一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内 该方法利用外加电场诱导细胞质膜通透性发生的瞬时增加。
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摘要
摘要
在哺乳动物视网膜发育过程中表达的基因功能表征仍是一项重大挑战。通过基因靶向技术构建组成型或条件型功能缺失敲除模型，成本高、耗时长，且需要大量人力。此外，视网膜中表达的基因可能在视网膜外具有重要功能，因此采用敲除策略时可能导致非预期的干扰因素。此外，在功能获得实验中异位表达某个基因的能力，对于探究其在细胞命运决定和/或终末分化中的作用具有极高价值。
我们介绍一种通过电穿孔将DNA质粒快速高效地导入新生小鼠视网膜的方法。施加高于特定场强的短时电脉冲可导致细胞质膜通透性瞬时增加，从而促进物质跨膜转移 1,2,3,4开创性研究证明，电穿孔可通过诱导形成亲水性细胞膜孔，使高电荷DNA分子穿越脂质双分子层，从而实现将基因导入哺乳动物细胞。 5持续的技术发展使得电穿孔作为一种方法具有了可行性 体内 包括视网膜在内的多种小鼠组织中的基因转移，其方法在本文中予以描述 6, 7, 8, 9, 10.
将DNA溶液注射到新生（P0）小鼠视网膜下腔，使DNA位于视网膜色素上皮与视网膜之间，随后使用镊子电极施加电脉冲。小鼠眼睛的侧位分布有利于镊子电极轻松定位，实现负极-DNA-视网膜-正极的必要排列。转移基因的广泛整合与表达可在出生后第2天（P2）检测到。由于视网膜细胞缺乏显著的侧向迁移，因此会形成电穿孔区域与非电穿孔区域。在适当情况下，非电穿孔区域可作为内部组织学对照。
视网膜电穿孔可用于在泛表达启动子（如 CAG）驱动下表达基因，或利用 shRNA 构建体或 Cre 重组酶破坏基因功能。通过设计带有细胞特异性基因启动子的构建体，可实现更精确的表达定位。电穿孔细胞的可视化可通过表达 GFP 的双顺反子构建体，或共电穿孔一个 GFP 表达构建体来实现。此外，可同时电穿孔多个构建体，以研究基因间的组合效应，或实现不同基因的同步过表达与功能缺失。视网膜电穿孔还可用于基因组顺式调控元件的分析，方法是构建相应的表达载体及缺失突变体。此类实验可用于鉴定足以或必需介导细胞特异性基因表达的顺式调控区域11。实验的潜在应用仅受限于构建体的可获得性。
方案
1. 电穿孔质粒的制备
电穿孔所需的DNA浓度为5μg/μl。通常需要使用Maxi-prep（Qiagen）或等效方法扩增所需质粒，随后对DNA进行纯化并浓缩至工作浓度。以下步骤描述了将DNA制备至工作浓度的过程。
- 取100 μg DNA（来自Maxi-prep或等效方法），加水稀释至100 μL，以便操作。
- 加入苯酚；苯酚的用量应根据DNA与总体积的比例计算，使DNA/体积比约为60%（μg DNA:总体积），例如：100 μg DNA（溶于100 μL）加入67 μL苯酚（100 μg:167 μL）。充分混匀；避免反复吹打，以免造成DNA过度剪切。
- 在室温下以14000 RPM离心5分钟。
- 收集上清液，按照步骤1.2中的DNA与总体积比例加入氯仿；按步骤1.2所述方式混匀，然后在室温下以14000 RPM离心5分钟。
- 收集上清液，向DNA溶液中加入相当于上清液体积10%的3 M乙酸钠，轻轻混匀，再加入相当于上清液体积2.5倍的100%乙醇。通过颠倒混匀。DNA应在混匀过程中从溶液中沉淀析出。
- 在4°C、14000 RPM条件下离心10分钟。
- 用350 μL 70%乙醇洗涤沉淀，在4°C、14000 RPM下离心5分钟。
- 将沉淀空气干燥，然后用1×PBS（细胞生物学级）溶解DNA至浓度为5 μg/μL。切勿过度干燥样品，否则将难以溶解于PBS中。
- 向DNA溶液中加入快绿染料（10%母液），使染料终浓度为0.1%，作为注射示踪剂。
2. DNA的视网膜下注射
以下步骤需在体视显微镜的辅助下进行。经过练习后，开睑、切口和注射过程可在1.5分钟内完成，这一时间不足以使已适当麻醉的幼鼠苏醒。使用锋利的30号针头，沿融合的睑缘上皮小心切开以打开眼睛（图1C）。切勿施加过大压力，以免损伤下方的眼球组织。避免切割超出眼睑交界范围，否则会引起出血，从而影响注射操作的视野。
- 将新生小鼠置于冰上麻醉数分钟（图 1A），切勿将幼鼠完全埋入冰中，以免导致死亡。每只幼鼠所需冰上麻醉时间存在差异，通常 5 分钟已足够，但需密切观察个体反应，部分个体可能迅速进入麻醉状态，或需延长暴露时间以确保充分麻醉。使用止血钳轻夹足掌，检测回缩反射以确认麻醉效果。
- 为便于将 DNA 注入视网膜下腔，需先打开眼球。用 70% 异丙醇消毒棉签（Tyco healthcare）擦拭待注射眼，并识别上下眼睑融合处的连接部上皮（图 1B）。
