Summary
Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.
Abstract
מיו-אינוסיטול נמצא בטבע ללא שינוי או יותר derivates phosphorylated מורכבים. מבין האחרונים, שני הנפוץ ביותר התאים האיקריוטים הם pentakisphosphate אינוסיטול (IP 5) ו hexakisphosphate אינוסיטול (חומצה phytic IP או 6). IP ו-IP 5 6 הם מבשרי של מולקולות pyrophosphate אינוסיטול המכילים אחד או יותר אג"ח pyrophosphate 1. זירחון של ה-IP 6 מייצר diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 או PP-IP 5) ו bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP או 8 (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates אינוסיטול היה מבודד מכל אורגניזמים אוקריוטים למד עד כה. בנוסף, שני מעמדות שונים של אנזימים האחראים סינתזה pyrophosphate אינוסיטול שמורים לאורך האבולוציה מאוד 2-4.
IP 6 קינאזות (IP 6 Ks) posses גמישות עצומה קטליטי, ממיר ה-IP ו-IP 5 6-4 PP-IP ו-IP 7 בהתאמה, ולאחר מכן, באמצעות מוצרים אלה מצעים, לקדם את הדור של מולקולות מורכבות יותר 5,6 . לאחרונה, בשיעור השני של אנזימים pyrophosphate יצירת זוהה בצורה של החלבון שמרים VIP 1 (התייחס גם PP-IP 5 K), אשר מסוגלים להמיר 6 IP ל-IP ו-IP 7 8 7,8.
Pyrophosphates אינוסיטול להסדיר רבים בתהליכים תאיים שונים כגון הפרשת אינסולין 9, אורך הטלומרים 10,11, 12 chemotaxis, סחר שלפוחי 13, הומאוסטזיס פוספט 14 ו-HIV-1 לשחרר איסור פרסום 15. שני המנגנונים של פעולות הוצעו לסוג כזה של מולקולות. הם יכולים להשפיע על התפקוד התאי ידי allosterically אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים כמו AKT 16. לחלופין, הקבוצה pyrophosphate יכול לתרום פוספט מראש phosphorylated חלבונים 17. הפוטנציאל העצום של תחום מחקר זה הוא הקשו על ידי בהעדר מקור המסחרי של pyrophosphates אינוסיטול, אשר מונע מדענים רבים ללמוד את המולקולות הללו ואת זה שינוי החדשה שלאחר translational. השיטות הקיימות כיום לבודד pyrophosphates אינוסיטול דורשים מנגנון מתוחכם chromatographic 18,19. נהלים אלה להשתמש תנאים חומציים שעשוי להוביל השפלה pyrophosphate אינוסיטול 20 ובכך התאוששות עניים. יתר על כן, מסורבלת פוסט טור נהלים desalting להגביל את השימוש שלהם במעבדות מיוחדות.
במחקר זה אנו מתארים שיטה תובעני לבידוד, הדור וטיהור של המוצרים של kinase-6 IP ו-IP PP-5-קינאזות תגובות. שיטה זו התאפשרה על ידי היכולת של ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) כדי לפתור polyphosphates אינוסיטול phosphorylated מאוד 20. לאחר 6 IP K1 ו PP-IP 5 תגובות אנזימטיות באמצעות 6 K-IP כמו המצע, PAGE שימש להפריד את pyrophosphates אינוסיטול שנוצר שהיו eluted לאחר מכן במים.
Protocol
1. תגובת אנזימתי - יום 1 (1 שעה אחר הצהריים)
- השלב הראשון הוא להכין 10-20 תגובות אנזימטיות עצמאית שבה IP 6 K1 או VIP1 להמיר IP 6 ל isoforms pyrophosphorylated.
- אנו משתמשים ב-IP שלו 6 K1 ו-GST Vip1 אנזימים מטוהרים מן E. coli לפי הפרוטוקול קודם לכן תיאר 17,18.
- הכן 50 תגובות μL המכיל 1X חיץ תגובה (30 mM Hepes pH 6.8, 50 mM NaCl, 6 מ"מ MgSO 4, 1 mM DTT), 6 PhosphoCreatine מ"מ (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg מלח), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 מיקרוגרם-IP שלו 6 K1 או GST-Vip1. כוונן את עוצמת הקול עם MiliQ DDH 2 O.
- בקצרה ספין התגובה לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה.
2. ג'ל polyacrylamide הליהוק וטעינה - יום 2 (4 שעות אחר הצהריים)
- הג'ל polyacrylamide מוכן באמצעות 24 ס"מ אורך, 18 ס"מ צלחות זכוכית רחב 1.5 מפרידי רחב מ"מ. בדרך כלל בסמטה 16 או מסרק נתיב יחיד preparative משמש.
- הכינו תערובת (50 mL / ג'ל) המכיל את הדברים הבאים: 35.5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:01, 1X טריס / borate / EDTA (TBE), 0.05% (w / v) persulfate אמוניום (APS ), 0.05% (w / v) Temed. יוצקים את תערובת בין טרום casted לוחות זכוכית, הכנס את המסרק ולתת לפלמר במשך 30-60 דקות בכל RT.
- לאחר ג'ל יש polymerized, להעביר את מנגנון לחדר קר מראש לרוץ TBE 1X למשך כ 30-60 דקות ב 200-300 וולט.
- הוסף 1X של OrangeG צבען (10 mM טריס-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, גליצרול 30%, 0.1 OrangeG%) לתגובה כל אחד. הכן מדגם המכיל 2 nmol IP של 6 כדי לטעון כביקורת רגילה.
- שטפו ביסודיות עם כל טוב מפעיל המאגר באמצעות מזרק ומחט 21G להסיר כל המשקע, ואז לטעון את הג'ל. הימנע טעינה על בארות לוואי.
- הפעל את ג'ל לילה בבית 450-550 וולט (7 mAmp / ג'ל), עד שהלהקה לצבוע OrangeG הוא בתוך 10 ס"מ האחרונה מתחתית הג'ל.
3. בידוד ה-IP של 7 - יום 3 (4 שעות) יום 4 (07/06 SpeedVac שעה תהליך הייבוש)
- לפרק את המנגנון ג'ל ובזהירות להסיר את אחד צלחת זכוכית עוזב את הג'ל על השני. חותכים חלק קטן מן הג'ל מעל הלהקה לצבוע OrangeG לתחתית המכיל את תקן ה-IP 6 ואחד במסלול מדגם, כפי שמוצג באיור 1.
- הכתם לחתוך את החלק של הג'ל עם Toluidine כחול (0.1% (w / v) toluidine כחול, 20% (w / v) מתנול, 2% (w / v) גליצרול) במשך כמה דקות (1-3 דקות) או עד pyrophosphate אינוסיטול הלהקה מופיעה. שים את צלחת זכוכית הוסרו בעבר חזרה על גבי ג'ל כדי למנוע את הג'ל בלא כתם מהתייבשות.
להקת ה-IP 7 צריך להיות גלוי מאז הוא פועל מעט איטי יותר מאשר תקן ה-IP 6. ה-ATP, אשר פועל מהר יותר מאשר 6 IP, צריך גם להיות גלוי (איור 1). מעבירים את החלק המוכתם של הג'ל בתמיסה דה מכתים (20% (w / v) מתנול) במשך כמה דקות, לשטוף את כל העולה על Toluidine כחול למקם את הג'ל עם הג'ל בלא כתם.
אם להדמיה של יותר isoforms אינוסיטול pyrophosphorylated (IP ו-IP 8 9) נדרש, הכתם ג'ל עם פתרון מכתים כחול Toluidine במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את בלו Toluidine עם פתרון דה מכתים במשך כ -15 דקות.
- עם סכין גילוח לחתוך את להקת ה-IP 7 על החלק בלא כתם של ג'ל באמצעות כהפניה את עמדת ה-IP 7 נודדות נקבע עם הג'ל צבעונית (איור 1).
- שים את להקת ה-IP 7 כי נחתך מן הג'ל על שפופרת 15 מ"ל והוסף 10 מ"ל של MilliQ DDH 2 O. שים צינורות סיבוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מחק את הנוזל כדי להסיר עודף של חלקיקי acrylamide TBE ו מיקרוסקופיים.
- לאחר מכן, לבצע שתי התייבשות-הידרציה מחזורים. הוסף 5 מ"ל של 50% (w / v) מתנול אל הצינור עם ג'ל המכיל 7 IP ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. מעבירים את הפרוסה ג'ל לצינור חדש 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של MilliQ DDH 2 O ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. אין להשליך את מתנול MilliQ H 2 O מן הצינורות. חזור על מחזור התייבשות-הידרציה עוד פעם מחדש על ידי העברת ג'ל polyacrylamide ב 15 צינורות מ"ל השתמשו בעבר. אחד שוטף יכול להתבצע במשך הלילה.
- כדי לרכז את ה-IP eluted 7, יבש 10 מ"ל יחד (5 מ"ל MilliQddH 2 O ו - 5 מ"ל 50% (w / v) מתנול) באמצעות SpeedVac מחומם על 60 ° C.
- לאחר הדגימות הם כמעט יבש, להעביר את הנוזל הנותר (300-600 μl) אל צינור a1.5 מ"ל צנטריפוגות ספין 2 דקות בסל"ד 5000.
- איסוף supernatant ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגות טריים 1.5 מ"ל; לעזובμL התחתונה 20-30 שכן הוא עשוי להכיל חלקיקים acrylamide.
- אם יש צורך להמשיך את תהליך הייבוש באמצעות SpeedVac מוסק. ההתאוששות של ה-IP 7 מצטמצם באופן דרמטי אם הדגימות להתייבש לחלוטין, ולכן לסיים את תהליך הייבוש כאשר הדגימות להגיע נפח μL 100-300.
4. קביעת ריכוז 7 טוהר ה-IP.
- השתמש 2-5 μL של המדגם התאושש IP 7 לרוץ על ג'ל דף, בדומה סעיפים 2.2-2.5. טען דילולים מספר 6 של ה-IP (כלומר, 0.5, 1, 2, 4 nmol) כסטנדרט ריכוז 4 nmol של סמן Poly-P. לאחר הפעלת ג'ל, לדמיין את isoforms pyrophosphate אינוסיטול ידי מכתים ו-de מכתים את הג'ל שלם עם פתרון Toluidine כחול, בעקבות ההליך המתואר בסעיף 3.2 (איור 2 א).
- לאחר מכתים Toluidine, ריכוזי ניתן לקבוע על ידי סריקת הג'ל ומשווה את ההבדלים בעוצמת בין 6 IP ו-IP 7, באמצעות תוכנת הדמיה כגון J-תמונה, כפי שמוצג באיור 2B.
5. נציג תוצאות:
ההמרה preparative האנזימטית של ה-IP ל-IP 6 7 IP באמצעות אנזימים 6 K1 ו VIP1 ניתן לפתור בקלות באמצעות ניתוח PAGE (איור 1). הטעינה של 6 IP כביקורת גודל יחד עם מכתים ג'ל כחול Toluidine מאפשר זיהוי derivates pyrophosphorylated, שכן הם לרוץ לאט בהתאם למספר קבוצות פוספט הנוכחי על הטבעת אינוסיטול. ההליך המתואר לעיל מאפשרת טיהור קל של 7 IP. ניתוח pyrophosphate אינוסיטול מטוהרים על ידי גילה את הטוהר של ה-IP שלנו 7 (איור 2 א). מעניין, 5 1/3PP-IP האיזומר של מוצר ה-IP של 7 VIP1 נודד מעט איטי יותר מאשר האיזומר 5 5PP-IP של 7 IP שנוצר על ידי ה-IP 6 K1. שימוש של 6 תקנים IP היתר כימות קל של ריכוז ה-IP מטוהרים 7 (איור 2B). לפני השימוש 7 IP עבור ניסויים נוספים, הפעילות הביולוגית שלו ניתן להעריך
(איור 3). 5PP IP-5 הוא מודגרות עם VIP1 ועם phosphatase 7 IP DDP1 (phosphohydrolase diphosphoinositol polyphosphate). באופן שגרתי, את ה-IP מטוהרים 7 מומר IP 8 על ידי VIP1 ו-IP 6 על ידי DDP1 (איור 3).
איור 1:. מכתים Toluidine הדף ובידוד של הלהקה 7 IP החלק של ג'ל המכיל את תקן (IP 6) נחתך ומוכתמת באמצעות פתרון כחול Toluidine. שלוש להקות מייצגים (מלמעלה למטה) IP 7, 6 ו - IP-ATP. החלק המוכתם של ג'ל היה מיושר אז עם הנותרים של הג'ל. זה מאפשר לוקליזציה של החלק של ג'ל המכיל 7-IP, אשר לאחר מכן ניתן לחתוך מטוהרים (תיבת מקווקו).
איור 2: ניתוח עמוד של מוצרים 6 K1 ו VIP1 IP התגובה. א) ניתוח של ה-IP 6 (4, 2, 1, 0.5 nmol) על ידי מכתים Toluidine כחול היה בשימוש על מנת לקבוע את ריכוז ה-IP 7 מטוהרים משני 6 K1 IP (IP 5PP-5) ו VIP1 (1/3PP-IP 5) התגובות. B) העלילה ניתוח פיזור כדי לקבוע את ריכוז ה-IP מטוהרים 7. ריכוזים נקבעו לפי עוצמת הלהקה, מחושב באמצעות תוכנת imageJ, לעומת מראש כמויות של 6 IP. ציר ה-X מייצג את עוצמות; ציר Y מייצג את ריכוזי לידי ביטוי nmol.
איור 3:. ניתוח הפעילות הביולוגית 7-IP כדי לקבוע את איכות ה-IP מטוהרים 7 אנו מודגרות 5PP-IP 5 (IP 6 K1 IP שנוצר 7) עם VIP1 או עם phosphatase 7 IP DDP1 והחליט אז התגובה בדף. מכתים DAPI ו Toluidine חשף את הייצור הצפוי של 8 IP ידי VIP1 ואת ההמרה של ה-IP ל-IP 7 6 על ידי DDP1.
Discussion
השימוש pyrophosphate אינוסיטול בביוכימיה מוגבלת בשל זמינותו המסחרי של תרכובות כאלה רגישות העניים של שיטות זיהוי קיימות. השילוב של דף, המאפשר הפרדה של מולקולות בעלי מספר שונה של קבוצות פוספט, וכן Toluidine כחול (איור 1), צבע metachromatic אשר נקשר קבוצות פוספט, מאפשר זיהוי קל של isoforms pyrophoshate אינוסיטול פתיחת אפיקים חדשים של מחקר 20.
השימוש בטכנולוגיה המתוארת PAGE לטהר מוצרים pyrophosphate אינוסיטול התגובה האנזימטית נשאו outby או 6 IP K1 או VIP1 היא שיטה פשוטה, כלכלית אמינה המאפשרת ייצור של כמויות גדולות של ה-IP באיכות גבוהה 7. השיטה שתוארה לעיל אינה מוגבלת טיהור הפשוט של ה-IP 7 אבל שינויים קלים של פרוטוקול המתואר עשוי לאפשר טיהור של מגוון שונה של pyrophosphates אינוסיטול. פוספורילציה גבוהה isoforms pyrophosphate אינוסיטול, המכיל יותר משמונה קבוצות פוספט ניתן לאתר באמצעות IP 7 או כמויות שונות של 6 IP כמו מצע 20,6. Pyrophosphates אינוסיטול אלה ניתן לאתר על ידי הגדלת אורך ההליך מכתים ולאחר מכן מטוהרים (סעיף 3.2). יתר על כן, השימוש 5 IP כמו המצע של התגובה האנזימטית תאפשר טיהור PP-IP ו 5 pyrophosphates אינוסיטול אחרים המכילים קבוצת הידרוקסיל על הטבעת אינוסיטול.
לסיכום, שיטה זו מאפשרת תובעני לטיהור אמין של כמויות מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול עם מכשירים זמינים באופן נרחב, ובכך פותח אפיקים חדשים בתחום מחקר זה מרגש.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים א ריקיו להערות מועיל לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה במימון רפואי (MRC) מחקר ליחידת ביולוגיה של התא ועל ידי האדם Frontier Science Program גרנט (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
