Summary
שלפוחית השתן עכבר הזרקת הקיר היא גישה יעילה orthotopically מחקר גזע שלפוחית השתן התא וביולוגיה סרטן. שיטה זו microsurgical עדין ניתן לשלוט בטכניקה תרגול זהיר.
Abstract
שלפוחית השתן עכבר הזרקת בקיר היא טכניקה יעילה כדי ללמוד orthotopically תופעות שלפוחית השתן, כולל בתאי גזע, שריר חלק, ביולוגיה סרטן. לפני שמתחילים זריקות, באזור הניתוח יש לנקות עם מים וסבון אנטיספטי פתרון. ציוד כירורגי יש לעקר לפני השימוש לבין כל חיה. עכבר כל מושם תחת הרדמה נשאפים isoflurane (2-5% לזירוז,% 1-3 לצורך תחזוקה) ושלפוחית השתן שלה נחשף על ידי ביצוע חתך בבטן קו האמצע עם מספריים. אם השלפוחית מלאה, היא decompressed חלקית על ידי סחיטה עדינה בין שתי אצבעות. ההשעיה התא עניין מוזרק intramurally בקיר הכיפה שלפוחית השתן באמצעות מחט 29 או 30 מד 1 סמ"ק או מזרק קטן. הפצע סגור ולאחר מכן באמצעות קליפים הפצע העכבר מותר להתאושש על כרית חימום. קיר הזרקת שלפוחית השתן היא טכניקה microsurgical עדין שניתן לשליטה באמצעות תרגול.
Protocol
1. שלפוחית השתן עכבר וול Injection
בחירת זן העכבר, גיל, מין מוכתב על ידי הצרכים ניסיוני. אנו משתמשים בעכברים בין 8 ל 12 שבועות של גיל, שכן זהו חלון של בגרות החיסונית לקראת ההזדקנות. כקו מנחה כללי, עכברים צריכים להגיע לפחות שבוע לפני מניפולציה ניסויית על מנת למנוע מתח המושרה גורמים סותרים.
- נקו את משטח השולחן כירורגית עם מים וסבון.
- נגבו את משטח השולחן כירורגית במשיכות Cide או מגבונים חיטוי.
- החיטוי מכשירי ניתוח נקי לפני השימוש בניתוח.
- בנוסף, לחטא כלי ניתוח עם מעקר חרוז חם מיד לפני השימוש, וכן בין בעלי חיים במהלך הניתוח.
- ניקוי מזרקים 100 μL המילטון 29 או 30 מד (1 / 2 אינץ ארוך) מחטים על ידי שאיפה חוזרות ההזרקה עם אלכוהול מוחלט לפני השימוש הראשון בסוף ההליך הכירורגי הסופי.
- לרחוץ ולשטוף מזרקים המילטון עם מעוקרים פוספט שנאגרו מלוחים בין כל חיה.
- הרדימי עכברים ידי הצבתם בחדר אינדוקציה isoflurane, עם להגדיר את isoflurane בין 2-5%.
- לאחר הרדמה כללית מושגת, להסיר את העכבר מהאולם ובמקום במצב שכיבה עם כרית חמה מתחת מנת לשמור על חום גוף תקין.
- השג הרדמה תחזוקה ידי הצבת חוטם של החיה בנחיר המכיל לאדות isoflurane (טיטרציה של 1-3% על פי הצורך לשמור על הרדמה המתאים).
- לגלח את עור הבטן עם קוצץ.
- השתמש לעטוף חד פעמיות, כירורגי סטרילי כדי לכסות את פי הטבעת על מנת למנוע זיהום צואתי במהלך הניתוח.
- השתמש לעטוף שנייה חד פעמיות, כירורגי סטרילי כדי לכסות את שדה הניתוח (הבטן התחתונה).
- הכיני את הבטן עם שלוש חתיכות של גזה בבטאדין ספוג. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח עבור ההגדלה, לעשות חתך בבטן התחתונה קו האמצע עם מספריים.
- לחשוף את שלפוחית השתן.
- אם השלפוחית מלאה, חלקית לשחרר אותו על ידי לחץ כלפי מטה בעדינות על הכיפה.
- להזריק את הפתרון המדגם (עד 50 μL), באמצעות מחט 29 או 30 מד מזרק, בקיר של הכיפה שלפוחית השתן (הזרקה עירונית) עם שיפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
- דחוף את הבוכנה של המזרק להזריק את הפתרון מדגם לתוך הקיר שלפוחית השתן. בועה היטב מקומי אינדיקציה זריקה מוצלחת של התאים בדופן שלפוחית השתן.
- הסר את המזרק, לסגור את החתך עם קליפים הפצע ולאפשר העכבר כדי להתאושש על כרית חימום.
2. נציג תוצאות:
בועה היטב מקומי שאינו נוזל דליפה ונשאר יציב בגודל אינדיקציה זריקה מוצלחת של התאים בדופן שלפוחית השתן (איור 1). ניתוח היסטולוגית ניתן לבצע כדי לאשר את קיומו של התאים מוזרקים בדופן שלפוחית השתן.
באיור 1. דוגמה זריקה מוצלחת קיר שלפוחית השתן באמצעות דיו הודו להמחשה.
איור 2. סכמטי של הפרוצדורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלפוחית השתן עכבר הזרקת הקיר מאפשר להשתלה של תאים ספציפיים לאזורים מוגדרים של קיר שלפוחית השתן. טכניקה זו יש יישומים רחב עבור מודלים העכבר של סרטן שלפוחית השתן, שריר חלק, ביולוגיה של התא גזע. על פי ההגדרה, שלפוחית השתן העכבר מאפשר הזרקה קיר המבוא של סרטן שלפוחית השתן או בתאי גזע לתוך במיקום orthotopic כך הצמיחה שלהם בידול ניתן ללמוד בהקשר אנטומיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. למעשה, Dinney et al. הראשון שתיאר את הטכניקה הזו כדי ללמוד orthotopic האדם סרטן שלפוחית השתן אצל עכברים xenografts בעירום 1.
בעוד קיר שלפוחית השתן טכניקת ההזרקה נוצל במספר של סרטן שלפוחית השתן מחקרים בתאי גזע 1-9, זה לא השיטה היחידה בשימוש. מדענים רבים ניסו להשתיל תאים סרטניים בשלפוחית השתן לעכברים בעירום על ידי תת עורית, intraperitoneal, או הזרקה תוך ורידית, אך המודלים האלה לא הפגינו tumorigenicity לחיזוי תכונות גרורתי, אשר מאפשרים בחירה של שורות תאים vivo 11-13. יתר על כן, ישנם מספר דגמים של סרטן שלפוחית השתן אשר מסתמכים על חיסון transurethral של עכברים עם 14 תאים סרטניים. התיאוריה המובילה של סרטן שלפוחית השתן טוען כי התפשטות הגידול מתרחש על ידי "זריעת" של urothelium נורמלי על ידי תאים סרטניים לשפוך לתוך זרם השתן ממקום אחר בדרכי השתן. מנקודת מבט זו, חיסון transurethral, שתוצאתה החשיפה של urothelium אל התאים הסרטניים מן הצד luminal של שלפוחית השתן, יכול להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר הזרקת קיר שלפוחית השתן. עם זאת, חיסון transurethral לא יכול לכוון היכן יהיה להשתיל תאים עצמם בתוך שלפוחית השתן.
לעומת זאת, שלפוחית השתן orthotopic הגידול ההשתלה בזריקה קיר שלפוחית השתן ניתן באופן עקבי לייצר גידולים הממוקמים בדופן שלפוחית השתן. לכן, שיטה זו יכולה לחול גם על מחקרים של שרירים חלקים בתאי גזע הביולוגיה 3, 5, 9.
בטכניקה זו, בגודל מחט מזרק הם קריטיים. מצאנו כי ½ אינץ' ארוך, 29 ו - 30 מחטים מד ביותר עבור הזרקה קיר שלפוחית השתן. מחטים ארוכות יש שטח מת יותר אשר יכול לתרום inocula מבוזבז כרכים זריקה פחות מדויק. מחטים המורחבת (28 מד או נמוך יותר) קשה להזריק עם, ולהוביל מסלולים מחט גדול אשר בקלות extrude החומר המוזרק. אנו משתמשים 100 microliter מזרקים המילטון כי הם היתר הממשל מדויק מאוד של כרכים הרצוי. בנוסף, תאים ופסולת הם מצטברים בקלות בכבדות בסוף המחט בזמן הזרקת. לפיכך, השעיית התא צריך להיות מעורב הרבה לפני שנשאב לתוך מזרק את המזרק ואת המחט יש לנקות שוב ושוב עם מלח רגיל סטרילי בין כל הזרקה. מצאנו כי נפח מינימלי, בזריקות מדויקות הוא כ -10 מיקרוליטר. לא יותר כ -50 מיקרוליטר יהיה ניתן להזריק לתוך הקיר עכבר שלפוחית השתן בשל גודלו הקטן של הרקמה מוזרק. הזרקת דיו באמצעות בהודו יכול לשמש כדי לעזור לאשר טירונים הם משתמשים בטכניקה נכונה. עקומת הלמידה עבור אנשים מנוסים עם נהלים עכבר קצרה. קיר זריקות שלפוחית השתן ניתן לבצע עם כמעט 100% אחוזי הצלחה רק אחרי עכברים 5-10. אנו צופים כי גם לעובדים מוכר עם העכבר microsurgery, אחוזי ההצלחה גבוהים מאוד צריך להיות בר השגה בתוך 10-15 עכברים. כישלון עכברים הזרקת יכול לשמש שולטת שלילית.
לסיכום, הזרקה קיר שלפוחית השתן יכול לגרום משלוח ממוקדות התאים במקומות מוגדרים בשלפוחית השתן, מה שהופך אותו לאופציה אטרקטיבית ביותר ללימודי ביולוגיה של שלפוחית השתן. עם זאת, הטכניקה הזו יש עקומת למידה הקשורים דורש זמן ותרגול לשלוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
בהכרת תודה אנו מכירים את התמיכה מענק Pilot מקרן המחקר סטנפורד ילדים ו K08DK087895-01 מ NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
