İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.
Myo-inositol, doğa ya da değiştirilmemiş veya daha karmaşık fosforile türevleri mevcuttur. Son ki, ökaryotik hücrelerde en bol iki inositol pentakisphosphate (IP 5) ve inositol hexakisphosphate (fitik asit ya da IP 6). IP 5, IP 6, bir ya da daha fazla pirofosfat bağlar 1 içeren inositol pirofosfat moleküllerin habercileri . IP 6 Fosforilasyon diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 veya 5 PP-IP) ve bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 veya (PP) 2-IP 4) üretir. İnositol pyrophosphates şimdiye kadar üzerinde çalışılan bütün ökaryotik organizmalardan izole edilmiştir. Buna ek olarak, iki ayrı sınıflar inositol pirofosfat sentezi için sorumlu enzimlerin yüksek 2-4 evrim boyunca korunmuş.
IP 6 kinazlar (IP 6 Ks) sahip muazzam bir katalitik esneklik, 5 IP ve IP 6, PP-IP 4 ve sırasıyla IP 7 ve daha sonra, substrat olarak bu ürünleri kullanarak, daha karmaşık moleküller nesil 5,6 teşvik dönüştürme . Son zamanlarda, pirofosfat üreten enzimlerin ikinci sınıf bir IP 7 ve IP 8 7,8 6 IP dönüştürmek mümkün maya protein VIP 1 formu (PP-IP 5 K olarak anılacaktır), tespit edilmiştir.
İnositol pyrophosphates insülin salgılanması 9, telomer uzunluğu 10,11, kemotaksi 12, veziküler kaçakçılığı 13, fosfat homeostazı 14 ve HIV-1 gag sürümü 15 gibi birçok farklı hücresel süreçleri düzenler. Moleküllerin bu sınıf için eylem iki mekanizma ileri sürülmüştür. Allosterically AKT 16 gibi spesifik proteinlerin etkileşim hücresel fonksiyonları etkileyebilir. Alternatif olarak, bir fosfat pirofosfat grubu ön fosforile proteinler 17 bağışta bulunabilirsiniz. Bu araştırma alanında büyük bir potansiyel inositol pyrophosphates, pek çok bilim adamı bu moleküller ve bu yeni post-translasyonel değişiklik eğitim engelleyen bir ticari kaynak yokluğunda tarafından engellenmektedir. Inositol pyrophosphates izole etmek için mevcut yöntemleri gelişmiş kromatografi 18,19 gerektirir. Bu prosedürler, inositol pirofosfat bozulması 20 ve böylece kötü kurtarma yol açabilir asidik koşullarda kullanın . Ayrıca, hantal bir post-kolon tuzsuzlaştırma prosedürleri uzman laboratuarlar kullanımını kısıtlamak.
Bu çalışmada, IP, 6-kinaz ve PP-IP 5-kinazlar reaksiyonlar ürünleri üretimi, izolasyon ve saflaştırma için basit bir yöntem tarif . Bu yöntem, yüksek fosforile inositol polifosfatlar çözmek için 20 poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yeteneği sayesinde mümkün oldu . IP 6 K1 ve yüzey gibi IP 6 kullanarak IP PP-5 K enzimatik reaksiyonların ardından, SAYFA, daha sonra suda yıkandı, oluşturulan inositol pyrophosphates ayırmak için kullanılır oldu.
Biyokimya inositol pirofosfat ciddi bu tür bileşiklerin ticari kullanılamaması ve mevcut algılama yöntemleri kötü hassasiyeti ile sınırlıdır. Farklı fosfat grupları sayısı ve Toluidine Blue (Şekil 1), fosfat grupları bağlanır metakromatik boya, sahip moleküllerin ayrılmasını sağlayan SAYFA kombinasyonu araştırma 20 yeni yollar açılması inositol pyrophoshate izoformları kolay tespit edilmesini sağlar.
Outby yapılan enzimatik reaksiyon inositol pirofosfat ürünler arındırmak için SAYFA teknoloji açıklanan kullanım IP 6 K1 veya VIP1 ya da basit, ekonomik ve güvenilir, yüksek kaliteli IP 7 büyük miktarlarda üretim için izin veren bir yöntemdir . Yukarıda açıklanan yöntem 7 IP basit arıtma sınırlı değil ama açıklanan protokol küçük değişiklikler inositol pyrophosphates farklı bir dizi arıtma izin verebilir. Sekizden fazla fosfat grupları içeren Yüksek fosforile inositol pirofosfat izoformları, IP IP 6, 7 veya farklı miktarlarda bir substrat 20,6 olarak tespit edilebilir. Bu inositol pyrophosphates boyama prosedürünü uzunluğunun artırılması ve daha sonra saflaştırılmış (bölüm 3.2) tespit edilebilir. Ayrıca, IP 5 enzimatik reaksiyon için substrat olarak kullanımı 5 PP-IP arıtma ve inositol halka bir hidroksil grubu içeren diğer inositol pyrophosphates izin verecek.
Sonuç olarak, bu basit yöntem, böylece, bu heyecan verici araştırma alanı için yeni yollar açılması, yaygın kullanılan enstrümanlar ile inositol pyrophosphates miligram miktarda güvenilir arıtma sağlar.
The authors have nothing to disclose.
A. Riccio yararlı yorumlar için teşekkür ediyor ve el yazması okumak için. Bu çalışma Hücre Biyolojisi Birimi Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) finansman ve İnsan Frontier Bilim Programı Hibe (RGP0048/2009-C) tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |