Metoder för intravenös självadministrering i en musmodell

Summary

Den intravenösa självadministrering (IVSA) paradigmet anses vara den gyllene standarden för att undersöka de förstärkande egenskaperna hos läkemedel för missbruk hos gnagare. Detta manuskript beskriver de experimentella procedurer och kirurgiska tekniker som krävs för att få fram tillförlitliga IVSA data. I synnerhet noggrann kateter implantation och underhåll markerat.

Abstract

Djurmodeller har utvecklats för att studera de förstärkande effekterna av läkemedel, inklusive intravenösa självadministrering (IVSA) paradigm. Fördelarna med att använda en IVSA paradigm för att studera de förstärkande egenskaperna hos missbrukade droger som kokain inkluderar det faktum att läkemedlet är själv administrerade istället för försöksledaren administreras, kan schemat för förstärkning ändras, och noggrann mätning av mängden läkemedel konsumeras samt tidpunkten och mönstret av IV injektioner kan erhållas. Vidare undviker den intravenösa administreringsvägen potentiella förvirrar relaterade till första passage metabolism eller smak, och ger snabb ökning av blod och hjärnan nivåer drog. Såsom anges i denna video kan intravenös självstyre erhållas utan föregående mat begränsning eller tidigare drog utbildning efter noggrann kateter placering under operation och noggrann daglig kateter spolning och underhåll. Experimentella förfaranden som beskrivs i dennapapper innehålla en beskrivning av djurstallar och acklimatisering metoder operant träning med sötad mjölk lösningar och kateter implantationskirurgi.

Protocol

1. Djurstallar och acklimatisering förfaranden

1. Manliga och kvinnliga CD-1 möss hålls med samma kön kullsyskon, upp till 5 djur per bur, i vanliga plastburar innehåller beta-chip sängkläder och kuddar nestlet, med lock trådgaller att rymma vattenflaskor och mat. Standard musfoder och vatten finns tillgängligt ad libitum i hemburar hela experimentet.
2. Möss hålls på en omvänd ljus-mörk schema (ljus på från 22:00 till 10:00).
3. Möss får acklimatisera till IVSA tester rum för en vecka före starten av experimentella procedurer.

2. Operant träning

1. Samtliga beteendemässiga procedurer, inklusive sötad mjölk utbildning och injektionsmissbrukare självadministrering sessioner utförs med operanta kammare som mäter 15,9 x 14 x 12,7 cm, utrustad med 2 ultra-känsliga mus spakar, koppar Dipper, ljus stimulans och mikroliter pumpar spruta (Med AssociAtes Inc., St Albans, VT, USA). Chambers är gränssnitt till en dator med Med Associates Smart CR-gränssnitt och Med-PC-programvara för att programmera schema för förstärkning och samla in data.
2. Naiva möss vana vid de operanta kamrarna och utbildade för att spaken press med en sötad mjölk belöning (0,1 ml) presenteras i en skopa kopp. Operant mjölk utbildningen sker i 1-hr sessioner för 5-7 dagar. Slutförande av ett fast förhållande (FR) schemat på den aktiva spaken resulterade i presentationen av skopan Cup och belysning av en stimulans ljus. Den sötad mjölk lösningen bestod av sackaros (10 mg / ml, ACS-reagens, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis, MO, USA) sattes till helmjölk (3,25% fett). Operant träning med en sötad mjölk lösning eller en flytande livsmedel förstärkare är en vanlig teknik som används för att underlätta operant reagera i möss ^1,2.

3. Beredning av utrustning som skall användas vid kirurgi

RequIRED utrustning - 20, 23 och 26 nålar gauge, kvarn, 1 cc sprutor, Tygonrör, lödkolv, heparin, antibiotika och smärtstillande.

