Summary
Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.
Abstract
Mientras que los enormes esfuerzos han ido a la identificación de vías de señalización y las moléculas que intervienen en los comportamientos de células normales y malignas 1-2, gran parte de este trabajo se ha hecho con clásicos bidimensionales modelos de cultivo celular, que permiten la manipulación de células fácil. Ha quedado claro que las vías de señalización intracelulares se ven afectados por las fuerzas extracelulares, incluyendo la dimensionalidad y la tensión de la superficie celular 3-4. Múltiples enfoques se han tomado para desarrollar modelos en tres dimensiones que representan con mayor precisión la arquitectura biológica del tejido 3. Si bien estos modelos incorporan la multidimensionalidad y las tensiones arquitectónicas, el estudio de los consiguientes efectos sobre las células es menos fácil que en el cultivo de tejidos en dos dimensiones debido a las limitaciones de los modelos y la dificultad en la extracción de las células para su posterior análisis.
El importante papel del microambiente alrededor de los tumores en la tumorigénesis y el comportamiento del tumors cada vez más reconocido 4. Estroma del tumor se compone de múltiples tipos de células y moléculas extracelulares. Durante el desarrollo del tumor hay señales bidireccionales entre las células tumorales y las células del estroma 5. Aunque algunos de los factores que participan en el tumor de estroma-co-evolución han sido identificados, todavía hay una necesidad de desarrollar técnicas sencillas para identificar de forma sistemática y estudiar toda la gama de estos 6 señales. Los fibroblastos son el tipo de célula más abundante en los tejidos normales o estroma del tumor asociado, y contribuir a la deposición y el mantenimiento de la membrana basal y factores de crecimiento paracrinos 7.
Muchos grupos han utilizado tres sistemas de cultivo de dimensiones para estudiar el papel de los fibroblastos en varias funciones celulares, incluyendo la respuesta del tumor a los tratamientos, el reclutamiento de células inmunes, las moléculas de señalización, proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la invasión de 8-15. Hemos optimizado un método sencillo para el culoessing los efectos de los fibroblastos mamarias en células epiteliales mamarias utilizando un modelo de matriz extracelular comercialmente disponible para crear tridimensionales cultivos de las poblaciones de células mixtas (co-cultivos) 16-22. Con continua co-cultivo de las células formar esferoides con la agrupación fibroblastos en el interior y las células epiteliales en gran medida en el exterior de los esferoides y formando multicelulares proyecciones en la matriz. La manipulación de los fibroblastos que conduce a la invasividad de las células epiteliales alterados pueden ser fácilmente cuantificados por cambios en el número y la longitud de las proyecciones epiteliales 23. Además, hemos ideado un método para aislar células epiteliales de tres dimensiones de co-cultivo que facilita el análisis de los efectos de la exposición de fibroblastos en el comportamiento epitelial. Hemos encontrado que los efectos de co-cultivo persistir durante semanas después del aislamiento de células epiteliales, permitiendo tiempo suficiente para realizar ensayos múltiples. Este método es adaptable a las células devariable potencial maligno y no requiere equipo especializado. Esta técnica permite la evaluación rápida de los modelos de células in vitro bajo condiciones múltiples, y los resultados correspondientes se pueden comparar con los modelos in vivo de tejidos animales, así como muestras de tejidos humanos.
Protocol
1. El establecimiento de tres dimensiones Co-culturas
- El día antes de establecer la co-culturas, retire el Matrigel del congelador y descongele el hielo en un refrigerador de 4 ° C durante la noche.
- En el día del experimento, preparar el medio para el co-cultivo, que corresponde al medio para las células epiteliales que se utilizarán (medio HMEC en este ejemplo: DME/F12 medio con 10% de suero bovino ternero, 5 ug / ml de insulina , 1 mg / ml de hidrocortisona, y 1 ng / ml de EGF). Mantener el medio en hielo al menos 1 hora antes de mezclar con Matrigel.
- Para diluir el Matrigel descongelado, determinar la cantidad total deseada de Matrigel: medio (300 ml por pocillo de placas de 24 pocillos) y agregue la mitad que el volumen de helado a medio HMEC a un tubo estéril sobre hielo. Luego se agrega el mismo medio-volumen total de Matrigel descongelado al tubo para lograr una dilución 1:1. Mantenga el tubo en hielo.
- Colocar 50 l de Matrigel: mezcla medio mediados de bien en pozos designados de una placa de 24 pocillos yincubar durante 10 min en una incubadora a 37 ° C con aire humidificado y 5% de CO 2.
- Añadir un adicional de 450 l de Matrigel: mezcla de medio a los pocillos y se incuba durante otros 60 minutos.
- Durante la incubación, preparar una suspensión 1:1 de los fibroblastos (aquí h-TER-inmortalizadas fibroblastos reducción mamaria expresan GFP) y células epiteliales (aquí h-TER-inmortalizada humano línea de células epiteliales mamarias expresar SDP) a una concentración de 0,5 x 10 5 células cada una en 0,5 ml de medio HMEC.
- Después de la etapa de incubación de 60 minutos, suavemente caer la suspensión celular en la parte superior del gel solidificado, y devolver la cultura a la incubadora.
- No moleste a los cultivos durante 2 días. Después de esto, medio puede ser cambiado cada 2-3 días por medio de aspiración muy suavemente desde el lado del pozo y suavemente reemplazar con medio fresco HMEC.
