Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Summary

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Abstract

Biofilms zijn zeer dynamisch, georganiseerd en gestructureerd gemeenschappen van microbiële cellen verstrikt in een extracellulaire matrix van de variabele dichtheid en samenstelling ^{1, 2.} In het algemeen, biofilms ontwikkelen van de eerste microbiële beslag op een oppervlak gevolgd door de vorming van cel-clusters (of microkolonies) en de verdere ontwikkeling en stabilisatie van de microkolonies, die voorkomen in een complexe extracellulaire matrix. De meerderheid van de biofilm matrices haven exopolysacchariden (EPS), en tandheelkundige biofilms vormen hierop geen uitzondering, vooral die in verband met cariës ziekte, die meestal gemedieerd door mutans streptococcen ^3. De EPS worden gesynthetiseerd door micro-organismen (S. mutans, een belangrijke bijdrage levert) door middel van extracellulaire enzymen, zoals glucosyltransferases gebruik van sucrose in de eerste plaats als substraat ^3.

Studies van biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn bijzonder uitdagend vanwege hun constante blootstelling aan milieu-uitdagingen in verband met complexe dieet-host-microbiële interacties die voorkomen in de mondholte. Beter begrip van de dynamische veranderingen van de structurele organisatie en de samenstelling van de matrix, fysiologie en transcriptoom / proteoom profiel van biofilm-cellen in reactie op deze complexe interacties verder zou vooraf de huidige kennis van hoe orale biofilms moduleren pathogeniteit. Daarom hebben we een analyse-tool-box om biofilm analyse te vergemakkelijken op structureel, biochemisch en moleculair niveau door een combinatie van algemeen beschikbare en nieuwe technieken met op maat gemaakte software voor data-analyse. Standaard analytische (colorimetrische assays, RT-qPCR en microarrays) en nieuwe fluorescentie technieken (voor simultane etikettering van bacteriën en EPS) werden geïntegreerd met specifieke software voor data-analyse van de complexe aard van de orale biofilm onderzoek adres.

De tool-box bestaat uit 4 verschillende, maar onderling verbonden stappen (figuur 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data-ingang, 3) Data Processing, en 4) data-analyse. We gebruikten onze in vitro biofilm-model en de specifieke experimentele omstandigheden op het nut en de flexibiliteit van de tool-box aan te tonen. De biofilm-model is eenvoudig, reproduceerbare en meerdere herhalingen van een enkel experiment kunnen gelijktijdig ⁴ worden ^{gedaan, 5.} Bovendien, is het mogelijk tijdelijk de evaluatie, de opname van verschillende micro-organismen ⁵ en beoordeling van de effecten van de verschillende experimentele condities (bijvoorbeeld behandelingen ^6; vergelijking van de knock-out mutanten vs ouderlijke stam ^5; koolhydraten beschikbaarheid ^7). We beschrijven hier twee specifieke onderdelen van de tool-box, waaronder (i) nieuwe software voor microarray data mining / organisatie (MDV) en fluorescentie beeldvorming analyse (DUOSTAT), en (ii) in situ EPS-labeling. We bieden ook een experimentele geval zien hoe de tool-box kan u helpen met biofilms analyse, data-organisatie, de integratie en interpretatie.

Protocol

1. STAP 1 - bioassays

De biofilm methode maakt gebruik van schijven van hydroxyapatiet (HA) als tand surrogaat (Clarkson Chromatography Products, Inc, Zuid-Williamsport, PA, USA; oppervlak = 2,7 ± 0,2 cm ²⁾ bedekt met speeksel (het nabootsen van de aanwezigheid van pellicle), geplaatst in een verticale positie ^{4, 5, 8.}

1. Biochemische assays.
   1. De biofilms zijn ofwel (i) gehomogeniseerd door sonicatie ⁹ of (ii) blijven intact voor de biochemische assays ^8. Het gehomogeniseerde biofilms suspensie kan worden gebruikt voor de bepaling van de biomassa (droge gewicht), totaal eiwit, anorganische, en extracellulaire en intracellulaire polysacchariden samenstelling / inhoud (zie details in Lemos et al.., Protocollen bij de Fysiologie van de orale biofilms ⁸ Study). De intacte biofilms kunnen worden geanalyseerd op hun fysiologische reacties met behulp van standaard glycolytische pH-daling, zuur-doden, proton permeabiliteit en F-ATPase activiteit assays (zie details in Lemos et al.., Protocollen bij de Fysiologie van de orale biofilms ⁸ Study).
2. Transcriptoom analyses.
   1. Standaard cDNA microarray en RT-qPCR protocollen (bijvoorbeeld http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) kunnen worden gebruikt in combinatie voor de bepaling van transcriptoom-respons van specifieke pathogenen (bv. S. mutans) binnen de biofilms aan diverse milieu-en therapeutische uitdagingen in de verschillende ontwikkelingsstadia ^{6, 7, 10, 11.} In de gereedschapskist, hebben we twee methoden die essentieel zijn voor het transcriptoom analyse van tandheelkundige biofilms: 1) de kwaliteit RNA (vanwege het heterogene karakter van biofilm bevolking en de aanwezigheid van EPS-matrix), en 2) data mining en interpretatie (als gevolg van grote dataset gegenereerd door middel van microarray).
      • RNA isolatie. Om de kwaliteit kwestie van RNA geëxtraheerd uit biofilms adres, gebruiken we een geoptimaliseerd protocol speciaal ontwikkeld voor RNA-isolatie en zuivering van bacteriële cellen verstrikt in EPS-rijke matrix ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). Dit protocol biedt RNA Integriteit Number (RIN) hoger dan 8,5, die wordt beschouwd als optimaal is voor transcriptoom analyse met behulp van zowel de RT-qPCR en Microarrays (voor voorbeelden, zie ^{6, 11).}
3. Fluorescentie Imaging. Structurele organisatie van biofilms.
   1. Het merendeel van de confocale fluorescentie beeldvorming protocollen die beschikbaar zijn in de literatuur richt zich op de microbiële etikettering. De analyse van EPS als een belangrijke component van de biofilm is grotendeels verwaarloosd in de orale biofilm onderzoek met fluorescentie beeldvorming, op enkele uitzonderingen na ^{5, 13, 14.} We hebben een nieuwe etikettering van techniek en specifieke software voor reproduceerbare visualisatie en kwantificatie van EPS en bacteriële cellen tegelijkertijd binnen intact biofilms. Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlijn, Duitsland) wordt gebruikt voor de 3D-reconstructie van de biofilms, terwijl COMSTAT (verkrijgbaar bij http://www.imageanalysis.dk) en DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) de kwantitatieve analyse.
      1. Beeldvorming van de structurele organisatie van de EPS-bacteriën in biofilms. De Alexa Fluor 647-gelabeld dextraan conjugaat wordt gebruikt om de EPS-matrix te visualiseren. De fluorescent gelabelde dextran dient als een primer voor streptokokken glucosyltransferases-gtfs (in het bijzonder GtfB en GtfC), en kunnen gelijktijdig worden opgenomen tijdens de exopolysaccharide matrix synthese in de loop van de biofilm ontwikkeling ^11.
         
         EPS etikettering:
         1. Laag hydroxyapatiet schijven met filter-gesteriliseerd speeksel voor 1 uur, naar aanleiding van de "Biofilm Preparation" protocol ^8.
         2. Pipetteer 2,8 ml van de cultuur medium in elke well van de 24 putjes, en breng aan een donkere kamer.
         3. Voeg 1 uM van dextran geconjugeerde Alexa Fluor in kweekmedium, mix kleurstof in kweekmedium door en neer te pipetteren (ongeveer 10 keer).
         4. Dip-wash van de speeksel-gecoate HA (SHA) discs (na 1 uur incubatie) twee keer in steriele buffer AB en plaats ze in het medium met dextran geconjugeerde Alexa Fluor.
         5. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer bij 37 ° C, 5% CO _2. De duur van de incubatietijd is afhankelijk van elke experimentele design. De fluorescent gelabelde dextran maakt geen vlekken de bacteriële cellen bij concentraties die in deze alszeggen ^11. Andere EPS-kleuringen technieken, zoals met Calcofluor ^14, kan worden gebruikt in combinatie.
      2. Bacteriën etikettering:
         1. Bacteriën componenten in biofilms zijn gelabeld aan het einde van de biofilmvorming met behulp van standaard tl-nucleïnezuur vlek (bijv. SYTO 9); andere fluorescentie technieken (bv. soorten specifieke fluorescent gelabelde antilichamen ¹⁵ of GFP-expressie brengende cellen ¹⁶⁾ kan natuurlijk worden gebruikt om de detecteren van een of meer bacteriële soorten in de biofilms. Figuur 2 toont gelijktijdige vermelding van EPS (rood) en bacteriën / microkolonies (groen) in een 3D-beeld van een 24-h oude S. mutans biofilm gevormd op het oppervlak van een SHA disc.
         2. Afbeeldingen overname: Elke biofilm wordt gescand bij 5 tot 10 willekeurig gekozen posities, en de Z-serie worden gegenereerd door optische sectie bij elk van deze posities door een laser scanning confocale microscopie met behulp van standaard protocollen. We maken gebruik van een Olympus FV 1000 twee-foton microscoop (Olympus, Tokyo, Japan) zijn uitgerust met x10 (Zeiss Carl; numerieke apertuur 0.45; werkafstand 3-4 mm) of x25 (Olympus LPlan N; NA 1,05, WD 2 mm) water onderdompeling doelstellingen. De excitatie golflengte is 810 nm en emissie golflengte filter voor SYTO 9 (bacteriën) is 495/540 OlyMPFC1 filter, terwijl het filter voor Alexa Fluor 647 (EPS) is HQ655/40M-2P filter. Op te slaan en op te slaan RAW-afbeeldingen.

2. STAP 2 - RAW DATA INPUT

Invoer ruwe gegevens van biochemische en RT-qPCR assays direct in Raw Data File (RDF-MS Excel-bestand). Voor microarrays data, laden single-channel beelden van de gescande dia's in JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) of vergelijkbare software. Maak een plek rooster volgens JCVI specificaties en vervolgens handmatig aan te passen aan alle plekken binnen het raster past. Meet de intensiteit waarden van elk plekje en op te slaan in ". MEV" bestanden en opgeslagen in "Raw Microarray gegevens".

3. STAP 3 - INFORMATICA

Organiseren van de ruwe data (biochemische en RT-qPCR) in de RDF voor statistische analyse. Transfer ze in 'die worden verwerkt File "(DPF - MS Excel-bestand). Voor microarray en fluorescentie beeldvorming analyse, zijn specifieke software (die momenteel beschikbaar zijn en op maat gemaakt) wordt gebruikt om de gegevens te verwerken.

1. Microarray data:
   1. Indienen van de ruwe data gegenereerd in stap 2 (opgeslagen in het "Raw Microarrays gegevens") om data normalisatie stap met behulp van specifieke software. Normaliseren gegevens met behulp van de JCVI microarray data analyse software MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Gebruik LOWESS en de standaarddeviatie regularisatie met de standaard instellingen, gevolgd door in-slide herhaalde analyse. Sla de bestanden met de genormaliseerde data. Op dit moment (ruwe data bestanden en genormaliseerd data bestanden klaar), stort microarray data in een openbare toegankelijke database (bijv. NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database op http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), en noteer de toetreding nummer voor toekomstig gebruik.
2. Fluorescentie beeldvorming gegevens
   1. Biofilm structuur kwantificering.
      1. De kwantitatieve gegevens overeenkomt met elke structurele component (EPS en bacteriën) van biofilms wordt berekend door COMSTAT en de nieuw ontwikkelde DUOSTAT, die als script geschreven in MATLAB 5.1. De ruwe fluorescentie beelden worden geupload in de software en geanalyseerd als volgt:
         • Gebruik COMSTAT van biomassa, dikte, laag distributie en andere parameters die te kwantificeren en karakteriseren van de driedimensionale structuur van biofilms (zie de handleiding op http://www.imageanalysis.dk) te berekenen.
         • Gebruik DUOSTAT aan de co-lokalisatie van twee biofilm componenten, zoals EPS en bacteriën (of andere micro-organismen en / of extracellulaire componenten) te berekenen:
           1. Stel het pad van DUOSTAT in MATLAB 5.1, en open imago mappen waarin de beelden van de twee biofilm componenten omvatten.
           2. Kies de twee kanalen die zullen worden gecorreleerd en geanalyseerd. De twee stapels foto moet ook dezelfde pixel maten in alle drie dimensies (x, y, z), en hetzelfde aantal beelden in elke stapel.
           3. Stel drempels voor elk kanaal volgens de manUAL van COMSTAT. Volg de instructies in de software operatie interface (zie video artikel; DUOSTAT handleiding op http://www.imageanalysis.dk). Voer de gegevens die zijn verkregen in de DPF. Zie voorbeeld in figuur 4.4.
      2. Drie-dimensionale reconstructie biofilms.
         1. De drie-dimensionale architectuur van de biofilms wordt gevisualiseerd met behulp van Amira. Importeer de fluorescentie beelden die zijn opgeslagen in de "Raw Images Folder" in de software, en het gebruik Voltex en iso-oppervlak rendering tot 3-D-renderings van elk van de componenten te creëren in de biofilms (zie de handleiding op Amira http://www.amira.com / documentatie / manuals-and-release-notes.html). Zie voorbeeld op Figuur 4.4.

