Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Summary

Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Dieses Modell ist ideal für die Durchführung einer Reihe von experimentellen Manipulationen, die die Netzhaut Ziel global oder direkt auf den verletzten neuronalen Population von retinalen Ganglienzellen.

Abstract

Retinalen Ganglienzellen (RGC) sind ZNS-Neuronen, die Ausgabe visueller Informationen aus der Netzhaut zum Gehirn über den Sehnerv. Der Sehnerv kann innerhalb der Augenhöhle zugegriffen werden und vollständig durchtrennt (axotomized), Schneiden der Axone des gesamten RGC Bevölkerung. Sehnerv durchtrennt ist ein reproduzierbares Modell der apoptotischen Zelltod in der erwachsenen ZNS ^1-4. Dieses Modell ist besonders attraktiv, weil der Glaskörper des Auges dient als Kapsel für Drug-Delivery auf die Netzhaut und ermöglicht experimentelle Manipulationen via intraokularen Injektionen. Die Diffusion von Chemikalien durch den Glaskörper sorgt dafür, dass sie sich auf die gesamte Bevölkerung RGC handeln. Virale Vektoren, Plasmide oder short interfering RNAs (siRNAs) kann auch auf die Glaskörperraum geliefert werden, um zu infizieren oder zu transfizieren Netzhautzellen ^5-12. Die hohen Tropismus Adeno-Associated Virus (AAV)-Vektoren ist vorteilhaft für Ziel RGCs, mit einer Infektionsrate von annähernd 90% der Zellen in der Nähe der Injektionsstelle ^{6, 7, 13-15.} Darüber hinaus können RGCs selektiv, indem siRNAs, Plasmide oder virale Vektoren, um das abgeschnittene Ende des Sehnervs ^16-19 oder Einspritzen Vektoren in ihrem Ziel der Colliculus superior ¹⁰ transfiziert werden. Dies ermöglicht es den Forschern um apoptotische Mechanismen in der verletzten neuronalen Population ohne verwirrende Auswirkungen auf andere Zuschauer Neuronen oder Gliazellen um zu studieren. RGC Apoptose hat einen charakteristischen zeitlichen Verlauf, wobei Zelltod 3-4 Tage postaxotomy, wonach die Zellen schnell degenerieren verzögert wird. Dies stellt ein Fenster für experimentelle Manipulationen gegen Signalwege der Apoptose beteiligt sind. Manipulationen, die direkt für die Zielgruppe RGCs aus der durchtrennten Sehnerven Stumpf sind zum Zeitpunkt der Axotomie durchgeführt, sofort nach dem Schneiden des Nervs. Im Gegensatz dazu, wenn Substanzen, die über eine intraokulare Route ausgeliefert werden, können sie vor der Operation oder innerhalb der ersten 3 Tage nach der Operation injiziert werden, vor der Einleitung der Apoptose in axotomized RGCs. In diesem Artikel zeigen wir verschiedene Methoden für experimentelle Manipulationen nach Sehnerv durchtrennt.

Protocol

1. Operationstechnik

1. Experimente durchgeführt werden sollte unter aseptischen Bedingungen und nach der Nutzung von Tieren Protokolle Ihrer spezifischen Institution. Instrumente und Materialien (Lösungen, Testsubstanzen, Tracer, Nadeln, etc.) in Kontakt mit lebendem Gewebe müssen steril sein, um Infektionen und nachteilige Auswirkungen auf den Tierschutz und mögliche negative Auswirkungen auf die Studie zu verhindern.

2. Anästhesie

1. Ratten werden anästhesiert mit einer tierärztlichen Isofluran Verdampfer-System. Verwenden medizinischen Sauerstoff mit einer Rate von 0,8 L / min auf die Isofluran-Gas zu verdampfen. Legen Sie das Tier in der beigefügten Anästhesie-Box und wählen Sie in einer Isofluran-Konzentration von 4% bis zum Atmen hat sich verlangsamt und das Tier beruhigen.
2. Als nächstes schalten Sie den Gasstrom auf die Gasmaske Aufsatz für den stereotaktischen Rahmen und Ort des Tieres in den stereotaktischen Apparat. Schalten Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% und zu überwachen Anästhesie. Größere Tiere (> 300g) kann eine höhere Konzentration von Isofluran. Anästhesie sollte während der Operation überwacht werden und Isofluran Dosierung entsprechend angepasst werden. Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung sollte ständig evaluiert werden, und Zehe Prise Evaluation (alle 5 min) für das Fehlen der tiefen Schmerz durchgeführt werden soll.
3. Nach der Operation abgeschlossen ist, schalten Sie die Isofluran und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten vor der Entnahme aus der stereotaktischen Gerät. Die Körpertemperatur sollte durch Abdecken des Tieres mit einem chirurgischen Decke und / oder mit einem geregelten Heizdecke während der Operation beibehalten werden.

3. Spritze Vorbereitung für Intraokularlinsen-Injektionen

1. Zunächst versammeln sich die Spritze zur Durchführung des intraokularen Injektionen. Ein 10 l RN Gasdichte 1701 Hamilton-Spritze ist zur Injektion verwendet. Entfernen Sie alle Nadel oder RN Mutter auf dem Ende der Spritze.
2. Legen Sie die PFA Ferrule in die PEEK Tasse Ferrule der Klemmverschraubung. Dann legen Sie die komplette Montage in das Ende der Spritze und lose Schraube der RN Mutter über top.
3. Legen Sie das eine Ende des 1 / 16 inch PEEK-Schlauch in die Klemmverschraubung, durch die Öffnung in der RN Mutter. Achten Sie darauf, die PEEK-Schlauch richtig sitzt. Ziehen Sie die RN Mutter, um die Ferrule zu komprimieren, Abdichten der PEEK-Schlauch.
4. Führen Sie Schritt 3.2 an beiden Enden des Dual RN Glas Koppler. Befestigen Sie das freie Ende des PEEK-Schlauch an einem Ende des Dual RN Glas Kupplung durch Anziehen der RN Mutter.
5. A gezogen Glasmikropipette bilden die Nadel und Zylinder für die Einspritzanlage. Verwenden Sie 1,5 mm OD dickwandige Glas Kapillarrohr auf das Glas Pipetten herzustellen, und legen Sie die Glaspipette in das freie Ende des Dual RN Glas Koppler. Ziehen Sie die RN Mutter, um die Pipette zu fixieren.
6. Die feine Spitze gezogen Glasmikropipetten ist in der Regel zu klein für die Durchführung von intraokularen Injektionen. Um ein Trinkgeld von entsprechenden Durchmesser zu schaffen, brechen die Spitze der Glaspipette unter Sichtkontrolle mit einem Operationsmikroskop. Der mattierte Ende ein Glas Objektträger ist gut geeignet, um die Pipette zu brechen. Halten Sie die Pipette in einem Winkel und reiben Sie die Spitze entlang der Glas Zuckerguss, eine Pause zu schaffen. Idealerweise sollte die abschließende Spitze leicht abgeschrägt werden. Es kann einige Versuche, einen guten Tipp produzieren zu nehmen, so ziehen mehrere Pipetten vor Gebrauch.
7. Das Einspritzsystem ist hydraulisch. Daher muss die Spritze, PEEK-Schlauch-Linker, Dual RN Glas-Koppler und Glasmikropipette mit Mineralöl vor der Verwendung befüllt werden. Mit dem Priming-Kit von Hamilton Spritze Co. (PRMKIT), füllen Sie die Grundierung Spritze mit Mineralöl. Verwenden Sie einen großen Durchmesser Nadel leichte Passage des viskosen Öl zu ermöglichen. Ersetzen Sie die Nadel mit der Hamilton 90030 Nadel, die in den Lauf der 10 ul Hamilton Spritze passt. Als nächstes legen Sie eine Gummi-septum über die Hamilton 90030 Nadel, um eine Abdichtung während der Injektion der Mineralölindustrie.
8. Legen Sie die Hamilton 90030 Nadel des Priming Spritze in den Rücken der Lauf der 10 l Hamilton-Spritze des Einspritzsystems. Drücken Sie die Scheidewand dicht an das Ende der Spritze, um eine Dichtung zu schaffen.
9. Drücken Sie langsam den Kolben. Sie finden die Mineralöl-Durchlauf durch die Glaselemente der Einspritzanlage zu sehen, und schließlich Befüllen der Glaspipette. Schieben Sie das gesamte Öl durch die Einspritzanlage, um eventuell vorhandene Luftblasen an der Darm-Trakt zu entfernen. Wenn die Füllung Spritze läuft aus Mineralöl, langsam ziehen Sie die Nadel unter ständigem Verzicht Öl Luftblasenbildung zu verhindern. Füllen Sie die Grundierung Spritze aufgezogen und wieder.
10. Wenn das gesamte System mit Mineralöl und blasenfrei gefüllt ist, legen Sie die Original-Stempel der 10 l Hamilton-Spritze. Drücken Sie den Kolben bis zum Ende seiner Reise, um zusätzliche Mineralöl aus dem System zu entfernen. Wischen Sie die Glasmikropipette sauber und das Ende der Spritze sauber mit 70% Ethanol.
11. Withdraw den Kolben der Spritze an die 2 ul Markierung auf den Lauf. Das Ende der Glasmikropipette wird mit Luft bietet eine Pufferzone zwischen der Mineralölindustrie und der gewünschten Flüssigkeit injiziert werden zu füllen. Die Pipette Fass kann nun, indem sie das Ende der Mikropipette in die gewünschte Lösung und Aberkennung der Kolben der Hamilton-Spritze gefüllt werden. Injizieren Sie nicht mehr als 4-5 ul der Lösung in einer erwachsenen Ratte Auge.

