从三维混合细胞球体共培养物中分离乳腺上皮细胞

摘要

本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。

摘要

尽管研究人员已投入大量努力来鉴定参与正常和恶性细胞行为的信号通路及分子^1-2，但这些研究大多基于传统的二维细胞培养模型，因其便于对细胞进行操作。目前人们已认识到，细胞内信号通路会受到细胞外力的影响，包括环境的维度以及细胞表面张力^3-4。为了更准确地模拟生物组织的结构，研究人员已采用多种方法建立三维模型³。尽管这些模型能够体现多维性及结构应力，但由于模型本身的局限性以及难以从中分离细胞以进行后续分析，对细胞所受相应影响的研究仍不如二维组织培养那样便捷。

肿瘤周围微环境在肿瘤发生及肿瘤行为中的重要作用正日益受到重视⁴。肿瘤间质由多种细胞类型和细胞外分子组成。在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞与间质细胞之间存在双向信号交流⁵。尽管已鉴定出部分参与肿瘤-间质共进化的因子，但仍需建立简便的技术以系统性地识别和研究这些信号的完整谱系⁶。成纤维细胞是正常或肿瘤相关间质组织中最丰富的细胞类型，参与基底膜的沉积与维持以及旁分泌生长因子的分泌⁷。

许多研究团队已采用三维培养系统来研究成纤维细胞在多种细胞功能中的作用，包括肿瘤对治疗的反应、免疫细胞的募集、信号分子、增殖、凋亡、血管生成以及侵袭能力^8-15。我们优化了一种简便的方法，利用市售的细胞外基质模型建立混合细胞群体（共培养）的三维培养体系，以评估乳腺成纤维细胞对乳腺上皮细胞的影响^16-22。在持续共培养过程中，细胞会形成球状体，其中成纤维细胞聚集于内部，而上皮细胞主要位于球状体外部，并向基质中延伸出多细胞突起。通过观察上皮细胞突起的数量和长度变化，可便捷地量化成纤维细胞调控后对上皮细胞侵袭能力的影响²³。此外，我们还建立了一种从三维共培养体系中分离上皮细胞的方法，便于分析成纤维细胞暴露对上皮细胞行为的影响。我们发现，共培养所产生的效应在上皮细胞分离后可持续数周，为开展多种检测提供了充足的时间。该方法适用于不同恶性潜能的细胞，且无需特殊设备。本技术可在多种条件下快速评估体外细胞模型，相应结果还可与体内动物组织模型以及人类组织样本进行比较。

方案

1. 建立三维共培养体系

1. 在建立共培养体系的前一天，从冷冻箱中取出Matrigel，置于冰上，并在4 °C冰箱中过夜融化。
2. 实验当天，准备共培养用的培养基，该培养基与所用上皮细胞的培养基相同（本示例中为HMEC培养基：DME/F12培养基，含10%小牛血清、5 μg/mL胰岛素、1 μg/mL氢化可的松和1 ng/mL EGF）。在与Matrigel混合前，至少将培养基置于冰上1小时。
3. 为稀释已融化的Matrigel，确定所需Matrigel:培养基的总体积（24孔板每孔300 μL），取该体积的一半量的冰上预冷的HMEC培养基加入无菌离心管中，再加入等体积的已融化Matrigel，得到1:1的稀释液。将离心管保持在冰上。
4. 在24孔板的指定孔中加入50 μL Matrigel:培养基混合液，置于37 °C、含加湿空气和5% CO₂的培养箱中孵育10分钟。
5. 向各孔中再加入450 μL Matrigel:培养基混合液，并继续孵育60分钟。
6. 在孵育期间，将成纤维细胞（此处为表达GFP的h-TERT永生化还原性乳腺成纤维细胞）与上皮细胞（此处为表达RFP的h-TERT永生化人乳腺上皮细胞系）以每0.5 mL HMEC培养基中各含0.5 × 10⁵个细胞的浓度配制成1:1的细胞悬液。
7. 60分钟孵育结束后，将细胞悬液轻轻滴加至已凝固的凝胶表面，并将培养板放回培养箱。
8. 培养期间前2天内不要扰动培养物。此后，可每2–3天轻柔地从孔壁侧边吸除旧培养基，并轻柔地更换新鲜HMEC培养基。
9. 每日在显微镜下观察球状体形成情况。通常培养10–14天后结构趋于成熟。可根据需要使用明场或荧光显微镜成像。球状体大小和突起长度可在明场显微镜下测量。

2. 类球体共培养物中细胞的分离

1. 使用无菌的 2 mL 玻璃移液管，非常轻柔地将培养物上下吹打 10 次。或者，使用经高压灭菌或 70% 乙醇浸泡消毒的剪刀剪去 1000 微升塑料移液枪头的尖端，以用于吹打培养物。将培养物用玻璃移液管或剪过的塑料枪头转移至无菌的 15 ml 离心管中，在室温下以 2000 rpm 离心 5 分钟。细胞球将沉淀至管底。
2. 使用无菌巴斯德移液管尖端，轻柔地去除离心管顶部被破坏的 Matrigel。
3. 向沉淀的细胞球中加入 1 ml HMEC 培养基，使用无菌的 2 mL 玻璃移液管上下吹打 2–3 次，并将培养物转移至 24 孔组织培养板中的一个孔内。
4. 让细胞球贴壁至少 48 小时后再更换培养基。随着时间推移，细胞将从球状结构中迁移出来，以单层形式生长。
5. 当细胞达到 50% 汇合度时进行传代。首先将培养物扩增至 35 mm 培养皿（约 2–4 天），然后扩增至 100 mm 培养皿（约 3–5 天）。每次传代前，立即使用无菌巴斯德移液管手动尽可能多地去除残留的“空壳样细胞球”（ghost spheroids）。
6. 使用适当的细胞表面标志物通过流式细胞术分析细胞群体纯度，如有需要，可进一步通过荧光细胞分选分离不同的细胞亚群。分离得到的细胞现已可用于后续所需的分析。

3. 典型结果

在三维球体共培养体系中，经基因工程改造而沉默Tiam1的成纤维细胞可诱导乳腺上皮细胞向基质内侵袭增加（图1，比较D、E、F与A、B、C）。而经基因工程改造过表达Tiam1的成纤维细胞则可诱导乳腺癌细胞系SUM159的基质侵袭减少（图1，比较J、K、L与G、H、I）。

一旦建立共培养类球体，可通过在二维条件下重新接种培养，从类球体中分离出细胞群体，如图2所示。根据所测试细胞的相对增殖速率，可通过连续传代（如图3所示）获得纯细胞群体，或利用特异性细胞标志物进行分选。从三维共培养体系中分离后，上皮细胞仍可长期保留与成纤维细胞共培养所获得的特性，从而为后续分析提供了充足的机会。在本示例中，暴露于Tiam1缺陷型成纤维细胞的共培养HMEC在从三维共培养分离后数周内仍表现出迁移能力增强（图4）。

图 1. 类球体共培养物在明场与荧光显微镜下的成像结果。类球体共培养体系由乳腺上皮细胞与成纤维细胞系构建，并在体外培养中生长10-14天。A-F：上皮细胞 = HMEC-mCherry细胞；G-L：上皮细胞 = SUM159-mCherry细胞。A-C, G-I：成纤维细胞 = 对照RMF-GFP细胞。D-F：成纤维细胞 = RMF-GFP细胞经Tiam1基因沉默处理。J-L：成纤维细胞 = RMF-GFP细胞过表达Tiam1。箭头指示上皮细胞突起侵入基质的区域。

图2. 从Matrigel培养中分离后，在明场和荧光显微镜下对培养物进行连续成像。第0天表示分离后立即成像；第1、2和5天表示分离后的天数。离开类球体的细胞冠随时间逐渐增加。最终仅剩一个细胞极少的“ghost”类球体（箭头所示）。在去除ghost类球体并进行首次传代后，仅存极少数类球体。

图 3. 从 Matrigel 共培养物中分离细胞后的流式细胞术分析。在球形体共培养物成熟后，通过移液和连续传代将细胞从三维共培养体系中分离。取样后，采用流式细胞术分析等分试样（本示例中使用绿色荧光和红色荧光分别鉴定表达 GFP 的成纤维细胞和表达 mCherry 的上皮细胞），以确定上皮细胞与成纤维细胞的相对群体比例。

图 4. HMEC 在从 Matrigel 共培养中分离后仍持续表现出 Transwell 迁移能力。在通过培养或荧光细胞分选获得纯细胞群体后，可按需对细胞进行分析。此处评估了 HMEC 与对照（C）或 Tiam1 缺陷型（shT）成纤维细胞共培养后，在分离培养 2、4 和 8 周时穿过多孔 Transwell 膜的迁移能力。

讨论

本文介绍的方法为分析基质成纤维细胞对上皮细胞（包括肿瘤细胞）的影响提供了一种简便的途径。该方法可在由细胞外基底膜基质支撑的三维环境中实现细胞间的直接相互作用，同时便于从基质中轻松分离细胞以进行后续分析。该方法可用于肿瘤相关基质的研究，因为成纤维细胞系可被改造以调控特定的信号通路，而上皮细胞系则可具有不同的侵袭潜能，如图1所示。三维共培养模型可直观验证细胞侵袭性的变化是否已被诱导。该分离方案可在最少操作步骤下从三维培养物中提取细胞，并避免使用可能影响细胞特性的胰蛋白酶或基质溶解试剂。上皮细胞在从三维共培养体系中分离后，仍持续保留其在三维共培养中受到成纤维细胞影响所产生的效应，从而有利于后续分析（图4）。尽管本文示例展示了对细胞迁移的影响，但所有适用于二维培养细胞的检测方法均可用于这些分离后的细胞。我们已利用该方法分析了成纤维细胞中Tiam1表达水平变化对相关乳腺上皮细胞行为的影响。成纤维细胞中Tiam1的缺失可促进乳腺肿瘤细胞在三维培养及动物肿瘤模型中的侵袭和转移²³。本方法使我们能够通过分子、生化及功能检测手段分析潜在的参与通路（Liu 和 Buc...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	无酚红
Hyclone 经典液体培养基：DMEM F12	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30023.01
Hyclone 小牛血清	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3007303
胰岛素	EMD Millipore	407709	溶于 0.005N HCl；0.22 μM 滤膜过滤
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H4001	溶于 50% 乙醇；0.22 μM 滤膜过滤
表皮生长因子（EGF）	Sigma-Aldrich	E9644	溶于 10 mM 乙酸；0.22 μM 滤膜过滤