4. STAP 4 - DATA ANALYSE

De kwantitatieve gegevens van biochemische, RT-qPCR en COMSTAT-DUOSTAT assays in het DPF zijn klaar voor statistische analyse. Na de statistische analyse is uitgevoerd, kan grafieken en / of tafels worden aangelegd (zie "representatieve resultaten" sectie).

1. Microarray data organisatie met behulp van software microarray data Visualizer (MDV).

Vanwege de complexiteit en de uitvoer van grote hoeveelheden gegevens bij het ​​gebruik van microarrays en meerdere experimentele omstandigheden, ontwierpen we een data mining en organisatie software genaamd microarray data Visualizer (MDV) ⁷ (beschikbaar op http://www.oralgen.lanl.gov/) .

Na het uitvoeren van de statistische analyse met BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) met een cutoff P-waarde van 0,001 voor klasse voorspelling en voor klasse vergelijking, kan de gegenereerde gegevens worden ingediend naar MDV, als volgt:

1. Met behulp van Excel, zetten de BRB gegevens in MDV door tabs gescheiden tekstbestanden. Verwijder alle brieven die komen met de Gene Locus Tag nummer, bijvoorbeeld: SMU.1423c, verwijdert u de letter "c".
2. Open MDV. Ga naar Bestand en kies "Select Annotation Source". Kies "Flat File". Wanneer u het dialoogvenster, gebruik de Browse-knoppen om de bestanden met annotatie voor gen naam, Gene Ontology (GO) nummer, wandelpad, en functionele classificatie data te kiezen.
3. Ga naar Bestand en import van elk van de bestanden van punt 1. Elk van de dossiers vertegenwoordigt de experimentele omstandigheden voor analyse. Als er meerdere voorwaarden voor analyse, bijvoorbeeld twee verschillende behandelingen (behandeling 1 en 2) en controle (voertuig) ga naar punt 4.
4. In dit geval is de mogelijke vergelijkingen zijn: (A) behandeling 1 versus controle (voor de genen die differentieel tot expressie gevolg van de behandeling 1); (B) behandeling 2 versus controle, en (C) behandeling 1 vs behandeling 2. Afhankelijk van de werkhypothese, kunnen verschillende set genen worden geselecteerd.
5. Selecteer alleen genen die differentieel tot expressie in vergelijking A (unieke genen beïnvloed door de behandeling een only). In dit geval gebruik maken van de Trek-functie van de ingestelde functies menu. Trek de genen van vergelijking B van A, en het resultaat opslaan. Vervolgens trekt C van het resulterende gegevens. Dezelfde acties kan worden gedaan om alleen de genen in B (unieke genen beïnvloed door de behandeling 2 alleen) te krijgen.
6. Als u alleen de genen gedetecteerd in zowel de A en B, het gebruik van de Unie functie van het ingestelde functies menu om de uitkomst voor vergelijkingen A en B te combineren, en het resultaat op te slaan. Dan trekt u C van het resultaat data.
7. Deze acties kunnen worden gevisualiseerd met behulp van Venn-diagram, featured in MDV, dat is meer intuïtief en faciliteert hypothese-gedreven data organisatie. Het Venn-diagram data-uitgang worden weergegeven in het scherm (zie het scherm weer te geven in figuur 3 en video-artikel).
   