4. Intraokulare Injektion Vorgehensweise: Targeting der Retina Globally

1. Mit dem Tier narkotisiert und gesichert in den stereotaktischen Rahmen (wie in Abschnitt 2 beschrieben), verwenden Sie Alcaine Augentropfen topisch zu betäuben der Hornhaut. Öffnen Sie die Augenlider mit den Fingern und einen Tropfen des Anästhetikums Lösung auf der Oberfläche der Hornhaut.
2. Injection zwei Personen benötigt: eine der Glaspipette in den Glaskörperraum einzufügen und zu pflegen Pipette Position, und ein anderer auf den Kolben der Spritze die gewünschte Lösung liefert drücken.
3. Unter einem Operationsmikroskop, greifen die Glasmikropipette-und Dual-RN Glas Koppler mit den Fingern. Verbreiten Sie die Augenlider mit den Fingern der freien Hand und bilden ein "V"-Form gegenüber der Injektionsstelle. Durch die Anwendung Traktion auf die Augenlider, wird das Auge aus der Augenhöhle angehoben werden, Freilegung der hinteren Fläche hinter dem Limbus. Durch die Schaffung eines "V"-Form mit den Fingern gegenüber der Injektionsstelle, ist eine Wiege für das Auge bieten Stabilität bei der Injektion gebildet.
4. Schieben Sie die Spitze des Glasmikropipette durch die Bindehaut, in einem Gebiet ohne Blutgefäße, und durch die Lederhaut, in einem Winkel nach unten. Sie sollten sich ein kleines "Plopp", wenn die Pipette dringt in die Lederhaut. Einsetzen der Pipette in einem leichten Winkel nach unten reduziert die Wahrscheinlichkeit des Schlagens das Objektiv beim Einsetzen der Nadel.
5. Die Person, die die Spritze sollte nun injizieren die 4 ul Lösung durch Drücken Sie den Kolben auf die 2 ul Markierung auf der Spritze. Die Injektion sollte etwa 1-2 Sekunden in insgesamt nehmen. Injektion mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit> 3 Sekunden reduziert die anfängliche Ausbreitung der Lösung durch den Glaskörper. Sie können auf die injizierte Lösung Spülung durch den Glaskörper unter dem Mikroskop zu sehen, damit die Überprüfung der Erfolg des Eingriffs.
6. Halten Sie die Mikropipette stetigen für ca. 5 Sekunden und dann zurücktreten, in die gleiche Richtung wie die Nadel eingeführt wurde. Die Bindehaut wird wieder Klappe über die kleine Öffnung, um so die Lederhaut-Stich-Dichtung.
7. Bedecken Sie die Oberfläche der Hornhaut mit ophthalmologischen Augensalbe (Tears Naturale PM), um Hornhaut Trocknung während der Wiederherstellung zu verhindern, und wieder das Tier zu einer Erholung Käfig.
8. Post-OP-Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden.