- 使用锋利的 30 号针头，沿连接部上皮小心切开眼球（图 1C）。避免施加过大压力，以防损伤下方眼球组织。切口范围不应超出眼睑连接区域，否则可能导致出血，影响注射视野。
- 为便于钝头注射针穿透眼球，可用 30 号针头尖端在角膜与巩膜交界处附近的巩膜上制作一小切口（图 1E）。切勿刺入过深，以免穿破晶状体。
- 使用微量注射器（Exmire 微量注射器；Ito corp，外径 0.52 mm，内径 0.13 mm）的刻度，吸取 0.3 μl DNA 溶液至 33 号钝头注射针中，每次注射均需单独量取体积。将针头插入切口，直至感受到对侧巩膜壁的阻力。推进针头穿过玻璃体腔时，需小心避免刺入晶状体（图 2B）。
- 用食指或拇指缓慢推动注射器活塞，将 0.3 μl DNA 溶液注入视网膜下腔。操作者必须严格控制活塞推进速度，确保 DNA 溶液注入速率不超过其在视网膜下腔内的扩散速率（图 2C）。由于 DNA 溶液具有黏性，应避免针头过度紧贴对侧巩膜壁，否则可能导致 DNA 无法注入或分布不均。成功的注射可在视网膜下腔局部实现 DNA 溶液的均匀扩散。旋转注射后的动物时，应能清晰观察到视网膜上存在绿色示踪剂和无示踪剂的区域。
3. 电穿孔
- 使用 10 mm 直径镊形电极（型号 #522；BTX Instruments）进行电穿孔。将镊形电极浸入 PBS 中，以最大限度提高电极与动物之间的电导率，并将注射后的幼鼠头部置于两电极之间，使注射侧眼睛靠近正极电极，未注射侧眼睛靠近负极电极（图 3B）。
- 使用脉冲发生器施加五个方波脉冲：每个脉冲为 80 伏特，持续 50 毫秒，脉冲间间隔 950 毫秒。
- 电穿孔后的幼鼠必须保温直至从冰麻醉中恢复。可通过将幼鼠置于加热灯下或载片加热器上实现。若使用载片加热器，需确保在金属表面与恢复中的幼鼠之间放置适当的垫层。恢复后，将电穿孔的幼鼠送回母鼠身边。
4. 分析用眼睛的制备
- 收获和分析电穿孔后视网膜的时间应根据实验目的而定。电穿孔后3天可初步观察到GFP表达。如需进行冷冻包埋和切片，请按以下步骤操作。
- 在预定时间点处死电穿孔动物，取出电穿孔的眼球，并在4°C下用4%多聚甲醛固定50分钟。
- 通过显微解剖去除巩膜、角膜、晶状体、脉络膜及视网膜色素上皮，小心分离出视网膜。解剖后的视网膜可在荧光显微镜下观察，以初步评估电穿孔效率。将视网膜转移至30%蔗糖溶液中，4°C下过夜。
- 将视网膜包埋于O.C.T.冷冻包埋介质（Sakura Finetek USA）中，于-80°C保存。此后可用冷冻切片机对视网膜进行切片，并将切片转移至载玻片上。
5. 代表性结果：
图4展示了在出生后第0天（P0）新生小鼠视网膜电穿孔转入pCAG-EGFP表达质粒后3天（P3）和14天（P14）的示例。每次实验中被电穿孔的视网膜组织区域存在差异，这取决于注射过程中造成的组织损伤程度以及DNA溶液在视网膜下腔扩散的均匀性。通常情况下，90–100%的电穿孔视网膜中均可见成功整合并表达所引入质粒的细胞。然而，综合考虑组织形态学特征和电穿孔效率，仅有40–60%的电穿孔视网膜适用于比较分析。针头穿刺部位几乎总是出现玫瑰花环样结构（rosette）形成和视网膜脱离，该区域不应用于分析。微注射过程中若DNA溶液扩散良好，则可在针头穿刺部位侧方获得无玫瑰花环样结构和视网膜脱离的高效电穿孔组织。胶质增生也是实验中需要关注的重要问题，通常在针头穿刺部位几乎总会发生。但与玫瑰花环样结构形成和视网膜脱离类似，侧方电穿孔区域的胶质增生通常不显著。可利用免疫组织化学标记物（如胶质纤维酸性蛋白，GFAP）来判断分析区域内反应性胶质增生水平是否处于可接受阈值范围内。文中展示了视网膜切片结果，显示电穿孔后视网膜形态保持完整，且EGFP表达可清晰标记单个被电穿孔的细胞。图中分别展示了P0电穿孔后3天（图4A–C）和P0电穿孔后14天（图4D–F）的示例。
在P3视网膜中，大部分电穿孔的细胞位于视网膜的神经母细胞层（NBL），尚未表现出视网膜任何已分化神经细胞或胶质细胞的明显形态学特征（图4B, C）。到P14时，电穿孔的细胞可分布于视网膜的外核层（ONL）和内核层（INL）。此外，这些标记的细胞现已呈现出分化神经元的典型形态学特征，包括内核层中的中间神经元、光感受器细胞以及 Müller 胶质细胞（图4E, F）。
图1. 对新生（P0）小鼠幼崽进行麻醉并打开眼睛以进行DNA溶液的视网膜下注射。A) 将新生幼崽置于碎冰床上进行麻醉，待注射的眼睛朝下紧贴冰面。B) 眼睑融合连接上皮（B，箭头）的位置，需在此处切开以打开眼睛。C) 沿眼睑融合连接上皮（C，箭头）切开以暴露眼球。D) 在融合连接处切开后的眼部状态。E) 在角膜下方的巩膜处对眼球进行切口，以便于钝头微注射针头顺利插入。比例尺，B、C、D、E：4mm。
图2. 将平头末端的显微注射针插入并将其DNA质粒溶液注入视网膜下腔。A) 示意图展示显微注射针正确插入眼球，并将针尖定位于视网膜下腔。若将DNA溶液注射至玻璃体腔、针头穿通眼球进入眼窝，或注射至晶状体，将导致实验失败，几乎无法获得电转染细胞。B) 注射针穿入巩膜壁切口，并将针尖置入视网膜下腔。C) 将DNA溶液注入视网膜下腔。比例尺，B、C：4 mm。缩写如下：R-视网膜，L-晶状体，V-玻璃体，SrS-视网膜下腔，BES-平头末端注射针。
图3. 镊子电极在小鼠上的取向用于电穿孔。A) 示意图卡通图，展示镊子电极的正极和负极桨片相对于电穿孔眼的取向。绿色表示注射到视网膜下腔的DNA位置。虚线箭头表示带负电荷的注射DNA在电场作用下向正极移动。DNA电泳从靠近负极的视网膜下腔进入朝向正极方向排列的视网膜。B) 镊子电极的正极桨片置于注射DNA的眼球附近，负极桨片置于未注射的眼球附近。C) 镊子电极在新生小鼠上放置位置的高倍放大图像。虚线表示DNA向正极方向电泳移动的路径。比例尺，C：5 mm。
图 4. 在出生后第 0 天（P0）通过电穿孔转染 pCAG-EGFP 的新生小鼠视网膜，并在出生后第 3 天（P3）和出生后第 14 天（P14）进行分析。A-C) 在 P0 时用 pCAG-EGFP 电穿孔的 P3 视网膜切片的共聚焦图像。大多数被电穿孔的细胞位于视网膜神经母细胞层（NBL）中。D-F) 在 P0 时用 pCAG-EGFP 电穿孔的 P14 视网膜切片的共聚焦图像。被电穿孔的细胞可在视网膜的外核层（ONL）和内核层（INL）中被识别。比例尺，A-F：50 μm。
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讨论
体内电穿孔是一种快速且高效的方法，可用于将DNA表达质粒转染至视网膜细胞。该方法使实验者能够通过在普遍表达的启动子控制下异位引入目的基因，开展基因功能获得性研究；或通过使用靶向目的基因的shRNA构建体，开展基因功能缺失性研究。此外，可同时电穿孔多个DNA质粒，使实验者能够分析多个基因的效应，或在引入第二个目的基因的同时敲低某一基因。当存在带有floxed目的基因的动物时，还可利用驱动Cre重组酶表达的质粒电穿孔，以嵌合方式消除基因表达。该方法对于区分基因的内在功能与外在功能尤为有价值。相反，在传统基因敲除小鼠的视网膜中电穿孔回目的基因，则可使实验者开展挽救实验，尝试逆转在基因敲除中观察到的表型。可根据具体研究需求，使用任意遗传背景的小鼠品系进行电穿孔。然而，若条件允许，最好选用母性行为较强的品系，例如Swiss Webster或CD1，以尽量降低电穿孔后仔鼠被母鼠遗弃的可能性。白化实验小鼠品系更易于操作，因为在显微注射过程中DNA溶液的扩散可被清晰观察。而眼内色素较深的品系（如C57BL/6J）则更具挑战性，因为Fast Green示踪剂难以与视网膜色素上皮的色素区分开来。
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致谢
本工作由NIH R01EY020560-01和W.M. Keck医学研究青年学者奖资助。作者感谢Joseph Bedont在视网膜样本成像和注射过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 缓冲液饱和酚 | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| 氯仿 | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| 醋酸钠 | JT Baker | 3470-05 | 3 M 储存液 |
| 亮蓝FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % 储存液 |
| 异丙醇棉片 | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30号针头 | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire 微量注射器 | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode（镊子电极） | BTX Technologies | 522 | N/A |
| 电穿孔仪（电穿孔装置） | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
参考文献
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