小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

摘要

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。

摘要

人类乳腺由15-20个叶组成，这些叶将乳汁分泌至通向乳头开口的分支导管系统。每个叶又由多个终末导管小叶单位构成，这些单位包括分泌性腺泡和汇合的导管。¹在小鼠中，妊娠期间可观察到类似的结构，其中导管和腺泡散布于结缔组织间质内。小鼠乳腺上皮由导管构成的树状系统组成，导管由两层细胞构成：内层为腔面细胞，外层为肌上皮细胞，二者由基底膜界定。²出生时，仅存在一个初级导管树，由一条主导管和15–20条分支组成。在激素影响下，导管的延伸和扩增始于青春期初期，约4周龄时开始^3,4,5在10周时，大部分间质已被复杂的导管系统侵入，这些导管在每个动情周期中将经历分支与退化循环，直至妊娠。²妊娠初期，发育进入第二阶段，此时上皮细胞开始增殖并分化，形成葡萄状的乳汁分泌结构，称为腺泡。^6,7分娩后及整个哺乳期间，乳汁由腺泡腔内的分泌细胞产生，并储存在腺泡腔内。幼崽吮吸乳头可刺激神经反射，促使催产素释放，进而引起腺泡周围及导管沿线的肌上皮细胞同步收缩，使乳汁经导管输送至乳头，供幼崽摄取。 ⁸乳腺的发育、分化和功能受到精密调控，不仅需要间质与上皮之间的相互作用，还需要上皮内部肌上皮细胞与腔面细胞之间的相互作用。^9,10,11因此，参与这些相互作用的许多基因发生突变，可能会影响青春期期间的导管伸长，或影响早孕期间的腺泡形成、晚孕期间的分化以及导致泌乳的分泌激活过程。^12,13本文中，我们描述了如何解剖小鼠乳腺并利用全组织制片技术评估其发育情况。我们还展示了如何通过基于催产素的离体功能实验来评估肌上皮细胞收缩及乳汁排出。由此可确定基因突变对乳腺发育和功能的影响。 原位 通过在突变型和野生型对照小鼠中执行这两种技术。

方案

1. 乳腺组织解剖

1. 使用 CO₂ 处死小鼠₂ 吸入麻醉。应尽量避免颈椎脱位法，因其可能损伤颈部主要血管，导致血液在乳腺周围积聚，从而增加解剖难度。然而，若需在同一小鼠中评估其他指标（如催产素血药浓度），则可能需要采用其他安乐死方法，但此选择必须经由本单位动物实验伦理委员会（IACUC）评估批准。
2. 在包裹有锡箔的聚苯乙烯泡沫上，将小鼠仰卧放置，并展开四肢。使用16至20号针头牢固固定四肢（图1A）。
3. 用70%乙醇充分喷洒小鼠。
4. 用镊子提起腹中线处的皮肤，用锐利的剪刀做一小切口。
5. 从切口处开始，沿动物体表向上剪至颈部，注意避免刺破腹腔或胸腔（图1B）。
6. 沿中线切口切开前肢皮肤，得到一个 "Y形" （图1B）。以相同方式切开后肢的皮肤（图1B）。
7. 使用止血钳轻轻将小鼠腹部和胸部的皮肤向两侧剥离。必要时，可轻轻剪断结缔组织。
8. 使用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，暴露附着在皮肤下方的乳腺组织。依次逐侧进行并完成操作（图1C）。
9. 使用镊子轻轻提起目标乳腺组织，用小型锋利剪刀从动物体侧向脊柱方向沿乳腺与皮肤之间进行剪切。操作时务必小心，确保乳腺组织上不残留任何皮肤或肌肉碎片。所有乳腺组织（图1）均可采用本方案进行摘除，但腹侧乳腺（#4）最适合用于整体封片。2^nd 和 3^rd 腺体具有一些交错排列的肌肉，尽管可用于整体封片和组织学分析，但可能并不适用于所有研究。

