Metoder för experimentell manipulationer efter Optic Nerve transection i Mammalian CNS

Summary

Synnerven transection är en allmänt använd modell av vuxna CNS-skada. Denna modell är idealisk för att utföra ett antal experimentella manipulationer som inriktar sig på näthinnan globalt eller direkt riktade till den skadade neuronala befolkning retinal ganglion celler.

Abstract

Retinal ganglion celler (RGC: er) är CNS-nervceller som utdata visuell information från näthinnan till hjärnan via synnerven. Synnerven kan nås inom bana i ögat och helt transected (axotomized), skära av axoner av hela RGC befolkningen. Synnerven transection är en reproducerbar modell av apoptotiska nervcellsdöd i vuxna CNS ^1-4. Denna modell är särskilt attraktiva eftersom glaskroppen kammare i ögat fungerar som en kapsel för drug delivery till näthinnan, som möjliggör experimentella manipulationer via intraokulära injektioner. Spridning av kemikalier genom glaskroppen vätska ser till att de agerar på hela RGC befolkningen. Virala vektorer, plasmider eller korta interfererande RNA (siRNA) kan även levereras till glaskroppen kammaren för att infektera eller transfektera näthinnans celler ^5-12. Den höga tropism av Adeno-associerade virus (AAV) vektorer är fördelaktigt att rikta RGC: er, med en infektion takt närmar sig 90% av cellerna i närheten av injektionsstället ^{6, 7, 13-15.} Dessutom kan RGC: er vara selektivt transfekterade genom att tillämpa siRNA, plasmider eller virala vektorer på den avskurna ändan av synnerven ^16-19 eller injicera vektorer i sitt mål den överlägsna colliculi ^10. Detta gör det möjligt för forskare att studera apoptotiska mekanismer i den skadade neuronala befolkningen utan störande effekter på andra åskådare nervceller eller omgivande Glia. RGC apoptos har en karakteristisk tid-kurs där celldöd är försenad 3-4 dagar postaxotomy, varefter cellerna snabbt urarta. Detta ger ett fönster för experimentella manipulationer som riktas mot involverade i apoptos. Manipulationer som inriktas direkt på RGC: er från transected synnerven stubbe utförs vid axotomy, omedelbart efter styckning nerven. Däremot när ämnena levereras via en intraokulär väg, de kan injiceras före operationen eller inom de första tre dagarna efter operation, före initiering av apoptos i axotomized RGC: er. I denna artikel visar vi flera metoder för experimentella manipulationer efter synnerven transection.

Protocol

1. Kirurgisk teknik

1. Experiment bör utföras med aseptisk teknik och efter protokollen djuret använda dina specifika institutionen. Instrument och material (lösningar, testa ämnen, spårämnen, nålar, etc.) kommer i kontakt med levande vävnad måste vara steril för att förhindra infektion och negativa effekter på djurens välbefinnande och potentiella negativa effekter på studien.

2. Anestesi

1. Råttor blir nedsövd med hjälp av en veterinär isofluran Vaporizer system. Använd medicinsk kvalitet syre med en hastighet av 0,8 l / min för att förånga isofluran gas. Placera djuret i den bifogade anestesi rutan och ring in en isofluran koncentration 4% tills andning har mattats och djuret är stillsam.
2. Därefter växlar gasflöde till gasmask fäste för stereotaxic ramen och placera djuret i stereotaxic apparaten. Vrid isofluran koncentrationen skall sjunka till 2% och övervaka narkos. Större djur (> 300g) kan kräva en högre koncentration av isofluran. Anestesi bör övervakas under operation och isofluran dosen justeras därefter. Djup och graden av andning bör ständigt utvärderas och tå nypa utvärdering (var 5 min) för avsaknaden av djup smärta ska utföras.
3. När operationen är klar, stäng av isofluran och låt djuret att andas syre i flera minuter innan de tas bort från stereotaxic enhet. Kroppstemperaturen bör bibehållas genom att täcka djuret med en kirurgisk filt och / eller med hjälp av en reglerad värme filt under operation.

3. Spruta Förberedelser för intraokulär injektion

1. Först monterar sprutan systemet för att utföra intraokulära injektioner. En 10 mikroliter RN Gastäta 1701 Hamilton spruta används för injektion. Ta bort alla nål eller RN mutter som finns på änden av sprutan.
2. Sätt i PFA hylsan i PEEK kopp hylsan av klämringskoppling. Sätt sedan in den fullständiga passa in i slutet av sprutan och löst skruva RN mutter över toppen.
3. Sätt i ena änden av 1 / 16 tum PEEK slang in i klämringskoppling, genom öppningen i RN muttern. Se till PEEK slangen sitter ordentligt. Dra åt RN muttern för att komprimera hylsan, försegla PEEK slang.
4. Utför steg 3,2 i båda ändarna av Dual RN glaset koppel. Anslut den fria änden av PEEK slang till ena änden av Dual RN glaset kopplet genom att dra åt RN muttern.
5. En drog glas mikropipett kommer att ligga till nål och fat för insprutningssystemet. Använd 1,5 mm YD tjocka väggar av glas kapillär slang att tillverka glaset pipetter, och sätt in glaspipett in den fria änden av Dual RN glaset koppel. Dra åt RN muttern att fixa pipetten på plats.
6. Den fina spets dras glas mikropipetter är typiskt för liten för att utföra intraokulära injektioner. För att skapa en spets av lämplig diameter, bryta spetsen av glaspipett i visuell vägledning med hjälp av en kirurgisk mikroskop. Den frostade änden av ett glas exemplar bild är väl lämpad att bryta pipett. Håll pipetten i vinkel och gnugga spetsen längs glaset glasyr för att skapa en paus. Helst ska den sista spetsen vara något avfasade. Det kan ta ett par försök att producera ett bra tips, så drar flera pipetter före användning.
7. Injektionen är hydrauliska. Därför måste sprutan, PEEK slang länkare, Dual RN glas koppel och glaset mikropipett fyllas med mineralolja före användning. Använda Grundning kit från Hamilton Spruta Co (PRMKIT), fyll priming sprutan med mineralolja. Använd en stor diameter nål för lätt passage på trögflytande olja. Byt ut nålen med Hamilton 90.030 nål som passar inuti pipan i 10 mikroliter Hamilton spruta. Placera en gummiproppen över Hamilton 90.030 nål, för att ge en säl medan injicera mineralolja.
8. Sätt Hamilton 90.030 nål i priming sprutan i baksidan av fat i 10 mikroliter Hamilton spruta av insprutningssystemet. Tryck på septum tätt mot slutet av sprutan för att skapa en säl.
9. Tryck långsamt in kolven. Du kommer att se passet mineralolja genom glaset delar av insprutningssystem, och slutligen fylla glaspipett. Skjut alla av olja genom insprutningssystem för att avlägsna eventuella luftbubblor längs tarmkanalen. Om att fylla sprutan är slut mineralolja, långsamt ut kanylen samtidigt ständigt dispenseras olja för att förhindra luft bubblor bildas. Fyll grundning sprutan och injicera igen.
10. När hela systemet är fyllt med mineralolja och bubbla fri, sätter den ursprungliga kolven i 10 mikroliter Hamilton spruta. Tryck in kolven tills slutet av sin resa för att ta bort ytterligare mineralolja från systemet. Torka glaset mikropipett ren och i slutet av sprutan ren med 70% etanol.
11. Withdraw sprutkolven till 2 mikroliter märke på pipan. I slutet av glaset mikropipett fylls med luft ger en buffertzon mellan mineralolja och önskad vätska som ska injiceras. Pipetten fat kan nu fyllas genom att placera i slutet av mikropipett i önskad lösning och dra tillbaka kolven i Hamilton sprutan. Injicera inte mer än 4-5 mikroliter av lösning till en vuxen råtta öga.

4. Intraokulär injektion Förfarande: Inriktning näthinnan Globalt

1. Med djuret bedövas och förankrad i stereotaxic ramen (som beskrivs i avsnitt 2), använd Alcaine ögondroppar till lokalt bedöva hornhinnan. Öppna ögonlocken med fingrarna och placera en droppe av bedövningsmedel lösningen på ytan av hornhinnan.
2. Injektion kräver två personer: en att sätta in glaspipett in i glaskroppen kammaren och behålla pipett position, och en annan att pressa in kolven på sprutan som levererar den önskade lösningen.
3. Enligt en kirurgisk mikroskop grepp glaset mikropipett och Dual RN glas koppling med fingrarna. Bred ut ögonlocken med fingrarna på den fria handen bildar en "V"-form mittemot injektionsstället. Genom att tillämpa dragkraft på ögonlocken, kommer ögat lyftas ut ur omloppsbana, utsätta den bakre ytan bakom limbus. Genom att skapa ett "V" formen med fingrarna mittemot injektionsstället är en vagga bildas för ögat som ger stabilitet när du injicerar.
4. För försiktigt in spetsen på glaset mikropipett genom bindhinnan, i ett område saknar blodkärl, och genom sklera, med en nedåtriktad vinkel. Du ska känna ett litet "pop" när pipetten penetrerar sklera. Sätta pipetten på en något nedåtgående vinkel minskar chansen att träffa linsen när du sätter nålen.
5. Den person som innehar sprutan ska nu injicera 4 mikroliter av lösning genom att trycka in kolven till 2 mikroliter märket på sprutan. Injektionen bör ta ungefär en till två sekunder totalt. Injektion i en mycket långsam takt> 3 sekunder minskar den initiala spridningen av lösningen genom glaskroppen kammaren. Du kommer att kunna se den injicerade lösningen rodnad genom glaskroppen kammaren under mikroskop, och därmed kontrollera procedurens framgång.
6. Håll mikropipett stadigt i ca 5 sekunder och sedan dra i samma riktning som nålen sattes in. Bindhinnan kommer luckan tillbaka över den lilla öppningen, hjälpa till att försegla skleral punktering.
7. Täck ytan av hornhinnan med oftalmologiska ögonsalva (Tears Naturale PM) för att förhindra att hornhinnan torkar under återhämtning, och tillbaka djuret till en återhämtning bur.
8. Postoperativ smärtlindring bör administreras i enlighet med riktlinjerna i din myndigheter djurvård och djur bör övervakas noggrant efter operationen.

5. Selektivt Inriktning retinal ganglion celler från synnerven Stump

1. Tillämpa spårämnen, droger, plasmider, siRNA eller virala vektorer för att synnerven stubbe, efter axotomy direkt mål retinal ganglion celler genom retrograd transport. Detta sker genom att först utföra en synnerven transection enligt "Optic Nerve transection protokoll" ^22.
2. Det finns två huvudsakliga metoder för att åstadkomma detta förfarande: med gelfoam, eller direkt injektion i synnerven.
3. Den gelfoam Metoden liknar retrograd spårning, men när levererar experimentella behandlingar på synnerven det är önskvärt att i förväg märka retinal ganglion celler genom att injicera retrograd spårämnen i överlägsen colliculi 1 vecka före axotomy. Detta är viktigt för cellen att spåra eftersom det i vissa fall neuronala spårämnen kan störa bakåtsträvande transport av experimentella ämnen eller vice versa.
4. Omedelbart efter att synnerven bryts, är en liten bit av gelfoam indränkt i den experimentella lösningen placeras över transected synnerven stubbe. Den orbital innehåll återvände sedan till sina tidigare läge. När ögat är tillbaka till en neutral position är det nödvändigt att använda pincett för att driva bit gelfoam ner i omloppsbana, se till att det fortfarande är över i slutet av synnerven.
5. Injektionen tekniken är mer effektiv för leverans av ämnen som måste få tillgång till cytoplasman av axonet för att retrogradely transporteras med axoplasmic flöde. Detta inkluderar siRNA och plasmider, och i vissa fall virala vektorer. En 5-10 mikroliter Hamilton spruta används för att injicera den önskade lösningen i transected synnerven.
6. Ta tag i kanten av synnerven med fin spets Dumont pincett. Sätt i änden av nålen i synnerven, parallellt med nerv, tills avfasning inte längre syns. Den infogade Nålen kommer att vara inneslutna på alla sidor av nerven. En nål med en kort avfasad är önskvärt.
7. När needle sätts in i nerven, tryck försiktigt på sidorna av nerv med fin spets pincett och injicera en fjärdedel av lösningen när du roterar sprutan ett kvarts varv medsols eller motsols.
8. Fortsätt upprepa steg 5,7 tills du har en full rotation av nålen och injiceras hela innehållet i sprutan. För bästa resultat injicera totalt 10 mikroliter av lösningen med en gastät 10 mikroliter Hamilton spruta.
9. Ta bort spetsen på sprutan från nerven. Låt överskottet injicerade vätska som har refluxed från nerven i omloppsbana eftersom detta kommer att utgöra en extra pool för upptag i ändarna av axoner.
10. Returnera orbital innehållet till sitt ursprungliga läge, nära såret och låta djuret att återhämta sig.
11. Postoperativ smärtlindring bör administreras i enlighet med riktlinjerna i din myndigheter djurvård och djur bör övervakas noggrant efter operationen.

6. Representativa resultat:

Intraokulära injektioner rikta alla celler i näthinnan globalt, och fungerar bra för leverans ämnen skadade RGC: er eftersom ganglion celler ligger i den innersta neuronala lagret av näthinnan, som gränsar till glaskroppen kammaren. RGC: er kan också direkt riktade genom att leverera ämnen till transected synnerven stubbe. Fluorogold retrogradely märkt RGC: er kan riktas med hjälp av peptider, droger, vektorer, plasmider, eller siRNA från nerven stubben som visas i figur 1. Figur 1A-C visar lokalisering av en märkt Cy3 peptid i somata av RGC: er som var före-märkt genom att injicera Fluorogold i överlägsen colliculi. Cy3 märkt peptider skulle sprutas in i synnerven omedelbart efter axotomy, och näthinnan var avbildas vid liv i syfte att förhindra att peptider från utlakningen av vävnaden under fixeringen. Figur 1D-F visar lokalisering av Cy3 märkt siRNA och bakåtsträvande spårämne Fluorogold i axotomized RGC: er. Cy3 märkt siRNA var injiceras i synnerven stubben omedelbart efter axotomy, och näthinnan var avbildade levande.

Figur 1. Epifluorescence micrographs av RGC: er i flatmounted näthinnor på 1 dag efter axotomy och injektion av antingen märkta peptider eller siRNA in i synnerven stubben. (A) Fluorogold bakåtsträvande märkning i axotomized RGC: er på 1 dag postaxotomy (B) Cy3 fluorescens i RGC: er efter retrograd transport av märkt peptider, en dag efter axotomy och peptid injektion i synnerven. (C) överlagring av (A) och (B) visar den selektiva lokalisering av Cy3 märkt peptider i Fluorogold märkta RGC: er. (DF) Cellen organ Fluorogold märkt RGC: er (D) är också fyllda med Cy3 märkt siRNA (E) sprutas in i synnerven stubben 24 timmar tidigare, vilket framgår av overlay (F). Skala bar i AC 50 ìm. Skala bar i DF är 20 mikrometer.

Discussion

Synnerven transection är en mycket reproducerbar modell för vuxna CNS-neuron apoptos. Den experimentella manipulationer visas i detta manuskript möjliggöra studier av mekanismer RGC apoptos efter skada.

Intraokulära injektioner är användbara för global inriktning av näthinnan. Denna procedur kräver lite övning, eftersom det är avgörande att inte skada linsen med spetsen på glaspipett. Lens skada har visat sig orsaka utsläpp av tillväxtfaktorer, ändra cellöverlevnad och förnyelse ^{20, 21.} Det är också viktigt att noga sätta in och ta den parallella glaspipett att riktningen på spetsen. Alla lateral kraft på toppen av glaset pipetten kan orsaka ett glas fragment att komma in i glaskroppen kammaren skada linsen eller näthinnan. Med hjälp av en pipett med spets som är för bra får inte tillåta leverans av trögflytande lösningar. Dessutom ger en mycket fin spets inte taktil återkoppling när sklera punkteras ökar risken för misstag punktering linsen. Objektivet bör förbli klar och fri från alla punktering märken när observeras i mikroskop. Om linsen är skadad, kommer en grå starr bildar ofta och linsen blir immig och dessa experimentella resultat bör uteslutas.

Sprutan systemet fungerar bäst när det inte finns några luftbubblor längs tarmkanalen. Luft kan expandera och komprimera minska lyhördhet lösningen uttag eller leverans. Om luftbubblor är synliga, spola dem med priming spruta och mineralolja. Dual RN glas adapter med klämringskoppling gör ändrar pipetten effektivt mellan olika djur, behandlingar, eller i händelse av ett brott. Detta system är robust och kommer att pågå i många år innan holkarna behöver bytas, så länge pipetter noggrant ska införas.

Direkt inriktning RGC: er genom att injicera synnerven är en ganska snabb procedur med några varningar. Om synnerven stumpen är för kort, gör det injektionerna svårt. En kort stubbe ökar också chansen att nålen skadar näthinnans blodkärl nära papillen som det förs in för att nivån på avfasning. Således är en synnerven stump på ca 2 mm lång önskvärt när du utför nerv injektioner med denna teknik. Injektionerna fungerar bäst när avfasningen i sprutan är helt innesluten i synnerven. Man måste vara försiktig att inte passera nålspetsen genom sidan av nerven som detta skapar en region med låg resistans, vilket gör att vätska för att avsluta injektionsstället därmed minskar effektiviteten i injektion.

När du arbetar med potentiella biologiska risker som viruspartiklar eller omvandlas celler är det viktigt att följa de institutionella riktlinjer och säkerhetsföreskrifter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT