En analytisk verktygslåda för omfattande biokemiska, struktur-och transkriptom Utvärdering av Oral Biofilmer medieras av mutans streptokocker

Summary

Biofilmer som bildas på tandytan är mycket komplexa och utsätts för ständiga medfödda och exogena miljöutmaningar, som modulerar sin arkitektur, fysiologi och transkriptom. Vi utvecklade en verktygslåda för att undersöka sammansättning, strukturella organisation och genuttryck av oral biofilm, som kan anpassas till andra delar av biofilm forskning.

Abstract

Biofilmer är mycket dynamiska, organiserat och strukturerat samhällen av mikrobiella celler insnärjd i ett extracellulärt matrix av varierande densitet och sammansättning ^{1, 2.} I allmänhet biofilmer utveckla från mikrobiell kvarstad på en yta följt av bildandet av cellens kluster (eller microcolonies) och ytterligare utveckling och stabilisering av microcolonies, som förekommer i en komplex extracellulärt matrix. Majoriteten av biofilm matriser hamnen exopolysaccharides (EPS), och dentala biofilmer är inget undantag, speciellt de som förknippas med karies sjukdom, som oftast förmedlas av mutans streptokocker ^3. EPS syntetiseras av mikroorganismer (S. mutans, en viktig bidragsgivare) med hjälp av extracellulära enzymer, såsom glucosyltransferases använda sackaros i första hand som underlag ^3.

Studier av biofilmer som bildas på tandytan är särskilt utmanande på grund av deras ständiga exponering för miljömässiga utmaningarna i samband med komplexa kost-host-mikrobiella interaktioner som sker i munhålan. Bättre förståelse av de dynamiska förändringar av den strukturella organisationen och sammansättningen av matrisen, fysiologi och transkriptom / Proteome profil av biofilm-celler som svar på dessa komplexa samspel skulle ytterligare flytta fram kunskapen om hur orala biofilmer modulera patogenicitet. Därför har vi utvecklat ett analysverktyg-box för att underlätta biofilm analys på strukturell, biokemisk och molekylär nivå genom att kombinera vanliga och nya tekniker med skräddarsydd programvara för dataanalys. Standard analytiska (kolorimetriska tester, RT-qPCR och microarrays) och nya fluorescens tekniker (för samtidig märkning av bakterier och EPS) var integrerade med särskild programvara för dataanalys för att hantera komplicerade muntliga biofilm forskning.

Den verktygslåda består av fyra separata men sammanhängande steg (Figur 1): 1) biologiska testsystem, 2) Rå inmatning av data, 3) Data Processing, och 4) analys av data. Vi använde våra in vitro biofilmen modell och speciella experimentella förhållanden för att demonstrera användbarheten och flexibiliteten i verktygslåda. Biofilmen Modellen är enkel, reproducerbar och flera replikat av ett enda experiment kan göras samtidigt ^{4, 5.} Dessutom ger det tidsmässiga utvärdering, införande av olika mikroorganismer ⁵ och bedömning av effekterna av olika experimentella betingelser (t.ex. behandlingar ^6, jämförelse av mutanter vs moderstammen ^5, kolhydrater tillgången ^7). Här beskriver vi två specifika delar i verktygslåda, inklusive (i) ny programvara för microarray data mining / organisation (MDV) och fluorescens bildanalys (DUOSTAT), och (ii) in situ EPS-märkning. Vi erbjuder också en experimentell fall som visar hur verktygslåda kan hjälpa till med biofilmer analys, data organisation, integration och tolkning.

Protocol

1. STEG 1 - biologiska testsystem

Biofilmen metoden använder skivor av hydroxyapatit (HA) som tand surrogat (Clarkson Chromatography Products, Inc., South Williamsport, PA, USA, yta = 2,7 ± 0,2 cm ²⁾ belagda med saliv (härma närvaro av förvärvade MEMBRAN) placerade i vertikal position ^{4, 5, 8.}

