Summary
Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.
Abstract
A glândula mamária humana é composta de 15-20 lóbulos que secretam leite em um sistema de abertura de ramificação do ducto no mamilo. Os lobos são eles próprios composto por um número de unidades lobular terminal duto feito de alvéolos secretores e dutos convergentes 1. Em camundongos, uma arquitetura semelhante é observado na gestação em que ductos e alvéolos são intercalados dentro do estroma do tecido conjuntivo. O mouse epitélio da glândula mamária é uma árvore como sistema de dutos composto de duas camadas de células, uma camada interna de células luminais rodeado por uma camada externa de células mioepiteliais denotada pelos confins de uma membrana basal 2. Ao nascer, apenas uma árvore ductal rudimentar está presente, composto de um duto de ramos primários e 15-20. Alongamento ramo e começar a amplificação no início da puberdade, em torno de 4 semanas de idade, sob a influência de hormônios 3,4,5. Às 10 semanas, a maioria do estroma é invadida por um complexo sistema de dutos que passarão por ciclos de ramificação e de regressão em cada ciclo estral até que a gravidez 2. No início da gravidez, uma segunda fase de desenvolvimento começa, com a proliferação e diferenciação do epitélio de uva para formar estruturas em forma de leite secretoras chamadas alvéolos 6,7. Após o parto e durante a lactação, o leite é produzido por células secretoras luminal e armazenados dentro do lúmen dos alvéolos. Oxitocina lançamento, estimulada por um reflexo neural induzida pela amamentação dos filhotes, induz as contrações sincronizado das células mioepiteliais em torno dos alvéolos e ao longo dos canais, permitindo que o leite a ser transportado pelos dutos até o mamilo, onde se torna disponível para a 8 filhotes. Desenvolvimento da glândula mamária, diferenciação e função estão bem orquestrados e exigem, não só as interações entre o estroma eo epitélio, mas também entre as células mioepiteliais e dentro do epitélio luminal 9,10,11. Assim, mutações em muitos genes envolvidos nestas interações pode prejudicar tanto o alongamento ductal durante a puberdade ou alvéolos formação durante a gravidez precoce, a diferenciação no final da gravidez e ativação secretória levando a lactação 12,13. Neste artigo, descrevemos como dissecar as glândulas mamárias do mouse e avaliar o seu desenvolvimento usando monta todo. Também demonstramos como avaliar as contrações mioepiteliais e ejeção do leite através de um ex-vivo ensaio oxitocina baseado funcional. O efeito de uma mutação genética no desenvolvimento da glândula mamária e função pode assim ser determinada in situ através da realização de duas técnicas, em ratos controle mutante e do tipo selvagem.
Protocol
1. Dissecção da glândula mamária
- Euthanize o mouse usando CO 2 por inalação. Evitar o deslocamento cervical, se possível, uma vez que pode danificar os vasos sanguíneos principais no pescoço e resultam em acúmulo de sangue em torno de glândulas mamárias, tornando a dissecção mais difícil. No entanto, se outros critérios devem ser avaliados no mesmo mouse, tais como os níveis sanguíneos de oxitocina, métodos de eutanásia alternativa pode ser necessária, mas isso deve ser avaliado pelo seu IACUC.
- Em uma espuma de poliestireno envolto em papel alumínio, coloque o mouse sobre as suas costas e se espalhou nos quatro membros. Pin firmemente todos os quatro membros com 16-20 agulhas (Figura 1A).
- Pulverizar o mouse generosamente com etanol 70%.
- Utilizando uma pinça, puxe a pele abdominal na linha média e fazer uma pequena incisão com uma tesoura afiada.
- A partir da incisão, corte a pele até o pescoço do animal, evitando a punção da cavidade abdominal ou torácica (Figura 1B).
- Cortar a pele nas pernas da frente para a incisão na linha média, resultando em uma "forma Y" (Figura 1B). Cortar a pele nos membros traseiros da mesma maneira (Figura 1B).
- Utilizando uma pinça hemostática, descascar delicadamente a pele abdominal e torácica para o lado do mouse. Se necessário, cortar delicadamente tecido conjuntivo.
- Corrigir a pele para a espuma de poliestireno utilizando 16-20 agulhas, expondo as glândulas mamárias acoplada à parte inferior da pele. Prosseguir e completar um lado de cada vez (Figura 1C).
- Utilizando uma pinça, levante cuidadosamente a glândula mamária de juros e corte entre a glândula ea pele com pequenas tesoura afiada, começando a partir do exterior para a coluna vertebral do animal. Certifique-se de cortar com cuidado, para não pedaços de pele ou do músculo permanecer na glândula. Todas as glândulas mamárias (Figura 1) pode ser removido usando este protocolo, mas abdominal glândulas mamárias (# 4) são os melhores para a montagem de todo. A 2 ª e 3 ª glândulas têm alguns músculos interdigitados e enquanto eles podem ser usados para montar todo e histologia, eles podem não ser apropriados para todas as análises.
2. Montar toda
- Pelo menos, um dia antes da dissecção, prepare carmim solução alum dissolvendo 1g de carmim e 2,5 g de sulfato de alumínio de potássio em 500 ml de água destilada e ferver durante 20 minutos em um Erlenmeyer de 1 litro. Ajustar o volume final de 500 ml com água. Filtrar por papel Whatman e adicionar uma pequena quantidade de timol (poucos grãos) como conservante. Leve à geladeira. Após a coloração, carmim alum solução pode ser despejada de volta para a garrafa de ações e reutilizados várias vezes durante várias semanas. Faça uma nova solução quando a cor se torna fraco.
- Após excisão da glândula mamária do mouse (passo 1), espalhe-o diretamente sobre uma lâmina de vidro. Tente alise-o, tanto quanto possível, mantendo o original na forma in situ. A glândula vai ficar muito bem no slide quando devidamente esticada.
- Corrigir a glândula mergulhando-o, no slide, em fixador de Carnoy (100% EtOH, clorofórmio, ácido acético glacial; 06:03:01) por 4 horas na capela à temperatura ambiente em um frasco. Note-se que outros autores utilizaram duas horas que parece ser suficiente. Alternativamente, as glândulas também pode ser fixado em 4 ° C durante a noite.
- Lavar em etanol 70% por 15 min. Então, gradualmente reidratar em água através da remoção de metade da solução de etanol a partir do jar e substituindo-o DDH 2 O. Incubar por 5 min. Repita 3 vezes. Como alternativa, use 70% -, 35% -, 15% - banhos de etanol e água por 5 minutos cada.
- Enxágüe em água destilada por 5 minutos.
- Mancha em alum carmim durante a noite a temperatura ambiente. Note-se que a coloração pode demorar mais dependendo da espessura da glândula.
- Remova a mancha carmim alum para reutilizar e, gradualmente, desidratar o tecido manchado através de banhos de etanol de série (50%, 70%, 95%, 100%) por 5 min cada um e claro em xileno, ou em uma alternativa não-tóxica, como Histo-clara, durante a noite. Ambos desidratação e limpeza também pode exigir mais incubações com amostras mais espessas.
- Glândula mamária mergulhe em salicilato de metila. Glândulas mamárias podem ser mantidos em salicilato de metila em uma capela até imagens estão prontas para serem tomadas.
- As imagens podem ser tomadas em uma capela com uma câmera digital comum posicionada sobre um tripé (use a função "macro" se disponível), colocando as lâminas sobre uma mesa de luz. Use um microscópio de dissecação para maior ampliação. Alternativamente, glândulas mamárias pode ser montado em mídia, como Permount (após o passo 2.7) permitindo imagens a serem tomadas fora de uma Cobertura de vapores químicos em qualquer plataforma de imagem fornecendo as montagens são suficientemente fina.
- A fim de quantificar o desenvolvimento da glândula mamária usando montar todo, medidas tais como o número de ramificações (ou ramos laterais) ao longo de trechos dos dutos, o comprimento dos dutos primários, ou um rácio de epiteliais para a área de tecido adiposo pode ser avaliada. Finalmente, depois de documentação fotográficação, montar toda glândula mamária pode ser incluído em parafina para corte e coloração histológica convencional.
3. Ocitocina induzida pela ejeção do leite
- Separar os filhotes da barragem só depois de terem sido alimentados. Esperar 1 hora antes da realização do ensaio.
- Sacrifício da mãe e expor as glândulas mamárias como descrito anteriormente (passos 1,1-1,8), sem removê-las do animal.
- Inicie a análise por uniformemente caindo tanto PBS ou a solução de oxitocina diretamente na glândula mamária de interesse, utilizando uma pipeta de transferência. Um amplo espectro de doses podem ser usadas; ~ 8 pg / ml (dose fisiológica) é normalmente usado. No entanto, alta não-fisiológicos doses (até 1 mg / ml) pode ser usado para garantir a ausência de resposta em modelos de ratos geneticamente modificados. Para este procedimento, é recomendado o uso torácica (# 2-3) glândulas, usando um lado como um controle (expostos a PBS) e do outro lado para testar ejeção do leite (exposição oxitocina).
- Incubar por 1 minuto e retire a solução com cuidado a aspiração com uma pipeta. Entrada de leite dentro dos ductos pode ser monitorado por gravação de fita de vídeo, ou ao tomar imagens antes e após a exposição PBS ou ocitocina.
4. Resultados representativos:
Em uma montagem toda boa, a glândula mamária está muito bem distribuídos e os dutos são facilmente observáveis epitélio (Figura 2A). Se a glândula não é bem-spread, ele pode levantar, em parte ou totalmente a partir do slide quando colocados na solução fixadora. A glândula, então, tornam-se duras e inutilizável (Figura 2B). Da mesma forma, se a glândula não é bem dissecada, ou alguma parte do epitélio pode estar ausente (Figura 2C) ou restantes partes da pele ou do músculo abdominal irá interferir com a análise da glândula (Figura 2D).
Para o ensaio de oxitocina, que é importante para separar os filhotes de sucção da barragem para a mesma quantidade de tempo em todas as ocasiões. Desta forma, você vai ter certeza que nenhum leite ou pequenas quantidades de leite está presente nos dutos antes da exposição a ocitocina, mas também que o leite o suficiente está presente nos alvéolos, que pode ser ejetado para os dutos por contrações mioepiteliais (Figura 3A) . Se os filhotes são retirados muito cedo, o leite pode se acumular nos alvéolos e nos dutos tornando o efeito da oxitocina difícil monitor (Figura 3B). Alternativamente, se o experimento é realizado muito cedo após a remoção das crias, o leite não terá tempo para acumular nos alvéolos e ocitocina induzida por contrações das células mioepiteliais não vai desencadear a liberação de leite suficiente para as condutas a serem observadas (Figura 3C).
Figura 1. Rato dissecção da glândula mamária. Pin o mouse sobre as suas costas por quatro membros (A). Corte a pele em primeiro lugar da barriga ao pescoço. Em seguida, fazer incisões perpendicular do centro do ventre para cada membro, como mostrado pela linha pontilhada (B). Descascar delicadamente a pele do lado do animal e fixá-lo, expondo as glândulas mamárias (C).
Figura 2. Rato montar toda glândula mamária. Dutos de epitélio (setas) e os linfonodos (seta) são facilmente observados em uma montagem muito bem glândula mamária espalhar toda a glândula # 4 (A). A glândula mamária pode se espalhar mal que se destaquem do slide e desabou, deixando-o inacessível (B). Uma glândula mamária inadequadamente excisadas pode ter partes em falta (C) ou pedaços de músculo ou pele restante (D). Note-se que as glândulas de 2 º e 3 º têm interdigitados muscular, mas ainda pode ser usado para montar todo ou histologia.
Figura 3. Ocitocina induzida pela ejeção do leite pode ser observado em dutos epitélio (setas) após a exposição a ocitocina (A). No entanto, se ductos já estão preenchidos com leite (setas) no início do ensaio, devido a um período longo de latência de forma inadequada após a última mamada dos filhotes, mais acumulação de leite nos ductos (setas) após a exposição a oxitocina é difícil observar (B). Alternativamente, um período de latência curto após mamar filhote não vai permitir que o suficiente para o acúmulo de leite nos alvéolos de ser devidamente observada nos dutos (setas) após exposição a ocitocina (C). Imagens foram tiradas antes e depois da oxitocina exposição usando uma câmera numérica (Cybershot, da Sony).
Figura 4. Representações esquemáticas de todo ensaios de tratamento de montagem e ocitocina.
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Discussion
Desenvolvimento da glândula mamária e função são bem orquestrado. Camundongos mutantes podem abrigar mutações genéticas que podem prejudicar o desenvolvimento da glândula mamária e função destacando a necessidade de avaliar a arquitetura da glândula 13,12. Montagem de todo pode ser realizada como descrito neste artigo em todas as fases de desenvolvimento da glândula mamária. Geralmente, o desenvolvimento do epitélio é avaliado no início da puberdade (~ 4 semanas de idade), no meio da puberdade (~ 6 semanas de idade) e após a puberdade (~ 10-12 semanas de idade) 2,10. Nessas etapas, a quantidade de ramificações do duto, o número de gemas terminais final e comprimento dos dutos pode ser determinado, a fim de quantificar o grau de desenvolvimento da glândula 14,15. Da mesma forma, alveologenesis (desenvolvimento dos alvéolos durante a gravidez) é geralmente determinada em 2-3 pontos durante a gravidez, as mudanças estruturais que ocorrem durante a lactação e involução também pode ser observado e quantificado em preparações montar toda glândula 16. No entanto, a quantificação de toda monta partir do final de ratas grávidas e lactantes pode ser difícil devido à densidade do tecido. Recomenda-se combinar montar todo com análises histológicas, especialmente para aqueles 12 estágios. Para mais detalhada avaliação histológica, glândulas mamárias pode ser removido usando o mesmo protocolo observado neste relatório, fixados em formol e submetido a hematoxilina-eosina. Montar todo também pode ser incluído em parafina e utilizado para exame histológico, uma vez imagens tenha sido realizada. Para ambas as técnicas, a dissecção adequada e delicada das glândulas mamárias é crucial. Se ratos mutantes estão sendo avaliados, é importante comparar esses ratos para os ratos controle mais próximo possível, já que diferentes linhagens de camundongos pode mostrar lado ou variável terciário ramificações, ou alveologenesis 17. Por exemplo, quando em comparação com camundongos BALB / c, camundongos C57BL / 6 exibem reduzida lado ramificação e alveologenesis 17,18. Assim, camundongos BALB / c não deve ser usado como um controle de camundongos geneticamente modificados gerada sobre um fundo C57BL / 6 mouse. Ao montar toda fornece insights sobre graves defeitos de desenvolvimento, a função da glândula mamária também pode precisar de ser avaliada por meio de outras técnicas complementares.
A principal função da glândula mamária é produzir e entregar leite para os filhotes. Esses processos requerem não apenas a diferenciação adequada de células secretoras luminal durante a gravidez, mas também coordenar as contrações e eficiente das células mioepiteliais em torno dos alvéolos e ao longo dos dutos para transporte de leite 8. Enquanto a produção de leite e de qualidade pode ser avaliada por avaliação analítica da composição do leite 12, entre outras, as causas da entrega de leite diminuída para os filhotes é mais difícil de avaliar. De fato, a ausência de leite observada nos estômagos de filhotes recém-nascidos pode ser ligado a muitos defeitos, tais como a produção de leite diminuída, incapacidade de os filhotes a mamar, defeitos de comportamento da mãe ou defeitos ejeção do leite. Uma forma de avaliar o transporte de leite e defeitos de ejeção dos alvéolos para os dutos é induzir as contrações mioepiteliais uso de ocitocina, como descrito neste artigo. No entanto, a quantificação do transporte de leite e de ejeção é difícil, pois o efeito da oxitocina ex vivo é rápido (normalmente leite pode ser observado nos dutos dentro de 1 minuto após a exposição), mesmo quando se utilizam baixas doses fisiológicas de ocitocina 10. Assim, uma pequena diferença na eficiência da ejeção do leite entre duas linhas do mouse pode não ser observável usando esta técnica. Quantificar essa resposta é difícil, mas de uma forma semi-quantitativa de avaliar a ocitocina induzida pela ejeção do leite é examinar a resposta em uma série de doses e determinar o tempo de tratamento necessário preencher dutos de leite. . Em todos os casos, a consistência do período de espera entre o filhote última mamada ao início do ensaio é crítica. Para uma quantificação mais precisa da lactação ou identificação de um defeito de ejeção do leite, este método pode ser complementado com a quantificação de proteínas do leite e vias de sinalização, tais como β-caseína e STAT5, respectivamente, ou in vitro de células mioepiteliais contração sobre a oxitocina exposição 19 .
Em resumo, os modelos de camundongos transgênicos são importantes e amplamente utilizados para estudar a função da glândula mamária e desenvolvimento, e avaliar o papel dos genes-chave nesses processos. A arquitetura do epitélio da glândula mamária pode ser facilmente observado nas glândulas excisadas adequadamente usando montar todo em todas as fases do desenvolvimento. Enquanto defeitos lactação levando à desnutrição filhotes podem ter muitas origens, uma deficiência de ejeção do leite pode ser avaliada por ocitocina induzida pela contração sincronizada de células mioepiteliais in situ. Juntas, essas duas técnicas (Figura 4) pode dar importantes insights sobre o efeito do gene específico mutações ou exclusões no desenvolvimento da glândula mamária e função.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Estes estudos foram financiados pelo CIHR e subvenções CBCRA para DWL. IP foi financiado por bolsas de CIHR-STP, FRSQ e CIHR. MKGS foi financiado por bolsas de estudo e OGS CIHR-STP. Os autores agradecem Kevin Barr por sua assistência com a criação do mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
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