استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز
ديسمبر 9, 2020
تصف هذه المقالة الإجراءات التجريبية ل(أ) استنفاد U1 snRNP من المستخلصات النووية، مع ما يصاحب ذلك من فقدان نشاط الربط؛ (ب) استنفاد اليورانيوم 1 من اليورانيوم المستنفد لليورانيوم من المستخلصات النووية، مع ما يصاحب ذلك من فقدان نشاط الربط؛ (ب) استنفاد اليورانيوم من اليورانيوم 1 من اليورانيوم المستنفد للأوزون؛ (ج) استنفاد اليورانيوم من اليورانيوم غير النووي. و (ب) إعادة تشكيل نشاط الربط في استخراج U1 المنضب بواسطة الجسيمات galectin-3 - U1 SnRNP ملزمة بالخرز يقترن بشكل متناقض مع الأجسام المضادة المضادة للجاليكتين-3.
يقدم هذا التقرير الدليل التجريبي على التوثيق الذي يفيد بأن مركب galectin-3 U1 snRNP يرتبط بركيزة mRNA قبل ويشكل مركبا وظيفيا ويؤدي إلى منتجات تفاعل التضفير. يستخدم هذا البروتوكول galectin-3 U1 snRNP المناعيمحدد على الخرز التساهمي المقترن بالأجسام المضادة ل gal3 لبدء تفاعل التضفير ، والذي يمكن أن يتطور حتى الانتهاء. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في الإزالة الدقيقة للسائل بعد تكوير الخرزات التي تحتوي على مركب galectin-3 U1 snRNP واستخدامه الفوري في بدء تفاعل الربط.
لاستنفاد U1 snRNPs من المستخلص النووي ، احتضان 200 ميكرولتر من المستخلص النووي مع 100 ميكرولتر من الخرز المضاد ل U1. أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي إلى الخليط وقم بتدوير رأس الأنبوب الصغير فوق الذيل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. حبيبات الخليط عن طريق الطرد المركزي وجمع المواد غير المنضمة باستخدام حقنة هاميلتون.
قمبغسيل الكلى بالكامل من المستخلص النووي المستنفد من U1 جنبا إلى جنب مع كمية منفصلة من 50 ميكرولتر من المستخلص النووي الأصلي غير المستنفد في مقصورات منفصلة من جهاز غسيل الكلى الدقيق مع التقليب لمدة 75 دقيقة مقابل 60٪ عازلة D عند أربع درجات مئوية. استخدم غشاء غسيل الكلى بوزن جزيئي 8K مقطوع. مباشرة بعد غسيل الكلى ، قسم المستحضرات إلى 20 ميكرولتر ، ثم قم بتجميدها في حمام الإيثانول الثلجي الجاف وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قبل الاستخدام مباشرة ، اغسل الخرزات المضادة للغال3 مرتين باستخدام 0.5 مل من محلول غسيل TX. لكل غسلة ، أضف عازلة الغسيل وجهاز الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية أولا باستخدام ماصة دقيقة ثم باستخدام حقنة هاميلتون لإخراج السائل من الخرز.
قم بتجزئة المستخلص النووي على تدرج الجلسرين بنسبة 12٪ إلى 32٪. اجمع وخلط الأجزاء المتدرجة للجلسرين ثلاثة وأربعة وخمسة بالقرب من منطقة 10S. قم بإعداد حصتين سعة 150 ميكرولتر من كسور التدرج المركبة من ثلاثة إلى خمسة وضعها في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3.
في موازاة ذلك ، قم بإعداد عينتين لكل منهما 150 ميكرولتر من الكسر الأول وضعها في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3. كعنصر تحكم ، ضع 150 ميكرولترا من 60٪ buffer D في 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للجال3. امزج برفق عن طريق النقر على الأنابيب ، ثم قم بتدويرها على الذيل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
بيليه العينات مع الطرد المركزي لطيف. قم بإزالة معظم المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام حقنة هاميلتون عن طريق إدخال طرف الإبرة بعناية في أسفل الخرز.
استخدم الخرزات على الفور لتفاعلات الربط. قم بتجميع تفاعل الربط كما هو موضح في المخطوطة النصية وأضفه إلى مجموعة واحدة من عينات الخرزة. قم بتجميع مجموعة متطابقة من تفاعلات الربط بحجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر ولكن بدون مستخلص نووي مستنفد من U1 وأضفه إلى المجموعة الأخرى من الخرز.