1. Biokemiska analyser.
   1. I biofilmen är antingen (i) homogeniseras genom ultraljudsbehandling ⁹ eller (ii) hålls intakt för biokemiska analyser ^8. Det homogeniserade biofilmer Suspensionen kan användas för bestämning av biomassa (torr vikt), totalt protein, oorganisk och extracellulära och intracellulära polysackarider sammansättning / innehåll (se detaljer i Lemos et al. Protokoll för att studera fysiologi Oral Biofilmer ^8). Den intakta biofilmer kan analyseras för deras fysiologiska reaktioner med standard glykolytiska pH-släpp, syra-dödande, proton permeabilitet och F-ATPas analyser aktivitet (se detaljer i Lemos et al. Protokoll för att studera fysiologi Oral Biofilmer ^8).
2. Transkriptom Analyser.
   1. Standard cDNA microarray och RT-qPCR protokoll (t.ex. http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) kan användas i kombination för bestämning av transkriptom-respons av specifika patogener (t.ex. S. mutans) inom biofilmer till olika miljö-och terapeutiska utmaningar i olika utvecklingsstadier ^{6, 7, 10, 11.} I verktygslåda, ingår vi två metoder som är kritiska för transkriptom analys av dentala biofilmer: 1) RNA kvalitet (på grund av den heterogena karaktären av biofilm populationer och förekomst av EPS-matris), och 2) data mining och tolkning (på grund av stor uppsättning data som genereras av microarray).
      • RNA-isolering. För att hantera kvalitetsfråga av RNA ur biofilmer, använder vi ett optimerat protokoll som utvecklats speciellt för RNA-isolering och rening från bakterieceller insnärjd i EPS-rika matris ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). Detta protokoll ger RNA Integrity Number (RIN) högre än 8,5, vilket anses vara optimalt för transkriptom analys med både RT-qPCR och Microarrays (för exempel, se ^{6, 11).}
3. Fluorescens avbildning. Organisationsstruktur biofilmer.
   1. De flesta av de konfokala fluorescens avbildning protokoll tillgängliga i litteraturen fokuserar på mikrobiell märkning. Analysen av EPS som en viktig komponent av biofilm har till stor del försummats i muntlig biofilmen forskning med fluorescens avbildning, med få undantag ^{5, 13, 14.} Vi har utvecklat en teknik roman märkning och särskild programvara för reproducerbara visualisering och kvantifiering av EPS-och bakterieceller samtidigt inom intakta biofilmer. Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlin, Tyskland) används för 3D-rekonstruktion av biofilmer, medan COMSTAT (finns på http://www.imageanalysis.dk) och DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) ge kvantitativ analys.
      1. Avbildning av organisationsstruktur EPS-bakterier i biofilmer. Den Alexa Fluor 647-märkt dextran konjugat som används för att visualisera EPS-matrisen. Den fluorescerande-märkta dextran fungerar som en primer för streptokockinfektion glucosyltransferases-Gtfs (särskilt GtfB och GtfC), och kan samtidigt tillförs under exopolysaccharide matris syntes under loppet av biofilm utveckling ^11.
         
         EPS-märkning:
         1. Coat hydroxyapatit skivor med filter-steriliserade saliv för 1h, efter "biofilm Förberedelse" protokoll ^8.
         2. Pipettera 2,8 ml odlingsmedium i varje brunn på 24 bra plattor, och ta med till ett mörkt rum.
         3. Tillsätt 1 mikroM av dextran konjugerad Alexa Fluor i odlingsmedium, blanda färgämnet i odlingsmedium genom att pipettera upp och ner (ca 10 gånger).
         4. Dip-tvätta saliv belagda HA (SHA) skivor (efter 1 h inkubation) två gånger i sterila AB buffert och placera dem i medium som innehåller dextran konjugerade Alexa Fluor.
         5. Täck plåten med aluminiumfolie och inkubera vid 37 ° C, 5% CO _2. Varaktigheten av inkubationstiden beror på varje experimentell design. Den fluorescerande dextran Fläckar ej bakteriecellerna vid koncentrationer som används i detta somsäga ^11. Andra EPS-färgning tekniker, till exempel med Calcofluor ^14, kan användas i kombination.
      2. Bakterier märkning:
         1. Bakterier komponenter i biofilmen är märkta i slutet av biofilm bildas med hjälp av vanliga lysrör nukleinsyra fläcken (t.ex. SYTO 9), andra fluorescens tekniker (t.ex. artspecifik fluorescerande-märkta antikroppar ¹⁵ eller GFP-uttryckande celler ¹⁶⁾ kan naturligtvis användas för att upptäcka en eller flera bakteriearter i biofilmer. Figur 2 visar samtidigt märkning av EPS (röd) och bakterier / microcolonies (grön) i en 3D-bild av en 24-timmar gamla S. mutans biofilm som bildas på ytan av en SHA-skiva.
         2. Bilder förvärvet: Varje biofilm skannas 5 till 10 slumpmässigt utvalda positioner, och z-serien genereras av optiska sektionering på alla dessa ståndpunkter från laserskanning konfokalmikroskopi med standardprotokoll. Vi använder en Olympus FV 1000 två-photon mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) utrustade med x10 (Carl Zeiss, numerisk apertur 0,45; arbetsavstånd 3-4 mm) eller X25 (Olympus LPlan N, NA 1,05, WD 2 mm) vatten nedsänkning mål. Den excitationsvåglängden är 810 nm och utsläpp våglängd filter för SYTO 9 (bakterier) är 495/540 OlyMPFC1 filter, medan filtret för Alexa Fluor 647 (EPS) är HQ655/40M-2P filter. Spara och lagra RAW-bilder.

2. STEG 2 - RAW DATA INPUT

Ingång rådata från biokemiska och RT-qPCR analyser direkt i Rå datafil (RDF-MS Excel-fil). För microarrays data, fördela belastningen enda kanal bilder av skannade bilder till JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) eller liknande mjukvara. Skapa en plats rutnät enligt JCVI specifikationer och sedan manuellt justera för att passa alla platser i nätet. Mät intensiteten värdena för varje plats och sparar in ". MeV" filer och lagras i "Raw microarray data".

3. STEG 3 - DATABEHANDLING

Organisera rådata (biokemiska och RT-qPCR) i RDF för statistisk analys. Överföra dem till "som behandlas File" (DPF - MS Excel-fil). För microarray och fluorescens bildanalys, är särskild programvara (för närvarande tillgängliga och skräddarsydda) används för att behandla uppgifterna.

1. Microarray data:
   1. Skicka in Rådata som genereras i steg 2 (lagras i "Raw Microarrays data") till data normalisering steg med hjälp av särskild programvara. Normalisera data med JCVI microarray data analys program MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Använd LOWESS och standardavvikelse reglering med standardinställningarna, följt av i-bild replikera analys. Lagra filer som innehåller den normaliserade data. I detta skede (rådata filer och normaliserade datafiler klar), deposition microarray data i en offentlig tillgång databas (t.ex. NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) databas på http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) och registrera anslutning numret för framtida bruk.
2. Fluorescens bilddata
   1. Biofilm struktur kvantifiering.
      1. Den kvantitativa data som motsvarar varje strukturell komponent (EPS och bakterier) av biofilmer beräknas av COMSTAT och den nyutvecklade DUOSTAT, som skrivs som skript i MATLAB 5,1. Den råa fluorescens bilder är uppladdade i programvaran och analyseras enligt följande:
         • Använd COMSTAT att beräkna biomassa, tjocklek, lager distribution och andra parametrar som kvantifiera och karakterisera tredimensionella strukturen av biofilmer (se handboken http://www.imageanalysis.dk).
         • Använd DUOSTAT att beräkna co-lokalisering av två biofilm komponenter som EPS och bakterier (eller andra mikroorganismer och / eller extracellulära komponenter):
           1. Ställ in sökvägen DUOSTAT i MATLAB 5,1 och öppna mappar image som inkluderar bilder av de två biofilm komponenter.
           2. Välj två kanaler som kommer att vara korrelerade och analyseras. De två Bildstaplar måste också ha samma pixel storlekar i alla tre dimensioner (x, y, z), och samma antal bilder i varje stapel.
           3. Ställ in tröskelvärden för varje kanal Enligt mannenUAL av COMSTAT. Följ anvisningarna i programvaran drift gränssnitt (se videon artikeln; DUOSTAT handboken http://www.imageanalysis.dk). Mata in uppgifter som erhålls i DPF. Se exempel i Figur 4.4.
      2. Tredimensionella biofilmer återuppbyggnad.
         1. Den tredimensionella strukturen av biofilmer visualiseras med Amira. Importera fluorescens bilder som lagras i "Raw Images mapp" i mjukvara, och använda voltex och ISO-yta gör att skapa 3-D renderingar av var och en av komponenterna i biofilmen (se Amira manualen på http://www.amira.com / Dokumentation / Manualer-och-släpp-notes.html). Se exempel i figur 4,4.

4. STEG 4 - Dataanalys

Den kvantitativa data från biokemiska, RT-qPCR och COMSTAT-DUOSTAT analyser i DPF är redo för statistisk analys. Efter den statistiska analysen utförs, kan grafer och / eller tabeller byggas (se "representativa resultat"-avsnittet).

1. Microarray data som organisation med hjälp av programvara Microarray Data Visualizer (MDV).

På grund av komplexiteten och produktionen av stora datamängder när du använder microarrays och flera experimentella förhållanden, utformade vi en data mining och organisation programvara som heter Microarray Data Visualizer (MDV) ⁷ (finns på http://www.oralgen.lanl.gov/) .

Efter att ha genomfört den statistiska analysen med BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) med en cutoff P-värde på 0,001 för klass förutsäga och för klass jämförelse kan de data som genereras lämnas att MDV, som följer:

1. Använda Excel, konvertera BRB data till MDV tabbavgränsad textfiler. Ta bort alla brev som kommer med Gene Locus Tag nummer, till exempel: SMU.1423c, ta bort bokstaven "C".
2. Öppna MDV. Gå till Arkiv och välj "Välj Annotation Source". Välj "Flat File". När presenteras med dialogrutan använda Bläddra-knapparna för att välja de filer som innehåller anteckning för gen-namn, Gene ontologi (GO) nummer, väg och funktionella data klassificering.
3. Gå till Arkiv, och importera alla filerna från punkt 1. Var och en av de filer som representerar de experimentella förutsättningarna för analys. Om det finns flera villkor för analys, till exempel två olika behandlingar (behandling 1 och 2) och kontroll (fordon) gå till punkt 4.
4. I detta fall de möjliga jämförelser är: (a) behandling 1 jämfört med kontroll (för gener differentiellt uttryckt på grund av behandling 1), (B) behandling 2 jämfört med kontroll, och (c) behandling 1 vs behandling 2. Beroende på arbetshypotes kan olika uppsättning av gener väljas.
5. Välj bara gener differentiellt uttryckt i jämförelse A (unika gener påverkas av behandlingen 1 bara). I detta fall använder Subtrahera funktionen från den inställda funktioner menyn. Subtrahera gener från jämförelsen B från A, och spara resultatet. Sedan subtrahera C från resulterande data. Samma åtgärder kan göras för att få endast de gener i B (unika gener påverkas av behandlingen 2 only).
6. För att välja endast de gener som upptäckts i både A och B, använder EU-funktionen från den inställda menyn Funktioner för att kombinera resultatet för jämförelser A och B, och spara resultatet. Sedan subtrahera C från resultatet data.
7. Dessa åtgärder kan visualiseras med hjälp av Venn diagram, som visas i MDV, som är mer intuitiva, och underlättar hypotes driven uppgifter organisation. Den Venn diagram utdata kommer att visas i skärmen (se skärmen för att visa i figur 3 och video artikel).
   
8. Att spara data till tabbavgränsad textfiler, gå till Arkiv och välj Exportera.
9. Exportera tabbavgränsade textfiler. Öppna dem med hjälp av Excel och organisera utdata från MDV i tabeller och / eller dold i en grafisk display (se figur 4,2, 4,3 och video artikel).

5. Representativa resultat

Här ger vi ett exempel på hur den analytiska verktygslåda integrerar de olika analyserna av en biofilm studie med flera variabler och experimentella förhållanden.

Experimentell fall:

Dynamics of Streptococcus mutans transkriptom som svar på stärkelse och sackaros under biofilmen utveckling ^7.

Bakgrund:

Samspelet mellan kost stärkelse och sackaros med värd saliv amylas och streptokockinfektioner glucosyltransferases kan öka bildningen och virulens av S. mutans inom biofilmer med steg omAsing exopolysaccharides syntes, socker metabolism och acidogenicity ^11. Detta komplex värd-patogen-diet interaktion kan modulera uppkomsten av sjukdomsframkallande biofilmer relaterade till karies sjukdom. Vi har genomfört en omfattande biokemisk och transcriptomic analys (inklusive hela genomisk profilering) för att ytterligare förstå hur S. mutans svarar på stärkelse och sackaros vid olika skeden av biofilm utvecklas i närvaro av amylas ^7.

Den analytiska verktygslåda har använts för att hjälpa oss att integrera de biokemiska och molekylära analyser av biofilmer som bildas under olika experimentella förhållanden och pekar tid. Den övergripande informationssäkerheten utgång med den analytiska verktygslåda presenteras på ett sekventiellt sätt i Figur 4 (4,1-4,4). Det är anmärkningsvärt att den största fokus här är att visa nyttan av verktygslåda snarare än tolkning av data och diskussion.

1. Kombinera biokemiska och RT-qPCR analyser för att välja experimentella förutsättningar för ytterligare mikroarrayer analys. Inledningsvis testade vi sex olika sackaros och 5 olika stärkelse och kombinationer sackaros att välja den optimala koncentrationer av kolhydrater för biofilmer utveckling av S. mutans använda vår in vitro modell. Förmågan att granska samtidigt utdata från den biologiska testsystem väglett oss i att välja tre specifika koncentrationer (visas i figur 4.1) bygger på (förhöjda) mängden olösliga exopolysaccharides och (förstärkt) uttryck för gtfB (ansvarig för olösliga glukan syntes) i biofilmer .
2. Microarray analys. Utvalda (tre) koncentrationer av de kolhydratintaget användes för att bilda biofilm, som togs bort vid viss tid-poäng som speglar de olika biofilmer utvecklingsprocessen. Den biofilmer (uppdelat på 3 experimentella grupper och 4 time-poäng) utsattes för transkriptom analys genom att kombinera hela genomet profilering (cDNA mikroarrayer) med BRB-array Verktyg och MDV.
   
   RNA extraherades och renas med hjälp av biofilm-specifika protokoll ^12, och sedan genomgå microarray analys genom 4 steg-process för den analytiska verktygslåda. Figur 4.2 illustrerar hur MDV hjälpte till att välja gener av intresse i enlighet med vår arbetshypotes att sackaros och stärkelse kombinationen utlöser specifika transkriptionell svar associerade med ökad virulens (orsakar karies potentiella) av S. mutans inom biofilmer. Rådata som genereras av BRB-ArrayTools (Figur 4.2a) har bearbetats av MDV hjälp av Venn diagram (Figur 4.2b). I denna studie, den grupp av gener relaterade till vår hypotes är de differentiellt uttryckta i jämförelse A (0,5% sackaros + 1% stärkelse jämfört med 1% sackaros) och B (0,5% sackaros + 1% stärkelse jämfört med 0,5% sackaros), men inte de gener i jämförelse C (0,5% sackaros vs 1% sackaros) (Figur 4.2a och 4.2b). Som visas i figur 4.2c minskade MDV kraftigt det totala antalet gener som ska analyseras och samtidigt filtreras ut de gener som inte är direkt relaterade till påverkan av sackaros och stärkelse i kombination. Den MDV datautgång var också omvandlas till en grafisk display som visar data som organiserats av funktionsklass av varje av de gener differentiellt uttryckt (upp-och ned-reglerade) i stärkelse + sackaros-biofilmer (jämfört med sackaros odlade biofilmer) vid varje av den 4 tiden-poäng (figur 4.3). Den MDV Programvaran är användarvänlig och underlättat gruv / organisation av stora och komplexa datamängder från vår microarray experiment.
3. . Biofilm imaging samband med detta var den organisationsstruktur biofilmer analyseras med COMSTAT-DUOSTAT-Amira ingår i den verktygslåda (se ett exempel på 3D-rekonstruktion och kvantitativ analys av stärkelse + sackaros odlade biofilm i figur 4.4, se även video artikel). Morfologin, distribution och strukturella förhållandet mellan EPS och microcolonies kan visualiseras med hjälp av 3D-yta rendering av Amira. Närbilder av valda område kan genereras, vilket illustrerar vissa bakterier-EPS strukturella relationer i mikroskala (Figur 4.4). Dessutom kan samma uppsättning konfokala bilder bearbetas av COMSTAT-DUOSTAT för biomassa / microcolony mätningar, rumslig fördelning och colocalization av bakterier celler och EPS samtidigt. Till exempel var den vertikala fördelningen av EPS och bakterier från skivans yta till vätska-fas beräknas från varje optiska delen av tredimensionella konfokala biofilm bilder med hjälp av COMSTAT-DUOSTAT (graf i figur 4,4,. Se video artikel). Uppgifterna visar högre andel EPS (röd linje) än bakterier (gröna linjen) över biofilmer djup. Dessutom är de flesta bakteriella celler i förening med EPS (blå linje), särskilt i de mellersta och yttre skikten av biofilm. Denna observation indikerar att biofilmer odlas i stärkelse och sackaros är särskilt rika på exopolymers, vilka garning (i nära kontakt med) de flesta bakteriella celler, sådana strukturella organisation ökar stabiliteten och sammanhållningen i biofilmer ^13. Den tredimensionella renderingar och kvantitativa mätningar av konfokala bilder ger ytterligare information om strukturen på den biofilm, som kompletterar de biokemiska och genuttryck data (ökad GtfB typ olösliga-glukan syntes av S. mutans i stärkelse + sackaros odlade biofilmer) (för ytterligare exempel se ^{5, 6, 11, 13).}
   
   Den analytiska verktygslåda hjälp oss att skaffa, organisera och integrera data från olika biologiska testsystem, som gav en omfattande analys av hur S. mutans kan svara komplexa förändringar i miljön som ett resultat av kost-värd interaktioner som finns i munhålan (se detaljer i Klein et al, 2009 ^11,.. Klein et al, 2010 ^7).

Figur 1. Flödesschema den analytiska verktygslåda för Biofilm analys.

Figur 2. Confocal fluorescens avbildning av EPS och bakterier i biofilmer. Samtidig visualisering av EPS (röd) och bakterier / microcolonies (grön) i den tredimensionella återgivningen av Streptococcus mutans biofilm bildas på SHA skivans yta.

Figur 3. Microarray Data Mining och organisation som använder microarray data Visualizer (MDV) Software. Användning av Venn diagram funktionen för att välja ut gener av intresse, och därefter genom tillsats av genen namn och funktionsklass anteckningar.

Figur 4.1. Utvärdering av biofilm bildning av S. mutans med biokemiska analyser (A) och RT-qPCR (B). INS (olösliga exopolysaccharides) data korrelerar väl med mönstret för gtfB uttryck, och med biomassa biofilmer. Sackaros vid 1% koncentration för maximal INS bildning, gtfB uttryck och biofilm samlas på SHA ytan medan 0,5% sackaros var den lägsta koncentration som krävs för optimal biofilm utveckling med hjälp av vår in vitro modell. S. mutans celler som odlas i närvaro av 0,5% sackaros + 1% stärkelse gav den högsta biomassa, och presenteras mer INS än andra biofilmer som korrelerade med förbättrad gtfB uttryck (B2). Dessa kolhydrater halter valdes ut för vidare transkriptom analys.

Figur 4,2. Microarray dataanalys med BRB-Array Tools i samband med MDV programvara. a) representerar antalet gener identifierats som differentiellt uttryck i varje jämförelse (A, B eller C) och tidpunkt utvärderas med hjälp av BRB-Array Tools. b) Microarray Data Visualizer (MDV) med hjälp av Venn diagram för att välja gener av intresse. c) Gener väljs enligt MDV analys.

Figur 4.3. S. mutans gener differentiellt uttryckt i stärkelse + sackaros-biofilmer (jämfört med sackaros-biofilmer) vid olika tid-punkter som organiseras av funktionsklass. Gene anteckningar är baserade på information från Los Alamos National Laboratory (www.oralgen.lanl.gov) eller genom publicerad litteratur tillgänglig på samma webbplats.

Figur 4,4. Tredimensionell rendering och COMSTAT-DUOSTAT analys av stärkelse + sackaros-biofilm.

Discussion

I denna presentation visade vi två kritiska komponenter i analytisk verktygslåda (EPS / bakterier bildbehandling och microarray data mining / bearbetning), mångsidighet och användbarhet av de olika analyser integrerade i systemet. Det är tydligt att verktygslåda underlättat den omfattande (jämförande) och samtidig analys av de olika aspekterna av biofilmer biokemi, arkitektur och genuttryck som svar på olika experimentella förhållanden med hjälp av en in vitro modell. ⁷ Med tanke på den dynamiska och komplexa förändringar av organisationsstruktur, fysiologiska och transkriptom svar av S. mutans (och andra patogener) i biofilmer, skulle en integrerad analys bidrar till att ytterligare förstå hur biofilm modulera patogenicitet i munhålan. Vi är för närvarande omfattar artspecifika märkning och metagenomic / metaprotemic analys i den analytiska verktygslåda, vilket skulle öka förmågan att utreda mer i detalj komplexa ekologiska interaktioner och strukturella förändringar i våra blandade arter biofilm modell. ⁵

Dessutom är detta verktyg (och alla biologiska testsystem), uppgraderingsbara med tillägg (t.ex. metaproteome och hård yta analys, pågår), och kan anpassas / modifieras för tillämpningar utanför orala biofilmen forskning. Till exempel kan MDV vara särskilt användbar för andra biofilm-relaterade områden med hjälp av hela genomet profilering för jämförelse av flera experimentella förhållanden, såsom jämförande transkriptom av distinkt (mutanter) stammar eller som svar på läkemedel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran conjugated alexa 647	Invitrogen	D22914
Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope	Olympus Corporation