1. Förbered en nål för att styra införandet av katetern i halsvenen genom rakning ned en 20 gauge nål. Axeln av nålen rakas ned med användning av en kvarn för att bilda en kanal inuti nålen för att styra kateterröret in i venen. Nålen kanalen bör kontrolleras noggrant för någon metall skräp som kan ha deponerats. Eventuella hinder i kanalen bör skrapas ut med fina spetsar pincett.
2. Adapt två 1-cc sprutor som skall användas för spolning och kontroll katetern. Bered två sprutor genom att ta 12 cm bitar av Tygon-slang och fäst dem vid en ände till 26 gauge nålar fästa till 1 cc sprutor och sträcker de andra ändarna av slangen över 23 gauge nålar. En spruta ska fyllas med 0,9% steril saltlösning och den andra med en hepariniserad ticarcillin lösning (33 mg tikarcillinoch 0,3 mg heparin per 10 ml steril saltlösning).
3. Förbered kateterkanylen mössor. Tygonrör är spänd över en 23 gauge nål och skär 1 cm från avfasningen. Smält den öppna änden av röret för att skapa en tjock tätning. Slangen bör smältas så att hela kanylen locket är tillräckligt lång för att passa över kateterkanylen, med den förseglade änden passar tätt över änden av kanylen. Observera att om locket är för lång, finns en risk för att den kommer att böjas och därefter genomborrade under processen att fästa skruven on kateter täcker. Sålunda noggrann förberedelse av katetern locken rekommenderas, i syfte att åstadkomma en god passning till kanylen.
4. Förbered lösningar som krävs. Samtliga reagens köptes från Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis, MO, USA).
   1. Hepariniserad tikarcillin lösning för kateter spolning - Lös 0,33 g ticarcillin (dinatriumsalt) och 0,003 g heparin i 10 ml steril saltlösning. 0,03 ml lösning spolas thrgrundlig katetern dagligen. Den antibiotiska lösningen administreras för att förhindra blodproppar och infektioner från att utvecklas.
   2. Amikicin (antibiotika) för subkutan injektion - En subkutan injektion ges efter operation vid en dos på 10 mg / kg för att förhindra postoperativa infektioner.
   3. Ketoprofen (smärtstillande) för subkutan injektion - En subkutan injektion ges efter operation vid en dos av 5 mg / kg för att hantera alla postoperativ smärta.

4. Kateter implantationskirurgi

Nödvändig utrustning och reagenser: Isofluran, steril saltlösning, alkohol (70%), 1 och 3 sprutor cc fylld med steril koksaltlösning, 1-cc anpassade sprutor, antibiotika och smärtstillande lösningar beredda i avsnitt 3 ovan, mus katetrar (CamCaths, Cambridgeshire, Storbritannien ), kateter täcker (kristall lock från HRS Vetenskapliga, Montreal, Quebec), öga smörjmedel, 4 cm plast bar att höja ven (dettakan konstrueras av en plast Q-tip), Polysporin, sterila kompresser och gasväv, krökta och raka pincett, klämmor artär, fina saxar.

1. Med sedvanlig aseptisk teknik den kirurgiska bänken, de kirurgiska instrumenten och katetrarna steriliseras före operation. Korrekt steriliseringstekniker innefattar ångautoklavering för kirurgiska instrument och katetrar köpta från CamCaths. Glaspärla sterilisering kan också användas på tips av kirurgiska instrument. Etylenoxidsterilisering kan användas på mer ömtåliga katetrar eller material som riskerar att smälta. En mer detaljerad beskrivning av gnagare kirurgiska aseptiska tekniker kan hittas i bifogade referenser ^1,2. Ställ in i bänken, är instrument och noskon för underhåll anestesi illustreras i bilden.
2. Möss är sövda med isofluran gas och hölls under anestesi med en andning rör under ett spolningssystem. Öga smörjmedel (Tears Naturale PM) anbringas på båda ögonen för att hindra dem från att torka ut under förfarandet. En lämplig kirurgisk marginal rakat på djurets rygg och runt halsen. Innan några snitt görs, är de kirurgiska områden begränsade med sterila dukar.
3. För att förbereda katetern för införing i det högra förmaket av hjärtat, överskottet kateterröret avskuren 1,2 cm från lampan av katetern. Detta är den optimala längden fastställts för vuxna CD-1-möss, ungefär 8 veckors ålder, 20-25 gram kroppsvikt. Längden av kateterrör kan behöva justeras något (genom trial and error), baserat på stammen, storlek och ålder hos mössen. Före insättning, är sprutan innehållande steril saltlösning (avsnitt 3,2) fäst vid kateterkanylen, och katetern spolas och kontrolleras med avseende på läckor. Hålldenna spruta fäst till katetern under det kirurgiska förfarandet. Den kommer att användas för att spola katetern och dra tillbaka blod i steg 4,7.
4. Efter sterilisering med 70% alkohol, är en 2 cm lång midscapular snitt start halvvägs på ryggen och slutar strax under halsen för att inrymma basen av katetern. Bindväv ska tvingas isär med pincett för att ge plats för katetern bas under huden.
5. Placering av djuret på ryggen, en andra grund 1 till 2 cm diagonalt snitt görs från höger nyckelbenet går uppåt till djur käken, efter att området har varit tvättas med 70% alkohol. Halsvenen kommer att hittas ytligt under huden i nacken. Som förberedelse för införande av katetern, är slangen från basen av katetern dras genom snittet på ryggen och bringas nära den halsvenen genom att föra slangen under huden precis över den högra axeln. Den ände av kateterrör ärdärefter vid en artär klämma och placerad vid djurets sida för att hålla den på plats.
6. Den högra halsvenen ligger vid försiktigt flytta bort ytliga bindväv och fettvävnad från snittet runt djurets hals. Bindväv runt venen bryts sönder med böjda pincett och venen sedan höjs med en steril plast bar. Lösa öppna sutur knutar görs runt varje ände av venen och kateterröret träs genom den övre knut och slinga över suturen tråden att vila lossas över den högra axeln.
7. Före insättning, våt både 20 gauge införingsnålen och ven med steril saltlösning för att minska friktionen. Nålen hålls parallellt med venen, och insatt försiktigt nära botten av den förhöjda ven (Notera: ca 0,5 cm av nålspetsen måste ange venen). Använd pincett, skjut kateterröret ner skaftet på nålen i venen. Motstånd tyder på att slangen is inom bindväv och inte i venen. Tryck 0,03 cc saltlösning genom venen för att säkerställa att det inte finns några läckor. Läckor skulle indikera att venen kan genomborras eller att kateterröret placeringen behöver justeras.
   OBS: För att kontrollera om slangen är inom venen, försöka utarbeta lite blod med bifogad koksaltlösning sprutan. Om blodet inte omedelbart kan upprättas, får venen eller hjärtväggen att täppa kateterspetsen eller venen inte har genomborrat, justera slangen och försök igen. Nål återinförande kan vara nödvändig om blod fortfarande inte kan upprättas.
   
8. För att säkerställa katetern på plats, tryck katetern glödlampa till insättningspunkten och ta bort nålen. Knyt den nedre knut och dra katetern an mot baren innan knyta den andra knut precis ovanför lampan. Testa igen för att se om blod kan dras upp och lossa knutar något om det behövs. Stoppa kateterröret under huden och suturenventrala snitt runt djurets hals. Applicera Polysporin läka snabbt med användning av en steril applikator bomull spets, eller någon annan antibiotisk salva företrädesvis innehållande en del analgetikum till den slutna snittet.
9. Med djuret på dess buk, placera katetern basen under huden på ryggen inom den förberedda snitt. Se till att överskottet slangen minimalt loopas och väl dold under katetern basen för att minimera risken för att djuret tuggar och piercing det. Sutur snittet på båda sidor av katetern basen, och tillämpa Polysporin läka snabbt med användning av en steril applikator bomull spets.
10. Spola katetern med 0,03 cm av hepariniserad ticarcillin lösningen med sprutan med slangen förses med (avsnitt 3,2). Cap kanylen med kanylen locket och skruva på den vita katetern lock. I vissa möss som är färskt från kirurgi, kan blod läcka ut ur katetern innan kanylen är täckt. Det är viktigt att åter spola djuret och rapidly ersätta kanylen locket innan blod har möjlighet att rinna ut. Djur skall spolas dagligen för att upprätthålla kateter öppenhet.
11. Efter avtorkning ned injektionsstället mellan djuren bakbenen med 70% etanol, subkutant injicera den analgetiska ketoprofen i en dos av 5 mg / kg på den ena sidan, och den antibiotiska amikicin vid en dos av 10 mg / kg på den andra sidan.
12. Efter anestesi avbryts djuren får återhämta sig i en ren bur med enkel tillgång till mat och vatten i 5 till 7 dagar. Möss bör placeras i en uppvärmd skåp över natten för att förhindra postoperativ hypotermi.

5. Beteende tester - Intravenös Self-Administration

1. Före testning beteendemässiga katetrar spolas med 0,9% steril saltlösning. Möss Placera sedand i operanta kamrarna och ansluten till infusionsledningar och infusionspumpar. Aktiva hävarmspressar resultera i en 3,2 sek 18 pl läkemedelsinfusion kombination med belysning av en stimulans ljus. Varje hävarm pressen följs av en 8 sek timeout period under vilken stimulans lysa.
2. Efter operant sessionen är möss katetrar spolas med hepariniserad ticarcillin lösningen innan den återförs till sina hem bur.
3. Möss får själv administrera för 3 i rad 2-hr sessioner vid varje dos. Doser presenterades i slumpvis ordning för varje mus, såsom visas i följande avsnitt.
4. Kateter öppenhet bedöms dagligen genom att säkerställa att både saltlösning och antibiotika lösning kan spolas genom katetern. Dessutom, kan en ketamin / midazolam test utfördes såsom beskrivits i bifogade referens ^5. I korthet, tecken på anestesi, såsom orörlighet inom 5 sekunder av en infusion av 0,02-0,03 ml ketamin (15 mg / ml),eller midazolam (0,75 mg / ml) midazolam är ett bevis på ett patent kateter ^5.

Representative Results

Figur 1. Mönstret att svara för intravenös narkotika självadministrering varierar beroende på läkemedel, doser och anställd musstam. Figuren presenteras visar kokain självadministrering data efter lyckade catherization operationer enligt förfarandet i videon. Figuren visar medelvärdet (± SEM) kokain infusioner intjänade och medelvärden (± SEM) kokain konsumtion (mg / kg kroppsvikt) i en rad 4 kokain doser presenteras i en slumpmässig ordning på en FR1 schema för förstärkning. Abskissa: dos av själv-administrerat läkemedel per infusion. Vänster Ordinata: totalt antal infusioner intjänade under 2-hr operant session. Höger Ordinata: total kokain intag i mg / kg under 2-HR test session. Alla 13 katetrar förblev patent för den tid studien (4 veckor). En envägs ANOVA utfördes på dos visade att mikrofonE var administrering av kokain på ett dos-beroende sätt [F (1,12) = 42,8, p <0,05]. Det är en ökning med kokain konsumtionen över dosresponskurvan [F (3,36) = 29,6, p <0,05], trots en minskning i spak pressning vid de högre doserna. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 tester sessioner varje kokain dos (± SEM) samlas i CD-1-möss (n = 13 / dos, män och tillsammans honor). Jämförelser av aktiv (läkemedel-förstärkt) kontra inaktiv spak svarar över dosresponskurvan gjordes med användning av två-vägs ANOVA för att säkerställa att mössen var diskriminera mellan de två hävarmarna. För CD1, avslöjade analysen en preferens för den aktiva spaken [F (1,12) = 10,255, p <0,05] över hela dos-responskurvan (data ej visade här).

Discussion

Djurmodeller för drogmissbruk är särskilt användbara för att förstå den genetiska grunden för narkotikarelaterade beteenden. Till exempel möss med olika genetiska profiler visar ärftliga skillnader i deras känslighet för kokain ^6-8 och hjälpa till att identifiera potentiella gen kandidater förmedla fenotypiska variabiliteten ^9. De intravenösa kateteriseringsprocedurer beskrivs i detta dokument har använts med stor framgång för att undersöka läkemedel IVSA i olika stammar av möss samt möss med olika genetiska bakgrunder ^10.

De förfaranden som visas i den här videon belysa viktiga faktorer att fokusera på under och efter catherization kirurgi för att få tillförlitliga intravenösa självadministrering data. Först, är placeringen av kateterröret inom höger förmak viktigt, i syfte att förhindra kateterns fel från blot blodproppar. Under kirurgi är det viktigt att se till att kateternände obehindrat, och inte tilltäppt av antingen hjärtat eller ven vävnad. Andra är daglig kateter spolning krävs både före och efter operanta sessioner för att förhindra blockeringar. Slutligen måste kateterkanylen täckas ständigt med både kanylen lock och kristall täcker då djuren befinner sig i deras hem burar, för att förhindra införsel av skräp. Mindre blockering av kateterkanylen kan lossna med en fin 26 gauge nål, men dagligen spolning med hepariniserad antibiotikalösning krävs, särskilt på dagar då djuren inte testas för IVSA.

Att operera djur överlevnad, goda kunskaper i aseptisk teknik, är analgesi och anestesi behövs. Även denna video inte ersätter riktig kirurgisk träning, kan den användas som vägledning för forskare som vill skaffa de tekniker som behövs för detta paradigm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01