سير عمل معياري للتحليل الكمي والهيكلي والوظيفي لأفلام ليبتوسبيرا الحيوية

ندرس الأغشية الحيوية كهياكل واقية تمكن من الاستمرارية البيئية والمضيفة، ونبحث في ديناميكيات التكوين، والتركيب الجزيئي، والخصائص التكيفية ومساهمتنا في العدوى. من خلال دمج اختبار الأحياء البلوري، وتصوير النص الزمني، والمجهر الكونفوكلي، والمجهر الإلكتروني الماسح، وعلم النسخات في مختبراتنا يدفع أبحاث الأغشية الحيوية من خلال التحليل متعدد الأبعاد المتكامل. للبدء، ننمو خلايا ليبتوسبيرا في وسط EMJH في أنابيب زجاجية ذات غطاء لولبي مسطح القاع.

حضن الثقافات تحت ظروف هوائية عند درجة حرارة 30 درجة مئوية دون هز حتى تصل إلى منتصف الطور اللوغاريتمي. تأكد من أن الزراعة تصل إلى كثافة بصرية بين 0.2 و0.4 عند 405 نانومتر، وهو ما يعادل من اثنين إلى خمسة أضرار 10 في قوة ثماني خلايا لكل ملليلتر. باستخدام مجهر مجال داكن بتكبير 20 مرة، تحقق من أن الخلايا مودالية وليست متجمعة.

تخفيف زراعة الطور غير المنتظمة المثبتة في منتصف اللوغارم بنسبة واحد إلى 100 في وسط EMJH الطازج للحصول على حوالي واحد في 10 إلى قوة ست خلايا لكل ملليلتر وامزج بلطف عن طريق الانعكاس دون دوامة. الآن استخدم ملقط معقم لوضع غشاء بولي كربونات مائي معقم بحجم 0.1 ميكرومتر مسطح في قاع كل بئر في صفيحة بئر 24 بئر معقمة مع غطاء. أضف ملليتر واحد من وسط EMJH المعقم إلى كل بئر ونقع الغشاء مسبقا لمدة ساعتين عند درجة حرارة 30 درجة مئوية.

بعد ذلك، أزل محلول النقع من كل بئر دون إزاحة الغشاء وأضف 1.5 ملليلتر من التعليق البكتيري المخفف، لضمان بقاء الغشاء ثابتا في مكانه في القاع. ثم ضع صينية مملوءة بالماء داخل الحاضنة للحفاظ على الرطوبة. حضن الصفيحة عند 30 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة للسماح بتكوين الأغشية الحيوية.

ترك الطبق لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع للسلالات التي تنمو ببطء. في النقطة الزمنية المطلوبة، استنشق أكبر قدر ممكن من وسط الزراعة دون إزعاج الغشية الحيوية. اشطف كل منهما جيدا بلطف بملليلتر واحد من PBS المعقم مع إبقاء الغشاء مستويا على القاع.

أضف ملليتر واحد من ألديهيد 4٪ بارافورم في PBS إلى كل بئر وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتثبيت عينات الغشاء الحيوي. بعد الحضانة، أزل المثبت واشطفها بلطف مرتين بملليلتر واحد من PBS. أضف ملليتر واحد من محلول البنفسجي الكريستالي بوزن 0.1٪ حسب الحجم إلى كل بئر وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، مع التأكد من أن غطاء الغطاء مغمور بالكامل.

ثم تخلص من صبغة البنفسج الكريستالية من كل بئر وشطفها مرتين بملليلتر واحد من PBS. قم بإمالة الطبق وصرف كل السائل المتبقي. اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة ليجف في الهواء حتى يبدو الركيزة جافا تماما، ويفضل أن يكون ذلك طوال الليل.

بعد ذلك، أضف 500 ميكرولتر من محلول الإيلوسي المكون من 50٪ إيثانول و50٪ حمض الخليك الجليدي بالحجم لكل بئر. قم بعمل البيبيت للأعلى والأسفل لإذابة البقعة المرتبطة بالغشية الحيوية بالكامل. الآن، انقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة دقيقة شفافة بصريا بسعة 96 بئر.

قس الامتصاص عند 570 نانومتر وطرح القيم الخلفية من الضوابط غير الملقحة التي تمت معالجتها عبر جميع الخطوات. سجل المتوسط والانحراف المعياري لثلاثة نسخ تقنية على الأقل. احصل على الأغشية الحيوية في صفائح البئر كما هو موضح سابقا.

أضف محلول من 4٪ ألدهيد بارافورم، و1٪ جلوتارالديهيد في محلول صوديوم 0.2 مولي عند درجة حموضة 7.4 إلى الآبار. حضن العينات الثابتة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بإزالة المثبت وشطف العينة مرتين باستخدام PBS للحفاظ على الطبقة الحيوية المثبتة على السطح مع تقليل الانفصال.

الآن اغمر غطاء الغطاء في 1٪ أوسميوم رباعي أكسيد، مخفف في PBS وحضن لمدة ساعة واحدة لتعزيز تباين المجهر الإلكتروني الماسح. ثم اشطف الركيزة مرتين باستخدام PBS. جفف العينات عن طريق غمرها بالتتابع لمدة 10 دقائق لكل منها في سلسلة الإيثانول المتدرجة.

بعد ذلك، أضف 500 ميكرولتر من هيكساميثيلديسيلازان وحضن لمدة خمس دقائق. ثم استبدلها بهيكساميثيلديسلازان طازج وحضن لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك، أزل المحلول الزائد واترك العينة تجف تماما في الهواء تحت غطاء البخار.

الآن قم بتركيب العينات المجففة على قطع المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام شريط كربوني موصل مزدوج الوجه. طبقة رقيقة من الذهب أو البلاتين بطبقة رقيقة من الذهب أو البلاتين لتعزيز تباين الإلكترونات أثناء التصوير. وأخيرا، قم بتحميل القطع المحضرة في المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام حامل العينة المناسب.

قم بإخلاء الحجرة طوال الليل إذا أمكن لتحسين جودة التصوير. ثم يلتقط صورا إلكترونية ثانوية بجهد من خمسة إلى خمسة عشر كيلوفولت باستخدام التكبيرات المناسبة لتصوير البنية الفائقة للغشاء الحيوي. بعد 21 يوما من الحضانة، كشفت تلوين البنفسجي الكريستالي عن أنماط بيوغشية مرئية على كل من مرشحات البولي كربونات وشرائح الغطاء الزجاجي لاستجواب ليبتوسبيرا وليفتوسبيرا بيفليكسا.

كل نوع يظهر آثار معمارية مميزة مثل الأشكال النقطية أو المتفرعة أو الشبكية. أكدت قياسات الامتصاص عند 570 نانومتر احتفاظا أكبر بالبنفسج البلوري في أغشية ليبتوسبيرا بايفليكسا مقارنة باستروغانات اللبتوسبيرا عبر جميع النقاط الزمنية، مما يشير إلى تراكم أكبر للكتلة الحيوية في السلالة. المجهر الإلكتروني الماسح لأفلام ليبتوسبيرا الحيوية، التقطت رواسب مصفوفة خارج الخلية مبكرة في أغشية حيوية عمرها ثلاثة أيام، ووجه قاعدي ناضج ومزود بقناة ببنية ثلاثية الأبعاد بعد 14 يوما، وتوحيد مصفوفات متطور بالكامل مع بنية كثيفة بمقدار 21 يوما.

يقوم بروتوكولنا المحسن بمزامنة القراءات التكميلية من الثقافات المتطابقة، مما يزيد من المتانة، ويقلل من التباين، ويكشف عن معلومات ديناميكية وبنيوية، ومتاحة بطرق ذات طريقة واحدة. من خلال دمج التحليل التكميلي، قامت نتائجنا بتوحيد تقييم الأغشية الحيوية، ووضحت ديناميكيات وبنية الليبتوسبيرا. تربط البنية بالضراوة وتقوي البحث المقارن القابل للتكرار.

طفرات مستقبلية تربط التنظيم بمورفولوجيا وديناميكيات الأغشية الحيوية، وتوضيح الاستمرارية البيئية وتقييم الاستراتيجيات التي تعطل معلومات الغشاء الحيوي أو تعزز انتشارها.