قم بإعداد تفاعل الربط الضابط الذي يتم إجراؤه في حالة عدم وجود أي حبات بحجم إجمالي يبلغ 12 ميكرولترا. يحتوي تفاعل التحكم هذا على مستخلص نووي ، 60٪ عازلة D وركيزة الربط المشعة. امزج الأنابيب برفق عن طريق النقر عليها وتدويرها على الذيل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، ثم قم بتكدير الخليط عن طريق الطرد المركزي اللطيف.
أوقف التفاعل وقم بإزالة البروتينات من الخرزات عن طريق إضافة 24 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS إلى الأنابيب التي تحتوي على خرز و 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS إلى أنبوب التحكم الذي يحتوي على مستخلص نووي ولكن بدون خرز. دوامة كل أنبوب. سخني الأنابيب على حرارة 100 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.
الطرد المركزي الأنابيب عند 1 ، 000 مرة G في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 ثانية. انقل المواد الطافية إلى أنابيب دقيقة جديدة. أضف 20 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K لهضم البروتينات وإذابتها.
احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب برفق. خفف حبة الخرز ب 39.5 ميكرولتر TE و 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم الثلاثة مولارية.
خفف التحكم في المستخلص النووي ب 63.5 ميكرولتر TE و 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم. استخراج وتحليل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المخطوطة النصية. تم خلط المستخلصات النووية المستنفدة من مجمعات U1 snRNP و gal3 U1 snRNP من منطقة 10S من مناعي تدرج الجلسرين المترسب بواسطة anti-gal3 في تفاعل تضفير.
احتوى خليط التفاعل هذا على U1 snRNA ، بالإضافة إلى البروتين U1 الخاص U1-70K. كما هو متوقع ، فإن anti-gal3 عجل gal3. لم يتم العثور على U1 snRNA و U1-70K protein و gal3 في هطول الأمطار قبل التحكم في المناعة.
بالمقارنة مع المستخلص النووي غير المستنفد الذي تم إجراؤه كعنصر تحكم إيجابي ، فإن المستخلص النووي المستنفد من U1 snRNP لم يظهر نشاط تضفير. يمكن إعادة تكوين نشاط التضفير في المستخلص النووي المستنفد من U1 بواسطة مركب gal3 U1 snRNP المرتبط بالخرز. تم العثور على كلا المنتجين من تفاعل التضفير المربوطة exons و intron lariat المستأصل وكذلك في المواد الوسيطة.
كانت مكونات الكسور من ثلاثة إلى خمسة حاسمة في استعادة التضفير إلى المستخرج النووي المستنفد من U1. عندما تم استبدال هذه الكسور بمخزن مؤقت وحده ، لا يمكن ملاحظة أي نشاط تضفير ، مما يشير إلى أن الخرز المضاد ل gal3 لم تكن مسؤولة عن استعادة نشاط التضفير في المستخلص النووي المستنفد من U1. بشكل أكثر إقناعا ، عندما تم استبدال الكسور من ثلاثة إلى خمسة بجزء واحد في إجراء الترسيب المناعي ثم إضافتها إلى المستخلص النووي المستنفد U1 ، لم يتم العثور على مواد وسيطة أو منتجات لتفاعل التضفير. عند محاولة هذا البروتوكول ، يجب على شخص واحد إكمال الترسيب المناعي بينما يقوم الشخص الآخر بإعداد تفاعل التضفير بأقل قدر ممكن من التأخير.
سيكون التحليل البروتيني لتكوين عديد الببتيد في galectin-3 U1 SNRP الذي يعيد نشاط التضفير إلى مستخلص نووي مستنفد U1 ذا أهمية كبيرة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تفصل هذه المقالة الإجراءات التجريبية لاستنفاد U1 snRNP من المستخلصات النووية وإعادة تكوين نشاط الربط باستخدام جزيئات galectin-3 U1 snRNP. يقدم هذا الدراسة نظرة ثاقبة حول تكوين معقد الربط الوظيفي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأحياء الجزيئي
الخلفية
- U1 snRNP ضروري لربط ما قبل الرنا المرسال.
- Galectin-3 يشارك في معالجة الرنا.
- فهم آليات الربط ضروري لتنظيم التعبير الجيني.
- تستكشف هذه الدراسة التفاعل بين galectin-3 و U1 snRNP.
هدف الدراسة
- للتحقيق في دور galectin-3 في الربط.
- لتطوير بروتوكول لاستنفاد U1 snRNP وإعادة تكوينه.
- لتوفير دليل تجريبي على تكوين معقد الربط.
الطرق المستخدمة
- استنفاد U1 snRNP من المستخلصات النووية باستخدام حبات مضادة لـ U1.
- اختيار مناعي لـ galectin-3 U1 snRNP على الحبات.
- بدء تفاعلات الربط بالمعقد المختار.
- الطرد المركزي وجمع المواد غير المرتبطة للتحليل.
النتائج الرئيسية
- يؤدي الاستنفاد الناجح لـ U1 snRNP إلى فقدان نشاط الربط.
- يتم تحقيق إعادة تكوين نشاط الربط باستخدام galectin-3 U1 snRNP.
- يسمح البروتوكول بإكمال تفاعل الربط.
- الخطوات الحرجة في البروتوكول تضمن سلامة معقد الربط.
الاستنتاجات
- يلعب Galectin-3 دورًا مهمًا في عملية الربط.
- البروتوكول المطور فعال لدراسة آليات الربط.
- يمكن أن تستكشف الأبحاث الإضافية العوامل الإضافية التي تؤثر على الربط.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This study demonstrates a bead-based reconstitution approach to validate the functional role of galectin-3 in pre-mRNA splicing through its interaction with U1 snRNP. The method enables mechanistic de-risking of RNA-binding protein targets by confirming their participation in spliceosome assembly and activity. Such target validation strategies support early discovery decisions by providing direct evidence of functional complex formation in a disease-relevant nuclear extract system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms galectin-3 as a required splicing factor by demonstrating loss of activity upon U1 snRNP depletion and rescue via galectin-3–U1 snRNP complexes.
- Operational Value: Uses immuno-selected complexes on beads to isolate functional ribonucleoprotein particles for mechanistic interrogation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative splicing readout based on exon ligation and intron lariat formation to assess complex functionality.
- Operational Value: Enables standardized reconstitution assays using bead-purified complexes to minimize variability in nuclear extract preparations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links galectin-3–U1 snRNP interaction to early spliceosome (E complex) formation, providing a mechanistic foothold for target modulation in RNA processing disorders.
- Operational Value: Supports continuity from target engagement to functional output in a nuclear extract system that mirrors native splicing conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum by enabling target validation of RNA-binding proteins through functional reconstitution in splicing-competent systems, bridging biochemical interaction data with phenotypic readouts.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that galectin-3 functions in splicing via U1 snRNP association by measuring rescue of splicing activity in depleted extracts.
- Screening: Produces reproducible, quantitative splicing products (ligated exons, excised introns) as functional readouts for complex activity.
- Analytics: Relies on RNA extraction and analysis to quantify splicing intermediates and products, enabling comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular interaction (galectin-3–U1 snRNP) to a core gene expression mechanism relevant to disease pathways involving splicing dysregulation.
- Enterprise Reuse: The bead-based immunoselection and reconstitution scheme is generalizable to other ribonucleoprotein complexes in RNA processing pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic confidence in galectin-3’s role in spliceosome assembly by demonstrating its necessity and sufficiency in a defined complex.
- Operational Value: Enables standardized, bead-based purification of functional complexes to reduce batch-to-batch variability in nuclear extract studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on RNA-binding protein targets by linking target engagement to functional splicing outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in RNA metabolism by validating their functional participation in key nuclear processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclear extract preparation, splicing assays, and immunoprecipitation techniques.
- Dependent on access to glycerol gradient fractionation, bead-based immunoselection, and radioactive or labeled RNA substrates for splicing detection.
- Necessitates cross-team standardization between biochemistry and molecular biology groups for extract handling and complex isolation.
- Adaptation to alternative models may require optimization of bead binding conditions and extract compatibility.
- Practical limitations include the lability of splicing complexes, requiring immediate use of beads after purification to maintain activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Preparation of NE Depleted of U1 snRNP (U1ΔNE)
2:10
Immunoprecipitation of 10S Fractions of Glycerol Gradients by Anti-Gal3
3:52
Assembly of Splicing Reaction and Analysis of Products
6:09
Results: RNA and Polypeptide Compositions of the Anti-Gal3 Precipitate of the 10S Region of the Glycerol Gradient and its Ability to Reconstitute Splicing in U1ΔNE
8:08
Conclusion
