عزل وقياس mRNA المحوري باستخدام إدخالات الغشاء المسامي وRTddPCR

تدرس أبحاثنا كيفية تنظيم تخليق البروتينات المحلية وأدوارها في إصلاح وتطور وتنكس الأعصاب. تشمل التطورات الحديثة تقنيات كشف mRNA عالية الحساسية، مثل gdPCR، لتحديد MRNA المحوري منخفض الوفرة، وتقسيم الزراعة العصبية. للبدء، أدمج 250 ميكرولتر من الترييازول في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر يتوافق مع كل إدخال في بئر واحد أو إدخال من صفيحة بستة آبار.

أبق الأنابيب جانبا حتى الحاجة. أضف ملليترين من PBS المعقمة إلى كل بئر من صفيحة ثانية ذات ستة آبار، لضمان تطابق عدد الآبار أو الألواح مع عدد الإدخالات. قم بإخراج وسائط الزراعة من كل من الجزء العلوي من أسفل الإدخال وانقل الإدخال إلى لوحة ذات ستة آبار تحتوي على PBS.

الآن، باستخدام الملقط، ضع الإدخال برفق، ثم أضف ملليلتر من PBS فوقه. استنشق PBS من كلا الجانبين وكرر الغسل مرتين. ثم اترك الإدخال في PBS جديد.

بعد ذلك، استخدم مكشطة خلايا معقمة لكشط جزء الخلية العصبية بالكامل من أعلى الإدخال. اجمع مادة سوما ليزات من الإدخال. انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر.

قم بطرد المركزي بالأنبوب على 10,000 إلى 15,000 جرام لمدة دقيقتين. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من التريزول. ضع علامة على هذا الأنبوب كجزء كامل من الخلايا العصبية.

لجمع جزء العصبية، حرك أحد طرفي مسحة القطن المعقمة ببطء بنمط متعرج من الأعلى إلى الأسفل على الجانب الخلوي بالكامل من الإدخال. قم بتدوير الإدخال 90 درجة وكرر العملية باستخدام الطرف الآخر من المسحة. ثم تخلص من المسحة.

استخدم مسحة جديدة وتحرك في دوائر متحدة المركز، بدءا من مركز الإدخال إلى الخارج، مع التأكد من تنظيف المحيط أيضا. اقلب الإدخال بحيث يكون جانب العصبيون مواجها للأعلى. اقطع الغشاء باستخدام شفرة مشرط معقمة جديدة.

ضع الغشاء المقطوع في صفيحة ذات ستة آبار تحتوي على تريزول مع جانب النيوريت للأسفل ووجهه للأسفل. تأكد من أن الغشاء مغمور. الآن اجمع التريزول الذي يحتوي على نيوريت ليزات من البئر.

انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر. تابع عزل الحمض النووي الريبي أو خزن السوما ونيروزيت عند ناقص 80 درجة مئوية للمعالجة لاحقا. جهز تفاعلات PCR رقمية بنسخ عكسي باستخدام Droplet Digital PCR Ready-to-Use Universal Mix واستهدف البرايمرات المحددة باستخدام DNA تكميلي مناسب.

قم بتحويل خليط التفاعل إلى خرطوشة توليد القطرات. ثم أضف زيت التوليد إلى الآبار المخصصة للخرطوشة. الآن، أغلق الخرطوشة بالجلسة.

توليد القطرات باستخدام مولد القطرات. بعد توليد القطرات، انقلها إلى لوحة PCR بسعة 96 بئر وأغلقها بورق الألمنيوم قبل وضع اللوح في جهاز التدوير الحراري. افتح برنامج QX Manager لبدء التحليل.

انقر على خيار التصفح وافتح الملف ليتم تحليله. عند تحميل الملف، يظهر عرض لوحة التحكم في اللوحة اليسرى. اختر الآبار التي تهمك بالضغط المستمر على زر التحكم أثناء النقر.

انقر على سعة 1D لرؤية مخطط نقطي. اختر العتبة عدة آبار لتطبيق نفس العتبة على أكثر من بئر واحد. أدخل قيمة العتبة بناء على مكان وجود فصل واضح بين القطرات الموجبة والسالبة.

الآن شاهد قسم البيانات جيدا، حيث يظهر وصف العينة، وقيم التركيز، وعدد القطرات المقبولة، بالإضافة إلى عدد القطرات الموجبة والسالبة. انقر على الحفظ لتسجيل نتائج العتبة. كشفت كمية الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار ريبو الأخضر أن كسور الخلايا العصبية الكاملة تنتج 212.85 نانوجرام من الحمض النووي الريبي لكل إدخال، بينما أظهرت كسور العصبون 42.75 نانوغرام.

حدد التحقق من PCR مجموعة البادئات الأولى كالأكثر تحديدا لنص Gap43، حيث تظهر نطاقا واحدا مميزا. نتائج PCR الغامضة لجاما-أكتين دفعت إلى إجراء اختبار تدرج درجة حرارة باستخدام مجموعة البادئات الثانية، والتي أظهرت أقوى تضخيم عند 55 درجة مئوية. أظهرت مخططات سعة RT-ddPCR انفصالا واضحا للقطرات لجاما-أكتين في عينات الخلايا العصبية والعصبية الكاملة، مما أكد اكتشافا موثوقا للنسخ.

بالنسبة ل Gap43، يوجد ما يقرب من 23٪ من تجمع mRNA في الخلايا العصبية، مقارنة بغاما-أكتين، حيث يوجد فقط 5٪ من مجموعة mRNA في الأعصاب مقارنة بكامل جزء الخلايا العصبية. لقد أظهرنا وجود هياكل حبيبية إجهاد في المحاور تحت الظروف الفسيولوجية، مما يعيق تخليق البروتين المحلي. يقدم بروتوكولنا طريقة موثوقة ومتسقة لعزل الحجرات العصبية واكتشاف mRNA منخفض البيئة.

سيركز التحليل المستقبلي على عزل وتوصيف المجالات الفرعية المحورية المميزة، مثل مخاريط النمو وعمود المحور العصبي بعد التحليل الكتلي.