小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

摘要

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。

摘要

人类乳腺由15-20个叶组成，这些叶将乳汁分泌至通向乳头开口的分支导管系统。每个叶又由多个终末导管小叶单位构成，这些单位包括分泌性腺泡和汇合的导管。¹在小鼠中，妊娠期间可观察到类似的结构，其中导管和腺泡散布于结缔组织间质内。小鼠乳腺上皮由导管构成的树状系统组成，导管由两层细胞构成：内层为腔面细胞，外层为肌上皮细胞，二者由基底膜界定。²出生时，仅存在一个初级导管树，由一条主导管和15–20条分支组成。在激素影响下，导管的延伸和扩增始于青春期初期，约4周龄时开始^3,4,5在10周时，大部分间质已被复杂的导管系统侵入，这些导管在每个动情周期中将经历分支与退化循环，直至妊娠。²妊娠初期，发育进入第二阶段，此时上皮细胞开始增殖并分化，形成葡萄状的乳汁分泌结构，称为腺泡。^6,7分娩后及整个哺乳期间，乳汁由腺泡腔内的分泌细胞产生，并储存在腺泡腔内。幼崽吮吸乳头可刺激神经反射，促使催产素释放，进而引起腺泡周围及导管沿线的肌上皮细胞同步收缩，使乳汁经导管输送至乳头，供幼崽摄取。 ⁸乳腺的发育、分化和功能受到精密调控，不仅需要间质与上皮之间的相互作用，还需要上皮内部肌上皮细胞与腔面细胞之间的相互作用。^9,10,11因此，参与这些相互作用的许多基因发生突变，可能会影响青春期期间的导管伸长，或影响早孕期间的腺泡形成、晚孕期间的分化以及导致泌乳的分泌激活过程。^12,13本文中，我们描述了如何解剖小鼠乳腺并利用全组织制片技术评估其发育情况。我们还展示了如何通过基于催产素的离体功能实验来评估肌上皮细胞收缩及乳汁排出。由此可确定基因突变对乳腺发育和功能的影响。 原位 通过在突变型和野生型对照小鼠中执行这两种技术。

方案

1. 乳腺组织解剖

1. 使用 CO₂ 吸入麻醉。应尽量避免颈椎脱臼法，因其可能损伤颈部主要血管，导致血液在乳腺周围积聚，从而增加解剖难度。然而，若需在同一小鼠中评估其他指标（如催产素血清水平），则可能需要采用其他安乐死方法，但此类方法必须经由本单位动物护理与使用委员会（IACUC）评估批准。
2. 在包裹有锡箔的聚苯乙烯泡沫上，将小鼠仰卧放置并展开四肢。使用16至20号针头牢固固定四肢（图1A）。
3. 用70%乙醇充分喷洒小鼠。
4. 用镊子提起腹中线处的皮肤，用锐利的剪刀做一小切口。
5. 从切口处开始，沿动物体表向颈部方向剪开皮肤，注意避免刺破腹腔或胸腔（图1B）。
6. 将前肢皮肤沿中线切开，形成“Y”形切口（图1B）。以相同方式切开后肢皮肤（图1B）。
7. 使用止血钳，轻轻将小鼠腹部和胸部的皮肤向两侧剥离。如有需要，可轻轻剪开结缔组织。
8. 使用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，暴露附着在皮肤下方的乳腺组织。依次逐侧进行并完成操作（图1C）。
9. 使用镊子轻轻提起目标乳腺，并用小型锋利剪刀从动物体侧向外向脊柱方向剪开乳腺与皮肤之间的连接。注意仔细剪切，确保乳腺上不残留任何皮肤或肌肉组织。所有乳腺（图1）均可采用本方案进行剥离，但腹部乳腺（#4）最适合整体封片。2^nd 和 3^rd 腺体具有一些交错分布的肌肉，因此尽管可用于....

讨论

乳腺发育与功能受到精密调控。携带基因突变的小鼠可能表现出乳腺发育或功能受损，凸显了评估腺体结构的重要性。^13,12整体封片可在乳腺发育的所有阶段按照本文所述方法进行。通常在青春期开始时评估上皮的发育情况（ ˜4 周龄），处于青春期中期（ ˜6 周龄）及青春期后（ ˜ 10-12周龄^2,10在这些阶段，可通过测定导管分支数量、末端芽的数量及导管长度，以量化腺体发育程度。^14,15同样，肺泡发生（妊娠期间肺泡的发育）通常在妊娠过程中选取2-3个时间点进行评估；哺乳期和复旧期发生的结构变化也可通过全组织腺体铺片进行观察和定量分析。¹⁶然而，由于晚期妊娠和哺乳期小鼠乳腺组织密度较高，对其进行全组织染色定量分析可能较为困难。建议将全组织染色与组织学分析相结合，尤其是针对这些阶段的样本 ¹²对于更详细的组织学评估，可采用本报告所述相同方案摘除乳腺组织，经甲醛固定后进行苏木精和伊红染色。全组织标本也可在成像完成后进行石蜡包埋，用于组织学分析。两种技术均要求对乳腺组织进行准确而精细的解剖。若评估突变小鼠，应将.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胭脂红	Sigma-Aldrich	C1022
硫酸铝钾	Sigma-Aldrich	A6435
百里酚	Sigma-Aldrich	T0501
水杨酸甲酯	Sigma-Aldrich	M6752
催产素	Sigma-Aldrich	O3251