8. Voor het opslaan van de gegevens op door tabs gescheiden tekstbestanden, gaat u naar Bestand en kies Exporteren.
9. Exporteer de tab-gescheiden tekstbestanden. Open ze met behulp van Excel, en het organiseren van de data output van de MDV in tabellen en / of verborgen om een ​​grafische weergave (zie de figuren 4.2, 4.3 en video-artikel).

5. Representatieve resultaten

Hier geven we een voorbeeld van hoe de analytische tool-box integreert de verschillende testen van een biofilm studie met meerdere variabelen en de experimentele omstandigheden.

Experimentele geval:

Dynamiek van Streptococcus mutans transcriptoom in reactie op zetmeel en sucrose tijdens de biofilm ontwikkeling ^7.

Achtergrond:

De interacties van dieet zetmeel en sucrose met host speeksel amylase en streptokokken glucosyltransferases kunnen bijdragen tot de vorming en de virulentie van S. mutans in biofilms door behouAsing exopolysacchariden synthese, suiker metabolisme en acidogenicity ^11. Dit complex gastheer-pathogeen-dieet interactie kan moduleren de vorming van pathogene biofilms met betrekking tot cariës ziekte. Wij hebben een uitgebreide biochemische en transcriptoom analyse (met inbegrip van hele genomic profiling) om verder te begrijpen hoe S. mutans reageert op zetmeel en sucrose in verschillende stadia van de biofilm ontwikkeling in de aanwezigheid van amylase ^7.

De analytische tool-box werd gebruikt om ons te helpen bij de integratie van de biochemische en moleculaire testen van biofilms gevormd onder verschillende experimentele omstandigheden en tijdstippen. De algehele gegevens uitvoeren met behulp van de analytische tool-box wordt gepresenteerd in een sequentieel wijze in Figuur 4 (4.1 tot 4,4). Het is opmerkelijk dat de grote nadruk ligt hier is om aan te tonen het nut van de tool-box in plaats van data-interpretatie en discussie.

1. Het combineren van de biochemische en RT-qPCR assays om de experimentele condities voor verdere analyse-microarrays te selecteren. Aanvankelijk testten we 6 verschillende sucrose en 5 verschillende zetmeel en sucrose combinaties om de optimale concentraties van de koolhydraten voor biofilms ontwikkeling selecteren door S. mutans gebruik van onze in vitro model. De mogelijkheid om tegelijkertijd te onderzoeken van de data-uitgang van de bioassays begeleidde ons bij de keuze van drie specifieke concentraties (gemarkeerd in figuur 4.1), gebaseerd op (verhoogde) bedrag van de onoplosbare exopolysacchariden en (verhoogde) expressie van gtfB (verantwoordelijk voor onoplosbaar glucansyntheseremmers) in de biofilms .
2. Microarray analyse. De geselecteerde (drie) concentraties van de voeding koolhydraten werden gebruikt om biofilms vormen, die verwijderd werden op bepaalde tijdstippen als gevolg van de verschillende stadia van biofilms ontwikkelingsproces. De biofilms (verdeeld in drie experimentele groepen en 4 time-punten) werden onderworpen aan transcriptoom analyse door het combineren van gehele genomische profilering (cDNA microarrays) met BRB-Array Tools en MDV.
   
   Het RNA werd geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van biofilm-specifiek protocol ^12, en vervolgens onderworpen aan analyse microarray door middel van de vier stap-proces van de Analytische Tool-Box. Figuur 4.2 laat zien hoe de MDV bijgedragen aan de genen van belang selecteren op basis van onze werkhypothese dat sucrose en zetmeel combinatie van specifieke transcriptionele respons geassocieerd met een verhoogde virulentie (cariogene potentieel) van S. triggers mutans in biofilms. De ruwe gegevens die door BRB-ArrayTools (figuur 4.2a) werd verwerkt door het gebruik van de MDV Venn Diagram (figuur 4.2b). In deze studie, de groep van genen betrokken bij onze hypothese zijn die differentieel tot expressie in vergelijking A (0,5% sucrose + 1% zetmeel vs 1% sucrose) en B (0,5% sucrose + 1% zetmeel vs 0,5% sucrose), maar niet de genen in vergelijking C (0,5% sucrose vs 1% sacharose) (figuur 4.2a en 4.2b). Zoals weergegeven in figuur 4.2c, de MDV sterk verminderde het totale aantal genen te analyseren en tegelijkertijd gefilterd-out van de genen die niet direct verband houden met de invloed van sucrose en zetmeel in combinatie. De MDV data-uitgang is ook omgezet in een grafische weergave waarin de gegevens georganiseerd door de functionele klasse van elk van de genen die differentieel tot expressie (up-en down-gereguleerd) in het zetmeel + sucrose-biofilms (versus sucrose volwassen biofilms) bij elke van de 4 keer-punten (figuur 4.3). De MDV software is gebruiksvriendelijk en faciliteerde de mijnbouw / organisatie van de grote en complexe data sets van onze microarray experimenten.
3. . Biofilm beeldvorming gelijktijdig, de structurele organisatie van de biofilms werd geanalyseerd met behulp van COMSTAT-DUOSTAT-Amira die in de tool-box (zie een voorbeeld van de 3D ​​reconstructie en kwantitatieve analyse van het zetmeel + sucrose-grown biofilm in figuur 4.4, zie ook video artikel). De morfologie, distributie en structurele relatie van EPS en microkolonies kunnen worden gevisualiseerd met behulp van 3D-oppervlak rendering door Amira. Close-up beelden van de geselecteerde gebied kan worden gegenereerd, die illustreert specifieke bacteriën-EPS structurele relaties op de microschaal (figuur 4.4). Bovendien kan dezelfde set van confocale beelden worden verwerkt door COMSTAT-DUOSTAT voor biomassa / microcolony metingen, ruimtelijke verdeling en colocalization van bacteriën cellen en EPS tegelijk. Zo werd de verticale verdeling van EPS en bacteriën van disc oppervlak tot vloeistof-fase berekend op basis van alle optische gedeelte van de drie-dimensionale beelden met behulp van confocale biofilm COMSTAT-DUOSTAT (grafiek in figuur 4.4;. Zie de video artikel). De gegevens tonen een hoger aandeel van EPS (rode lijn) dan bacteriën (groene lijn) over de biofilms diepte. Bovendien zijn de meeste van de bacteriële cellen gekoppeld aan EPS (blauwe lijn), vooral in de middelste en buitenste lagen van de biofilm. Deze observatie geeft aan dat biofilms gekweekt in zetmeel en sucrose zijn bijzonder rijk aan exopolymers, die zijn kieuwnet verstrikt raken (in close-contact met) het merendeel van de bacteriële cellen, zoals structurele organisatie verbetert de stabiliteit en de cohesie van de biofilms ^13. De drie-dimensionale renderings en ​​kwantitatieve metingen van confocale beelden bieden extra informatie over de structuur van de biofilm, die de biochemische en genexpressie data een aanvulling op (verhoogde GtfB-type onoplosbare-glucan synthese door S. mutans in zetmeel + sucrose-grown biofilms) (voor meer voorbeelden te zien ^{5, 6, 11, 13).}
   
   De Analytische Tool-Box ons geholpen te verkrijgen, te organiseren en de gegevens te integreren van verschillende bioassays, die een uitgebreide analyse van de manier waarop S. voorzien mutans kunnen inspelen op complexe veranderingen in het milieu als gevolg van een dieet-gastheer interacties in de mondholte (zie details in Klein et al., 2009 ^11;.. Klein et al., 2010 ^7).

Figuur 1. Flow-chart van de Analytische Tool-Box voor Biofilm Analysis.

Figuur 2. Confocale fluorescentie beeldvorming van EPS en bacteriën in biofilms. Gelijktijdige weergave van EPS (rood) en bacteriën / microkolonies (groen) in de drie-dimensionale weergave van Streptococcus mutans biofilm gevormd op SHA-schijf oppervlak.

Figuur 3. Microarray Data Mining en Organisatie Met behulp van microarray data Visualizer (MDV) Software. Gebruik van de Venn-diagram functie te selecteren uit genen van belang, en gevolgd door de toevoeging van gen naam en de functionele klasse annotatie.

Figuur 4.1. Evaluatie van biofilmvorming door S. mutans met behulp van biochemische assays (A) en RT-qPCR (B). De INS (onoplosbaar exopolysacchariden) gegevens correleren goed met het patroon van gtfB expressie, en met de biomassa van de biofilms. Saccharose bij 1% was de concentratie voor een maximale INS vorming, gtfB expressie en biofilm accumulatie op het SHA oppervlak terwijl 0,5% sucrose was de minimale concentratie die nodig is voor een optimale ontwikkeling van biofilm met behulp van onze in vitro model. S. mutans cellen gekweekt in de aanwezigheid van 0,5% sucrose + 1% zetmeel leverde de hoogste biomassa, en presenteerde meer INS dan andere biofilms, die correleerden met een verbeterde gtfB expressie (B2). Deze koolhydraten concentraties werden geselecteerd voor verdere transcriptoom analyse.

Figuur 4.2. Microarray data analyse met behulp van BRB-Array Tools gebruiken in combinatie met de MDV-software. a) vertegenwoordigen het aantal genen gedetecteerd als differentieel tot expressie in elke vergelijking (A, B of C) en tijdstip geëvalueerd met behulp van BRB-Array Tools. b) microarray data Visualizer (MDV) met behulp van de Venn-diagram aan genen van belang te kiezen. c) Genen geselecteerd op basis van MDV-analyse.

Figuur 4.3. S. mutans genen die differentieel uitgedrukt in zetmeel + sucrose-biofilms (versus sucrose-biofilms) op verschillende tijdstippen georganiseerd door de functionele klasse. Gene aantekeningen zijn gebaseerd op informatie die door het Los Alamos National Laboratory (www.oralgen.lanl.gov) of door gepubliceerde literatuur beschikbaar op dezelfde website.

Figuur 4.4. Driedimensionale rendering en COMSTAT-DUOSTAT analyse van zetmeel + sucrose-biofilm.

Discussion

In deze presentatie hebben we aangetoond dat twee cruciale onderdelen van de Analytische Tool-Box (EPS / bacteriën imaging en microarray data mining / verwerking), de veelzijdigheid en het nut van de verschillende testen geïntegreerd in het systeem. Het is duidelijk dat de tool-box vergemakkelijkt de uitgebreide (vergelijkende) en gelijktijdige analyse van de verschillende aspecten van de biofilms biochemie, architectuur en genexpressie in reactie op de verschillende experimentele condities met behulp van een in vitro model. ⁷ Gezien de dynamische en complexe veranderingen van de structurele organisatie, fysiologische en transcriptoom reacties van S. mutans (en andere ziekteverwekkers) in biofilms, zou een geïntegreerde analyse helpen om verder te begrijpen hoe biofilms pathogeniteit moduleren in de mondholte. We zijn momenteel de integratie soortspecifiek etikettering en metagenomic / metaprotemic analyse in de Analytische Tool-Box, die de mogelijkheid te onderzoeken in meer detail de complexe ecologische interacties en structurele veranderingen in onze mixed-species biofilms model te vergroten. ⁵

Bovendien is deze tool (en al de bioassays) is flexibel, uit te breiden met add-ons (zoals metaproteome en hard-oppervlakte-analyse, in uitvoering) en kan worden aangepast / aangepast voor toepassingen buiten van orale biofilm onderzoek. Kan bijvoorbeeld de MDV bijzonder nuttig zijn voor andere biofilm gebieden die verband houden met behulp van whole-genome profilering voor de vergelijking van meerdere experimentele condities, zoals vergelijkende transcriptoom-van verschillende (mutant) stammen of in antwoord op therapeutische middelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran conjugated alexa 647	Invitrogen	D22914
Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope	Olympus Corporation