5. Selektives Targeting retinalen Ganglienzellen aus dem Optic Nerve Stump

1. Anwenden von Tracer-, Drogen-, Plasmide, siRNAs oder virale Vektoren zu Sehnerv Stumpf nach Axotomie, zielt direkt retinalen Ganglienzellen durch retrograden Transport. Hierzu wird zunächst der Durchführung einer Sehnerv durchtrennt nach dem "Optic Nerve Durchtrennung Protocol" ²² erreicht.
2. Es gibt zwei Methoden, um dieses Verfahren durchzuführen: mit Gelschaum oder direkte Injektion in den Sehnerv.
3. Die Gelschaum Methode ähnelt retrograde Tracing, aber bei der Auslieferung von experimentellen Behandlungen an den Sehnerv ist es wünschenswert, pre-Label der retinalen Ganglienzellen durch die Injektion retrograde Tracer in den Colliculus superior 1 Woche vor Axotomie. Dies ist für die Zell-Tracing, weil in einigen Fällen neuronale Tracer mit dem retrograden Transport von experimentellen Substanzen oder umgekehrt stören können wichtig.
4. Unmittelbar nach den Sehnerv geschnitten wird, ist ein kleines Stück Gelschaum in der experimentellen Lösung getränkt über die durchtrennten Sehnerven Stumpf gelegt. Die Orbital-Inhalte werden dann in ihre vorherige Position zurück. Wenn das Auge ist es, eine neutrale Position ist es notwendig, Pinzette verwenden, um das Stück Gelschaum hinunter in die Umlaufbahn zu drücken, dass es über das Ende des Sehnervs bleibt zurück.
5. Die Injektionstechnik ist effektiver für die Lieferung von Stoffen, die den Zugang in das Cytoplasma des Axons gewinnen müssen, um retrograd durch Axoplasmafluß transportiert werden. Dazu gehören siRNAs und Plasmide, und in einigen Fällen viraler Vektoren. A 5-10 ul Hamilton-Spritze wird verwendet, um die gewünschte Lösung in den durchtrennten Sehnerven zu injizieren.
6. Fassen Sie den Rand des Sehnervs mit feiner Spitze Dumont Pinzetten. Führen Sie das Ende der Nadel in den Sehnerv, parallel mit den Nerven, bis die Schräge nicht mehr sichtbar ist. Die eingesetzten Nadel wird auf allen Seiten umgeben sein von den Nerven. Eine Nadel mit einem kurzen Kegel ist wünschenswert.
7. Sobald die needle in den Nerven eingelegt ist, drücken Sie vorsichtig die Seiten des Nerven mit der feinen Spitze Pinzette und injizieren ein Viertel der Lösung beim Drehen der Spritze eine viertel Umdrehung im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn.
8. Weiter wiederholen Schritt 5,7 bis Sie eine vollständige Drehung der Nadel abgeschlossen haben und injiziert den gesamten Inhalt der Spritze. Für beste Ergebnisse zu injizieren insgesamt 10 ul Lösung mit einer gasdichten 10 l Hamilton-Spritze.
9. Entfernen Sie die Spitze der Spritze aus dem Nerv. Lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit injiziert, die von den Nerven in die Umlaufbahn Rückfluss erhitzt hat, da dies einen zusätzlichen Pool für die Aufnahme durch die Enden der Axone bilden wird.
10. Bringen Sie die Orbital Inhalte in ihre ursprüngliche Position, in der Nähe der Wunde, und damit das Tier sich zu erholen.
11. Post-OP-Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Intraokularen Injektionen richten sich an alle Zellen in der Netzhaut global und funktionieren gut für die Lieferung Substanzen verletzt RGCs seit Ganglienzellen in der innersten neuronalen Schicht der Netzhaut, angrenzend an den Glaskörperraum befinden. RGCs kann auch direkt durch Abgabe von Stoffen, die durchtrennten Sehnerven Stumpf ausgerichtet sein. Fluorogold retrograd markierten RGCs können gezielte Verwendung von Peptiden, Drogen, Vektoren, Plasmide oder siRNAs aus dem Nervenstumpf wie in Abbildung 1 dargestellt werden. Abbildung 1A-C zeigt die Lokalisation eines Cy3 markierte Peptid in der Somata RGCs, dass durch die Injektion in den Colliculus superior Fluorogold wurden bereits beschriftet. Cy3 markierten Peptiden wurden in den Sehnerv unmittelbar nach Axotomie injiziert, und die Netzhaut abgebildet wurde lebendig, um die Peptide aus Auslaugen des Gewebes zu verhindern während der Fixierung. 1D-F zeigt die Lokalisierung von Cy3 markierten siRNAs und die retrograde Tracer in axotomized RGCs Fluorogold. Cy3 markierten siRNAs wurden in den Sehnerv Stumpf sofort nach Axotomie injiziert, und die Netzhaut abgebildet wurde lebendig.

Abbildung 1. Epifluoreszenz Aufnahmen von RGCs in flatmounted Netzhaut an 1 Tag nach Axotomie und Injektion von entweder markierten Peptiden oder siRNAs in den Sehnerven Stumpf. (A) Fluorogold retrograde Markierung in axotomized RGCs an 1 Tag postaxotomy (B) Cy3 Fluoreszenz in RGCs folgende retrograde Transport von markierten Peptiden, 1 Tag nach Axotomie und Peptid-Injektion in den Sehnerv. (C) Überlagerung von (A) und (B) zeigen die selektive Lokalisierung von Cy3 markierten Peptiden in Fluorogold gekennzeichnet RGCs. (DF) Die Zellkörper der Fluorogold gekennzeichnet RGCs (D) sind auch mit Cy3 markiert siRNAs (E) in den Sehnerven Stumpf injiziert 24 Stunden früher als in der Überlagerung (F) gezeigt gefüllt. Maßstabsbalken in AC ist 50 pm. Maßstabsbalken in DF ist 20 um.

Discussion

Sehnerv durchtrennt ist ein hoch reproduzierbares Modell der erwachsenen ZNS-Neuron Apoptose. Die experimentelle Manipulationen in diesem Manuskript gezeigt erlauben das Studium der Mechanismen der Apoptose RGC nach der Verletzung.

Intraokularen Injektionen sind für die globale Ausrichtung der Netzhaut nützlich. Dieses Verfahren erfordert einige Übung, da es wichtig ist, dass Sie das Objektiv mit der Spitze der Glaspipette verletzen. Objektiv beschädigt wurde gezeigt, dass die Freisetzung von Wachstumsfaktoren bewirken, verändern das Überleben der Zelle und Regeneration ^{20, 21.} Es ist auch wichtig, sorgfältig zu legen und den Entzug der Glaspipette parallel zu der Richtung der Spitze. Jede seitliche Kraft auf die Spitze der Glaspipette kann eine Glasscherbe, die Glaskörperraum Beschädigung der Linse oder Netzhaut gelangen. Mit einer Pipette mit einer Spitze, die zu fein ist, kann nicht zulassen, die Lieferung von viskosen Lösungen. Darüber hinaus wird eine extrem feine Spitze nicht geben taktile Rückmeldung, wenn die Lederhaut beschädigt ist zunehmend das Risiko einer versehentlichen Punktion der Linse. Das Objektiv sollte frei von Hindernissen bleiben und frei von jeglichen Einstichstellen, wenn unter dem Mikroskop beobachtet. Wenn das Objektiv beschädigt ist, wird ein Katarakt oft Form und das Objektiv Wolke über und diese experimentellen Ergebnisse sollten ausgeschlossen werden.

Die Spritze System funktioniert am besten, wenn es keine Luftblasen an der Darm-Trakt sind. Air erweitern können und komprimieren die Verringerung der Reaktionsfähigkeit der Lösung Rückzug oder Lieferung. Wenn Luftblasen sichtbar sind, spülen Sie diese mit dem Grundieren Spritze und Mineralöl. Die Dual-RN Glas-Adapter mit Klemmringverschraubungen ermöglicht die Änderung der Pipette effiziente zwischen verschiedenen Tieren, Behandlungen, oder im Falle eines Bruchs. Dieses System ist robust und wird viele Jahre dauern, bevor die Hülsen zu ersetzen, so lange wie Pipetten sorgfältig eingesetzt werden müssen.

Direkt Targeting RGCs durch Injektion des Sehnervs ist ein ziemlich schnelles Verfahren mit ein paar Einschränkungen. Wenn der Sehnerv Stumpf zu kurz ist, macht es die Injektionen schwierig. Ein kurzer Stumpf erhöht auch die Wahrscheinlichkeit, dass die Nadel den retinalen Gefäßen in der Nähe des Sehnervs Schäden, wie sie auf das Niveau der Fase eingefügt wird. So ist ein Sehnerv Stumpf von ca. 2 mm in der Länge wünschenswert, wenn die Durchführung Nerven Injektionen mit dieser Technik. Die Injektionen am besten funktionieren, wenn die Kegel der Spritze vollständig innerhalb der Sehnerv eingeschlossen. Es ist darauf zu achten, dass die Nadelspitze durch die Seite des Nerven gehen, da dies zu einer Region mit niedrigem Widerstand, so dass Flüssigkeit in die Einstichstelle wodurch die Wirksamkeit der Injektion verlassen.

Beim Arbeiten mit potentiell infektiöses Material, wie virale Partikel oder transformierten Zellen, ist es wichtig, institutionellen Richtlinien und Sicherheitsvorschriften befolgen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT