Summary
Muis blaaswand injectie is een nuttige benadering voor orthotopically studie blaas stamcellen en kanker biologie. Deze delicate microchirurgische methode kan worden beheerst met een zorgvuldige techniek en praktijk.
Abstract
Muis blaaswand injectie is een nuttige techniek om orthotopically studeren blaas verschijnselen, zoals stamcelonderzoek, glad spierweefsel, en kanker biologie. Voordat u begint met injecties, moet het operatiegebied worden gereinigd met water en zeep en antiseptische oplossing. Chirurgische apparatuur moet vóór gebruik worden gesteriliseerd en tussen elk dier. Elke muis is geplaatst onder ingeademd isofluraan anesthesie (2-5% voor inductie, 1-3% voor onderhoud) en de blaas blootgesteld door het maken van een middellijn incisie in de buik met een schaar. Als de blaas vol is, is het gedeeltelijk gedecomprimeerd door zachte knijpen tussen twee vingers. De celsuspensie van belang is intramuraal geïnjecteerd in de wand van de blaas koepel met behulp van een 29 of 30 gauge naald en een cc of kleiner spuit. De wond wordt dan gesloten met behulp van clips wond en de muis om te herstellen op een warming pad. Blaaswand injectie is een delicate microchirurgische techniek die kan worden beheerst met de praktijk.
Protocol
1. Muis blaaswand Injection
Keuze van de muis stam, leeftijd en geslacht wordt bepaald door de experimentele behoeften. We maken gebruik van muizen tussen de 8 en 12 weken oud zijn, omdat dit een venster van immunologische volwassenheid voorafgaand aan de veroudering. Als algemene richtlijn, moet muizen komen op ten minste een week voorafgaand aan de experimentele manipulatie om stress geïnduceerde verstorende factoren te vermijden.
- Reinig de chirurgische tafel oppervlak met water en zeep.
- Veeg de chirurgische tafel oppervlak met Cide gapt of antiseptische doekjes.
- Voorafgaande autoclaaf schoon chirurgische instrumenten om te gebruiken in de chirurgie.
- Daarnaast, steriliseren chirurgische instrumenten met hete kraal sterilisator onmiddellijk voorafgaand aan gebruik, maar ook tussen de dieren tijdens de operatie.
- Schone 100 ul Hamilton spuiten en 29 of 30 gauge (1 / 2 inch lang) naalden door herhaalde aspiratie en injectie met absolute alcohol voor het eerste gebruik en aan het eind van de laatste chirurgische ingreep.
- Was en Hamilton spuiten spoelen met gesteriliseerd fosfaat-gebufferde zoutoplossing tussen elk dier.
- Verdoven muizen door ze te plaatsen in een isofluraan inductie kamer, met de isofluraan ingesteld tussen 2-5%.
- Zodra algehele anesthesie is bereikt, verwijdert u de muis uit de kamer en plaats in de rugligging met een warme pad eronder voor het behoud van een normale lichaamstemperatuur.
- Bereiken onderhoud anesthesie door het plaatsen van het dier snuit in een mondstuk met verdampen isofluraan (getitreerd van 1-3% als nodig is om geschikte anesthesie te onderhouden).
- Scheer de buikhuid met tondeuse.
- Gebruik een wegwerp, steriele chirurgische laken om de anus te dekken fecale besmetting te voorkomen tijdens de operatie.
- Gebruik een seconde wegwerp, steriele chirurgische laken aan het chirurgische veld (onderbuik) te dekken.
- Prep de buik met drie stukken van Betadine doordrenkte gaas. Herhaal deze stap drie keer.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop voor een vergroting, maak een lagere middellijn buikoperatie met een schaar.
- Expose de blaas.
- Als de blaas vol is, gedeeltelijk pak het uit door zachte neerwaartse druk op de koepel.
- Injecteer de monsteroplossing (tot 50 uL), met behulp van een 29 of 30 gauge naald en spuit, in de wand van de blaas koepel (intramuraal injectie) met de schuine rand van de naald naar boven gericht.
- Duw de zuiger van de spuit om de monsteroplossing te injecteren in de blaaswand. Een goed gelokaliseerde blaar is een indicatie van een succesvolle injectie van de cellen in de blaaswand.
- Verwijder de spuit, sluit de incisie met wond clips en laat de muis te herstellen op een warming pad.
2. Representatieve resultaten:
Een goed gelokaliseerde blaar die niet lekken en blijft stabiel in omvang is een indicatie van een succesvolle injectie van de cellen in de blaaswand (figuur 1). Histologische analyse kan worden uitgevoerd om de aanwezigheid van de geïnjecteerde cellen in de blaaswand te bevestigen.
Figuur 1. Voorbeeld van een succesvolle blaaswand injectie met Oostindische inkt ter illustratie.
Figuur 2. Schematische voorstelling van experimentele procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis blaaswand inspuiting zorgt voor de inplanting van specifieke cellen in bepaalde delen van de blaaswand. Deze techniek heeft brede toepassingen voor muismodellen van blaaskanker, gladde spieren, en stamcel biologie. Per definitie, de muis blaaswand injectie vergemakkelijkt introductie van blaaskanker of stamcellen in een orthotope locatie, zodat hun groei en differentiatie kan worden bestudeerd in een fysiologisch relevante anatomische context. In feite, Dinney et al.. eerst beschreven deze techniek om orthotoop menselijke blaaskanker xenotransplantaten studie met muizen naakt 1.
Terwijl de blaaswand injectie-techniek is gebruikt in een aantal van blaaskanker en stamcel studies 1-9, het is niet de enige methode gebruikt. Veel wetenschappers hebben geprobeerd blaas kankercellen implantaat in naakt muizen door subcutane, intraperitoneale of intraveneuze injectie, maar deze modellen hebben niet tentoongesteld voorspelbaar tumorgeniciteit en metastatische eigenschappen die de selectie van in vivo cellijnen 11-13 mogelijk te maken. Verder zijn er een aantal van blaaskanker modellen die afhankelijk zijn van transurethrale inoculatie van muizen met tumorcellen 14. Een toonaangevende theorie van de blaas carcinogenese poneert dat de tumor verspreid gebeurt door het "zaaien" van normale urotheel door kankercellen afgestoten in de urinestraal van elders in de urinewegen. Vanuit dit perspectief kan transurethrale inoculatie, wat resulteert in blootstelling van de urotheel om kankercellen uit de luminale kant van de blaas, meer fysiologisch relevante dan blaaswand injectie. Kan echter transurethrale inoculatie niet direct waar de cellen zich zullen implantaat in de blaas.
In contrast, kan orthotopische blaas tumor implantatie door de blaaswand injectie consequent produceren tumoren in de wand van de blaas. Zo kan deze methode ook toegepast worden op studies van glad spierweefsel en stamcel biologie 3, 5, 9.
In deze techniek, de breinaalden en spuit zijn kritisch. We hebben ontdekt dat ½ cm lang, 29 en 30 gauge naalden zijn het beste voor blaaswand injectie. Langere naalden hebben meer dode ruimte die kan bijdragen aan verspild inocula en minder nauwkeurige injectie volumes. Bredere naalden (28 meter of lager) zijn moeilijk te injecteren met, en leiden tot grote naald tracks die gemakkelijk extruderen geïnjecteerd materiaal. We maken gebruik van 100 microliter Hamilton spuiten, omdat ze mogelijk zeer nauwkeurig de toediening van de gewenste volumes. Daarnaast worden cellen en puin gemakkelijk geaggregeerde en samengeklonterd aan het einde van de naald tijdens het injecteren. Daarom moet de cel suspensie goed gemengd worden alvorens te worden getrokken in spuit en de spuit en naald moet herhaaldelijk worden gereinigd met een steriele fysiologische zoutoplossing tussen elke injectie. We hebben gevonden dat de minimale, accurate injecteerbare volume is ongeveer 10 microliter. Niet meer dan ongeveer 50 microliter kan worden geïnjecteerd in de muis blaaswand te wijten aan de geringe omvang van de geïnjecteerde weefsel. Injectie met Oost-Indische inkt kan worden gebruikt door beginners te helpen bevestigen dat ze met behulp van de juiste techniek. De leercurve voor individuen ervaren met de muis procedures is kort. Blaaswand injecties kunnen worden uitgevoerd met bijna 100% slagingspercentage na slechts 5-10 muizen. We verwachten dat ook voor werknemers niet vertrouwd zijn met de muis microchirurgie, zeer hoge slagingspercentages moet haalbaar zijn binnen 10-15 muizen. Injectie mislukking muizen kan gebruikt worden als negatieve controles gebruikt.
Concluderend kan blaaswand injectie resulteren in een zeer gerichte toediening van cellen om bepaalde locaties in de blaas, waardoor het een zeer aantrekkelijke optie voor studies van de blaas biologie. Toch, deze techniek heeft een bijbehorende leercurve en vraagt tijd en oefening de knie te krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij dankbaar de steun van een Pilot subsidie van de Stanford Pediatric Research Fund en K08DK087895-01 uit de NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
