استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز

يقدم هذا التقرير الدليل التجريبي على التوثيق الذي يفيد بأن مركب galectin-3 U1 snRNP يرتبط بركيزة mRNA قبل ويشكل مركبا وظيفيا ويؤدي إلى منتجات تفاعل التضفير. يستخدم هذا البروتوكول galectin-3 U1 snRNP المناعيمحدد على الخرز التساهمي المقترن بالأجسام المضادة ل gal3 لبدء تفاعل التضفير ، والذي يمكن أن يتطور حتى الانتهاء. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في الإزالة الدقيقة للسائل بعد تكوير الخرزات التي تحتوي على مركب galectin-3 U1 snRNP واستخدامه الفوري في بدء تفاعل الربط.

لاستنفاد U1 snRNPs من المستخلص النووي ، احتضان 200 ميكرولتر من المستخلص النووي مع 100 ميكرولتر من الخرز المضاد ل U1. أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي إلى الخليط وقم بتدوير رأس الأنبوب الصغير فوق الذيل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. حبيبات الخليط عن طريق الطرد المركزي وجمع المواد غير المنضمة باستخدام حقنة هاميلتون.

بغسيل الكلى بالكامل من المستخلص النووي المستنفد من U1 جنبا إلى جنب مع كمية منفصلة من 50 ميكرولتر من المستخلص النووي الأصلي غير المستنفد في مقصورات منفصلة من جهاز غسيل الكلى الدقيق مع التقليب لمدة 75 دقيقة مقابل 60٪ عازلة D عند أربع درجات مئوية. استخدم غشاء غسيل الكلى بوزن جزيئي 8K مقطوع. مباشرة بعد غسيل الكلى ، قسم المستحضرات إلى 20 ميكرولتر ، ثم قم بتجميدها في حمام الإيثانول الثلجي الجاف وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قبل الاستخدام مباشرة ، اغسل الخرزات المضادة للغال3 مرتين باستخدام 0.5 مل من محلول غسيل TX. لكل غسلة ، أضف عازلة الغسيل وجهاز الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية أولا باستخدام ماصة دقيقة ثم باستخدام حقنة هاميلتون لإخراج السائل من الخرز.

قم بتجزئة المستخلص النووي على تدرج الجلسرين بنسبة 12٪ إلى 32٪. اجمع وخلط الأجزاء المتدرجة للجلسرين ثلاثة وأربعة وخمسة بالقرب من منطقة 10S. قم بإعداد حصتين سعة 150 ميكرولتر من كسور التدرج المركبة من ثلاثة إلى خمسة وضعها في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3.

في موازاة ذلك ، قم بإعداد عينتين لكل منهما 150 ميكرولتر من الكسر الأول وضعها في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3. كعنصر تحكم ، ضع 150 ميكرولترا من 60٪ buffer D في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3. امزج برفق عن طريق النقر على الأنابيب ، ثم قم بتدويرها على الذيل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بيليه العينات مع الطرد المركزي لطيف. قم بإزالة معظم المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام حقنة هاميلتون عن طريق إدخال طرف الإبرة بعناية في أسفل الخرز.

استخدم الخرزات على الفور لتفاعلات الربط. قم بتجميع تفاعل الربط كما هو موضح في المخطوطة النصية وأضفه إلى مجموعة واحدة من عينات الخرزة. قم بتجميع مجموعة متطابقة من تفاعلات الربط بحجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر ولكن بدون مستخلص نووي مستنفد من U1 وأضفه إلى المجموعة الأخرى من الخرز.

قم بإعداد تفاعل الربط الضابط الذي يتم إجراؤه في حالة عدم وجود أي حبات بحجم إجمالي يبلغ 12 ميكرولترا. يحتوي تفاعل التحكم هذا على مستخلص نووي ، 60٪ عازلة D وركيزة الربط المشعة. امزج الأنابيب برفق عن طريق النقر عليها وتدويرها على الذيل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، ثم قم بتكدير الخليط عن طريق الطرد المركزي اللطيف.

أوقف التفاعل وقم بإزالة البروتينات من الخرزات عن طريق إضافة 24 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS إلى الأنابيب التي تحتوي على خرز و 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS إلى أنبوب التحكم الذي يحتوي على مستخلص نووي ولكن بدون خرز. دوامة كل أنبوب. سخني الأنابيب على حرارة 100 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.

الطرد المركزي الأنابيب عند 1 ، 000 مرة G في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 ثانية. انقل المواد الطافية إلى أنابيب دقيقة جديدة. أضف 20 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K لهضم البروتينات وإذابتها.

احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب برفق. خفف حبة الخرز ب 39.5 ميكرولتر TE و 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم الثلاثة مولارية.

خفف التحكم في المستخلص النووي ب 63.5 ميكرولتر TE و 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم. استخراج وتحليل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المخطوطة النصية. تم خلط المستخلصات النووية المستنفدة من مجمعات U1 snRNP و gal3 U1 snRNP من منطقة 10S من مناعي تدرج الجلسرين المترسب بواسطة anti-gal3 في تفاعل تضفير.

احتوى خليط التفاعل هذا على U1 snRNA ، بالإضافة إلى البروتين U1 الخاص U1-70K. كما هو متوقع ، فإن anti-gal3 عجل gal3. لم يتم العثور على U1 snRNA و U1-70K protein و gal3 في هطول الأمطار قبل التحكم في المناعة.

بالمقارنة مع المستخلص النووي غير المستنفد الذي تم إجراؤه كعنصر تحكم إيجابي ، فإن المستخلص النووي المستنفد من U1 snRNP لم يظهر نشاط تضفير. يمكن إعادة تكوين نشاط التضفير في المستخلص النووي المستنفد من U1 بواسطة مركب gal3 U1 snRNP المرتبط بالخرز. تم العثور على كلا المنتجين من تفاعل التضفير المربوطة exons و intron lariat المستأصل وكذلك في المواد الوسيطة.

كانت مكونات الكسور من ثلاثة إلى خمسة حاسمة في استعادة التضفير إلى المستخرج النووي المستنفد من U1. عندما تم استبدال هذه الكسور بمخزن مؤقت وحده ، لا يمكن ملاحظة أي نشاط تضفير ، مما يشير إلى أن الخرز المضاد ل gal3 لم تكن مسؤولة عن استعادة نشاط التضفير في المستخلص النووي المستنفد من U1. بشكل أكثر إقناعا ، عندما تم استبدال الكسور من ثلاثة إلى خمسة بجزء واحد في إجراء الترسيب المناعي ثم إضافتها إلى المستخلص النووي المستنفد U1 ، لم يتم العثور على مواد وسيطة أو منتجات لتفاعل التضفير. عند محاولة هذا البروتوكول ، يجب على شخص واحد إكمال الترسيب المناعي بينما يقوم الشخص الآخر بإعداد تفاعل التضفير بأقل قدر ممكن من التأخير.

سيكون التحليل البروتيني لتكوين عديد الببتيد في galectin-3 U1 SNRP الذي يعيد نشاط التضفير إلى مستخلص نووي مستنفد U1 ذا أهمية كبيرة.