2. 整体染色

1. 解剖前至少一天，配制卡明明矾溶液：将1 g卡明和2.5 g硫酸铝钾溶于500 ml蒸馏水中，置于1 L锥形瓶内煮沸20分钟。加水调节终体积至500 ml。经Whatman滤纸过滤，并加入少量百里香酚（几粒）作为防腐剂。置于冰箱中保存。染色后，卡明明矾溶液可倒回原试剂瓶，可在数周内重复使用多次。当溶液颜色变淡时，需重新配制新溶液。
2. 从小鼠体内切除乳腺组织（步骤1）后，立即将其铺展在载玻片上。尽量将其展平，保持原有的形态结构 原位 形状。当适当拉伸时，腺体会很好地黏附在载玻片上。
3. 将腺体置于载玻片上，浸入卡诺固定液（100% EtOH:氯仿:冰乙酸 = 6:3:1）中，在室温下于通风橱内的玻璃瓶中固定4小时。需注意，已有研究采用2小时固定，似乎亦足够。 alternatively，腺体也可在4°C条件下固定°C 过夜。
4. 用70%乙醇洗涤15分钟。然后通过逐步去除水化方式复水：从容器中移除一半乙醇溶液，并加入等体积的ddH₂O替代₂O. 孵育5分钟，重复3次。或者，依次使用70%、35%、15%乙醇及水浴，每步各5分钟。
5. 用蒸馏水冲洗5分钟。
6. 室温下用卡红明矾染色液染色过夜。需要注意的是，染色时间可能因腺体厚度而延长。
7. 去除胭脂红铝染液以重复利用，并通过系列乙醇溶液（50%、70%、95%、100%）逐级脱水，每级5分钟，随后用二甲苯或无毒替代品如Histo-clear透明，过夜。对于较厚的样本，脱水和透明步骤可能需要更长的孵育时间。
8. 将乳腺组织浸入水杨酸甲酯中。乳腺组织可在通风橱内的水杨酸甲酯中保存，直至准备拍摄图像。
9. 可在通风橱内使用置于三脚架上的普通数码相机拍摄图像（使用 "大体的" 如有需要，可将载玻片置于透射光台（light table）上进行观察（必要时可使用解剖显微镜以获得更高放大倍数）。或者，在步骤2.7之后，可将乳腺组织用Permount等封片介质封片，只要封片足够薄，即可在化学通风橱外的任意成像平台上拍照。
10. 为了利用整体染色法量化乳腺发育情况，可进行如下测量：导管部分的分支（或侧支）数量、主导管的长度，或上皮组织与脂肪组织面积的比值。最后，在完成摄影记录后，乳腺整体标本可包埋于石蜡中，用于切片及常规组织学染色。

3. 催产素诱导的乳汁排出

1. 在幼崽进食后立即将其与母鼠分离。在进行检测前等待1小时。
2. 处死母鼠，并如前所述（步骤1.1至1.8）暴露乳腺组织，但不将其从动物体内移除。
3. 使用移液管将PBS或催产素溶液均匀滴加到目标乳腺上，以启动检测。可使用广泛剂量范围；通常采用˜8 pg/ml（生理剂量）。然而，为了确保在基因修饰小鼠模型中无反应，也可使用高浓度非生理性剂量（高达1 mg/ml）。建议在本实验中使用胸部（#2-3）乳腺，一侧作为对照（暴露于PBS），另一侧用于检测乳汁排出（暴露于催产素）。
4. 孵育1分钟后，用移液管小心吸除溶液。可通过录像记录，或在PBS或催产素处理前后拍照，以监测乳汁进入导管的情况。

4. 代表性结果：

在良好的整体封片中，乳腺组织应充分展开，上皮导管易于观察（图2A）。如果乳腺展开不充分，在置于固定液中时，组织可能部分或完全从载玻片上翘起，导致腺体变硬而无法使用（图2B）。同样，如果乳腺解剖不充分，可能导致部分上皮缺失（图2C），或残留的皮肤或腹肌组织会干扰腺体的分析（图2D）。

进行催产素检测时，每次实验都必须将吮吸乳汁的幼崽与母鼠分离相同的时间。这样可确保在暴露于催产素之前，导管中没有乳汁或仅有极少量乳汁存在，同时又能保证腺泡中有足够的乳汁，可通过肌上皮细胞的收缩将其排入导管中（图3A）。如果过早移除幼崽，乳汁可能在腺泡和导管中积聚，从而难以监测催产素的作用效果（图3B）。相反，若在移除幼崽后过早进行实验，乳汁尚未在腺泡中充分积聚，催产素诱导的肌上皮细胞收缩将无法触发足量的乳汁释放进入导管，因而无法观察到明显现象（图3C）。

图1. 小鼠乳腺组织解剖。将小鼠四肢朝下仰面固定于解剖板上（A）。先从腹部沿中线向颈部切开皮肤，然后从腹部中心向各肢端做垂直切口，如虚线所示（B）。轻轻剥离小鼠体侧皮肤并固定，暴露乳腺组织（C）。

图2. 小鼠乳腺全组织铺片。在铺展良好的第4对乳腺全组织铺片中（A），上皮导管（箭头）和淋巴结（箭头头）清晰可见。铺展不良的乳腺组织可能从载玻片上脱落并塌陷，导致无法使用（B）。取材不当的乳腺组织可能出现部分缺失（C），或残留肌肉或皮肤组织（D）。注意第2^nd 和 3^rd 腺体具有交错的肌肉组织，但仍可用于整体封片或组织学分析。

图3. 给予催产素后，可在导管上皮中观察到催产素诱导的乳汁射出（箭头所示）（A）。然而，若由于仔鼠上次哺乳后静息时间过长，导致实验开始时导管中已充满乳汁（箭头所示），则在给予催产素后难以观察到导管内乳汁的进一步积聚（箭头所示）（B）。相反，若仔鼠哺乳后的静息时间过短，则腺泡内无法积聚足够的乳汁，导致给予催产素后在导管中（箭头所示）也无法清晰观察到乳汁（C）。图像使用数码相机（Cybershot，Sony）在给予催产素前后拍摄。

图 4. 整体封片和催产素处理实验的示意图。

讨论

乳腺发育与功能受到精密调控。携带基因突变的小鼠可能表现出乳腺发育或功能受损，凸显了评估腺体结构的重要性。^13,12整体封片可在乳腺发育的所有阶段按照本文所述方法进行。通常在青春期开始时评估上皮的发育情况（ ˜4 周龄），处于青春期中期（ ˜6 周龄）及青春期后（ ˜ 10-12周龄^2,10在这些阶段，可通过测定导管分支数量、末端芽的数量及导管长度，以量化腺体发育程度。^14,15同样，肺泡发生（妊娠期间肺泡的发育）通常在妊娠过程中选取2-3个时间点进行评估；哺乳期和复旧期发生的结构变化也可通过全组织腺体铺片进行观察和定量分析。¹⁶然而，由于晚期妊娠和哺乳期小鼠乳腺组织密度较高，对其进行全组织染色定量分析可能较为困难。建议将全组织染色与组织学分析相结合，尤其是针对这些阶段的样本 ¹²对于更详细的组织学评估，可采用本报告所述相同方案摘除乳腺组织，经甲醛固定后进行苏木精和伊红染色。全组织标本也可在成像完成后进行石蜡包埋，用于组织学分析。两种技术均要求对乳腺组织进行准确而精细的解剖。若评估突变小鼠，应将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胭脂红	Sigma-Aldrich	C1022
硫酸铝钾	Sigma-Aldrich	A6435
百里酚	Sigma-Aldrich	T0501
水杨酸甲酯	Sigma-Aldrich	M6752
催产素	Sigma-Aldrich	O3251