة MaNDi.
لتحسين بيانات الأشعة السينية والنيوترونية المشتركة ، افتح أولا CCP4 وحدد تحويل لتعديل تمديد برنامج MTZ لمطابقة علامات البيانات الحرة R لبيانات النيوترونات مع تلك الموجودة في بيانات الأشعة السينية. استيراد ملف انعكاس البيانات النيوترونية بتنسيق MTZ. حدد استيراد بيانات R المجانية من ملف MTZ آخر واستورد ملف MTZ بالأشعة السينية.
قم بتسمية ملف MTZ المطابق الجديد وانقر فوق تشغيل. بعد ذلك ، افتح حزمة برامج Phoenix وتحت التحسين ، انقر فوق جاهز للمجموعة. قم بتحميل ملف إحداثيات البروتين ، وحدد لإضافة الهيدروجين إلى النمذجة في حالة غيابه ، وحدد HD في المواقع القابلة للتبديل ، H في مكان آخر من القائمة المنسدلة.
حدد إضافة الديوتيريوم إلى جزيئات المذيبات وانقر فوق تشغيل للبدء. لتحسين الهيكل ، في علامة تبويب التحسين ، افتح طائر الفينيق. صقل البرنامج لإعداد التحسين باستخدام كل من بيانات الأشعة السينية والنيوترونات.
في علامة التبويب "تكوين"، أدخل ملف PDB من بنية الأشعة السينية التي تم حلها. قم بتحميل ملف MTZ من البيانات النيوتروناتية. قم بتعيين بيانات ملف MTZ كبيانات نيوترونية خالية من النيوترونات.
قم بتحميل ملف MTZ من بيانات الأشعة السينية وقم بتعيينه كبيانات الأشعة السينية والأشعة السينية المجانية. ضمن إعدادات التحسين ، تأكد من تحديد استراتيجية التحسين القياسية وقم بزيادة عدد الدورات إلى خمسة. حدد جميع المعلمات المتقدمة والهيدروجينات.
قم بتغيير نموذج تكرير الهيدروجين إلى فرد وقم بإيقاف تشغيل القوة التي تركب ADP ، ثم ابحث عن الطاقة النووية. حدد استخدام المسافات النووية من X-HD. انقر فوق تشغيل لبدء التنقيح.
لبناء النموذج في فينيكس ، انقر فوق فتح في Coot. في Coot ، تصور كثافة الإلكترون بالأشعة السينية وخرائط كثافة طول تشتت النيوترونات. حدد مدير العرض واحذف خريطة كثافة طول التشتت النيوتروني 2FOFC النيوتروني.
حدد فتح MTZ وحدد فتح MTZ وافتح ملف mtz للبيانات النيوتروناتية. لكل من خيارات السعات والمراحل، حدد بيانات no_fill_neutron من القوائم المنسدلة لفتح خرائط كثافة طول تشتت النيوترونات غير المعبأة. قم بإجراء فحص بصري للمخلفات لتحديد ما إذا كان النموذج يناسب البيانات وتحليل قمم خريطة كثافة الفرق للمواقع القابلة للتبادل بين الهيدروجين وديوتيريوم لتحديد الاتجاه الصحيح والإشغال.
أعد توجيه جزيئات الماء وفقا لخرائط SLD النيوترونية وتفاعلات الرابطة الهيدروجينية. اضبط حالة البروتونات واتجاه بقايا البروتين للمواقع القابلة للتبادل بين الهيدروجين وديوتيريوم وفقا لخرائط SLD النيوتروناتية. قم بإجراء جولات أخرى من بناء النماذج التفاعلية وتحسينها للحصول على هيكل كامل.
تبلغبلورات البروتين المهدرجة المزروعة في المخزن المؤقت المائي حوالي 1,000 × 900 ميكرون. يمكن تركيب البلورات في الشعيرات الدموية الكوارتز لتبادل البخار مع مخزن مؤقت قائم على أكسيد الديوتيريوم لمدة ثلاثة أسابيع قبل جمع بيانات حيود النيوترونات. تم جمع بيانات حيود النيوترونات لعدة أيام بدقة 2.30 أنجستروم وتم جمع مجموعة بيانات حيود الأشعة السينية على نفس البلورة.
توفرالقمم في FO مطروحا منه FC ، وطول تشتت النيوترونات ، وخرائط الكثافة معلومات قيمة عن اتجاه المخلفات مثل الهليون والقمم الموجبة في FO مطروحا منه FC ، وكثافة طول تشتت النيوترونات ، كما أن الخرائط المحذوفة مفيدة للغاية في تحديد حالات البروتونات للمخلفات ذات المجموعات القابلة للمعايرة مثل الهيستيدين. تشير تراكبات الخرائط لخرائط كثافة طول تشتت الإلكترون والنيوترون لجزيئات الماء إلى أنه بينما يمكن استنتاج تفاعلات الرابطة الهيدروجينية من بيانات الأشعة السينية ، توفر النيوترونات معلومات واضحة حول مواقع هذه الروابط الهيدروجينية يمكن استخدام خرائط كثافة طول تشتت النيوترونات المحذوفة لتحديد اتجاهات المجموعة الوظيفية للسلسلة الجانبية للهيدروجين والديوتيريوم.
تظهرخرائط كثافة طول تشتت النيوترونات التي ترتبط فيها ذرات الهيدروجين غير القابلة للتبادل بالكربون غير مكتملة عند مقارنتها بنظيراتها في خريطة كثافة الإلكترون بسبب إلغاء الكثافة. لذلك يفضل إجراء تحسين مشترك لعينة مع كل من بيانات الأشعة السينية والنيوترونية حيث يمكن استخدام بيانات الأشعة السينية لتحديد موضع العمود الفقري للبروتين. يتطلب علم البلورات للبروتين النيوتروني بلورات كبيرة.
يجب توخي الحذر أثناء التعامل مع البلورات وتركيبها لتجنب إتلاف البلورات التي يمكن أن تتشقق بسهولة ، مما يعرض جودة البيانات للخطر. يوفر علم بلورات البروتين النيوتروني نظرة ثاقبة لآلية تفاعل البروتين ، مما قد يكشف عن المخلفات ذات الصلة تحفيزيا أو جزيئات الماء التي يمكن فحص دورها بشكل أكبر عن طريق الحركية أو الطفرات أو التحليل الطيفي.
النظرة العامة
تعد دراسة بلورات البروتين بالنيوترون تقنية هيكلية تتيح تحديد مواقع ذرات الهيدروجين في البروتينات، مما يوفر رؤى حاسمة حول وظائفها. يوضح هذا المقال سير عمل تثبيت بلورات البروتين، وجمع بيانات تشتت النيوترون، وتحليل الخرائط الناتجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا الهيكلية
- بلورات النيوترون
- تحليل البروتين
الخلفية
- تساعد دراسة بلورات النيوترون في تحديد مواقع ذرات الهيدروجين في الجزيئات الكبيرة الحيوية.
- تكشف هذه التقنية عن حالات البروتون واتجاهات جزيئات الماء.
- إنها تقنية غير مدمرة، مما يجعلها مناسبة للبروتينات الحساسة.
- تقنيات تثبيت البلورات لا تُجرى بشكل روتيني، مما يجعل هذه التجربة قيمة.
هدف الدراسة
- لتوضيح عملية دراسة بلورات البروتين بالنيوترون.
- لتوفير سير عمل مفصل لجمع البيانات وتحليلها.
- لتسليط الضوء على مزايا تشتت النيوترون مقارنة بتشتت الأشعة السينية.
الطرق المستخدمة
- تثبيت بلورات البروتين في أنابيب الكوارتز.
- جمع بيانات تشتت النيوترون باستخدام جهاز قوس.
- إجراء تحسين البيانات مع كل من مجموعات بيانات النيوترون والأشعة السينية.
- استخدام البرامج لبناء النماذج وتصور خرائط كثافة الانتشار.
النتائج الرئيسية
- تثبيت ناجح وجمع البيانات من تجارب تشتت النيوترون.
- توضيح سير عمل تحسين البيانات المشترك للأشعة السينية والنيوترون.
- تصور خرائط كثافة طول انتشار النيوترون.
- رؤى حول التفاصيل الهيكلية للبروتين التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة.
الاستنتاجات
- تعد دراسة بلورات البروتين بالنيوترون أداة قوية للبيولوجيا الهيكلية.
- توفر التقنية رؤى فريدة حول وظيفة البروتين وتفاعلاته.
- تعتبر المنهجية الصحيحة حاسمة لجمع البيانات وتحليلها بنجاح.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Neutron crystallography enables precise determination of hydrogen atom positions in proteins, providing mechanistic insights into protonation states and hydration critical for target validation in drug discovery. This non-destructive technique supports de-risking of enzymatic mechanisms involving labile intermediates, particularly for metalloproteins and photosensitive cofactors. The workflow demonstrated offers a pathway to generate high-confidence structural data for lead optimization and mechanistic studies in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Resolves protonation states of catalytic residues and ligand-binding sites to clarify reaction mechanisms.
- Operational Value: Enables study of metalloproteins and photosensitive systems without radiation damage, preserving functional integrity.
- Predictive Value: Provides direct experimental evidence for hydrogen-deuterium exchange at titratable sites, improving confidence in target engagement models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative neutron scattering length density maps that validate binding modes and solvent interactions in active sites.
- Operational Value: Produces reproducible, damage-free datasets suitable for iterative screening campaigns against sensitive targets.
- Platform Value: Supports joint refinement with X-ray data to create reliable, all-atom models for virtual screening and docking studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Clarifies hydration networks and proton transfer pathways relevant to allosteric regulation and pH-dependent activity.
- Translational Value: Links atomic-level mechanism to phenotypic outcomes through validated structural models of disease-relevant enzymes.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in mechanistic hypotheses, supporting go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural insights that inform assay design and compound optimization. It enables mechanistic de-risking before significant investment in medicinal chemistry campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing hydrogen bonding networks and protonation states in enzyme active sites.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible structural data to assess compound-induced conformational changes and binding modes.
- Analytics: Generates neutron scattering length density maps and difference densities that enable precise interpretation of exchangeable hydrogen occupancy.
- Translational Research: Connects atomic mechanism to functional outcomes via validated models of metalloenzyme activity relevant to disease pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying labile intermediates and redox-sensitive targets across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target mechanism, reduction of ambiguity in protonation states, and clarification of catalytic residues.
- Operational Value: Standardized crystal mounting and vapor exchange protocols ensure reproducibility across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by validating target mechanism early, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanistic certainty derived from experimental hydrogen positioning.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography, neutron beamline operations, and deuterated sample handling is required.
- Access to neutron sources (e.g., HFIR, SNS) and specialized instrumentation including quartz capillaries, heat wands, and cryo-stages is essential.
- Cross-team standardization is needed for crystal harvesting, mounting, and vapor exchange protocols to ensure data consistency.
- Adaptation across model systems requires optimization of crystal size (>0.1 mm³) and deuteration efficiency for exchangeable sites.
- Practical limitations include the need for large, fragile crystals and extended vapor exchange periods (minimum two weeks) before data collection.