- Supervisar la formación esferoide día bajo el microscopio. Las culturas son generalmente madura después de 10-14 días. La imagen comoapropiado usando la luz o microscopía de fluorescencia. El tamaño y la longitud del esferoide de proyección se puede medir con microscopía de luz.
2. Aislamiento de células de Esferoide Co-culturas
- Muy suavemente, pipetear la cultura y 10x hacia abajo con una solución estéril de 2 ml pipeta de vidrio. Por otra parte, cortar la punta de una punta de pipeta de plástico de 1000 microlitros con unas tijeras esterilizadas en autoclave o por inmersión en etanol al 70% con el fin de la pipeta de la cultura. Transferir el cultivo, ya sea con la pipeta de vidrio o la punta de corte a una pipeta de plástico estéril 15 ml tubo de centrífuga y se centrifuga durante 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Los esferoides celulares se sedimento en el fondo.
- Utilizar una punta de pipeta Pasteur estéril para eliminar suavemente el Matrigel interrumpido desde la parte superior del tubo se centrifugó.
- Añadir 1 ml de medio HMEC a los esferoides granuladas, pipetear hacia arriba y abajo 2-3 veces con una pipeta estéril de 2 ml de vidrio, y transferir la cultura de un pozo en un 24 yplaca de cultivo de tejidos.
- Permita que los esferoides para insertarse en el plato por lo menos 48 horas antes de cambiar el medio. Con el tiempo las células se dejan las estructuras esferoidales y crecer como monocapas.
- Pasaje de la célula culturas cuando las células alcanzan el 50% de confluencia. En primer lugar ampliar el cultivo a una placa de 35 mm (aproximadamente 2-4 días), y luego a una cápsula de 100 mm (aproximadamente 3-5 días). Inmediatamente antes de cada paso paso, utilizar una pipeta Pasteur estéril para eliminar manualmente como muchos "esferoides fantasma" residual como sea posible.
- Analice las células por citometría de flujo para la pureza de la población con adecuados marcadores celulares de superficie y otras poblaciones distintas de células diferentes de células de clasificación de fluorescencia, si es necesario. Las células aisladas son ahora listo para su posterior análisis como se desee.
3. Los resultados representativos
En tres dimensiones esferoide co-cultivos, los fibroblastos con ingeniería Tiam1 silenciamiento inducir la invasión aumentó en matrix por las células epiteliales mamarias (Figura 1, comparar D, E, F y A, B, C). Los fibroblastos con ingeniería sobre-expresión de Tiam1 inducir invasión disminuyó matriz por la línea celular de cáncer de mama SUM159 (Figura 1, comparar J, K, L a G, H, I).
Una vez que la co-cultivadas esferoides se han establecido, las poblaciones de células pueden ser aisladas de esferoides por re-chapado en un contexto de dos dimensiones, como se muestra en la Figura 2. Dependiendo de las tasas relativas de crecimiento de las células de la prueba, las poblaciones puras pueden surgir a través del paso de serie (como se muestra en la Figura 3) o se pueden clasificar utilizando marcadores apropiados de células. Después del aislamiento de 3D co-cultivo, las células epiteliales retener las propiedades conferidas por co-cultivo con fibroblastos durante períodos prolongados de tiempo, permitiendo una amplia oportunidad para el análisis. En este ejemplo, la exposición a Tiam1 deficientes en fibroblastos migración inducida por el aumento en la co-cultivadas HMECs que persistió durante semanas unaD espués de aislamiento de 3D co-cultivo (Figura 4).
Figura 1. Imagen del esferoide estableció co-cultivos con microscopía de luz y fluorescencia. Culturas esferoides se establecen con líneas de células epiteliales mamarias y de los fibroblastos y se dejan crecer en cultivo durante 10-14 días. AF: epiteliales = HMEC-mCherry células. GL: las células epiteliales = SUM159-mCherry células. AC, GI: = fibroblastos de control RMF-GFP células. DF: fibroblastos = RMF-GFP con Tiam1 silenciamiento. JL: fibroblastos = RMF-GFP con Tiam1 sobre-expresión. Las flechas indican las proyecciones epiteliales invasoras en la matriz.
Figura 2. Serie de imágenes de las culturas con microscopía de luz y fluorescencia después del aislamiento de la cultura Matrigel. Día 0 representa imágenes inmediatamente después del aislamiento; días 1, 2 y5 indican días después del aislamiento. La corona de células que salen de los aumentos esferoidal en el tiempo. Finalmente, un "fantasma" esferoide con muy pocas células sigue siendo (flecha). Esferoides quedan muy pocos después de la eliminación de fantasmas y el primer paso.
Figura 3. Análisis de citometría de flujo de las células después del aislamiento de Matrigel co-cultivo. Después de esferoide co-cultivos han madurado, las células se aíslan de la 3D co-cultivo con pipetas y de serie de pases. Alícuotas de las muestras se analizaron por citometría de flujo (en este ejemplo, el uso de fluorescencia de fluorescencia verde y rojo para identificar las buenas prácticas agrarias que expresan los fibroblastos y mCherry que expresan las células epiteliales, respectivamente) para determinar la población relativa de las células epiteliales y fibroblastos.
Figura 4. La migración Transwell de HMECs persiste después de isolatien Matrigel de co-cultivo. Una vez que las poblaciones puras se han obtenido mediante el cultivo de células de clasificación o de fluorescencia, las células pueden ser analizados como se desee. Aquí la migración de HMECs co-cultivadas con cualquiera de los controles (C) o Tiam1 deficientes (SHT) a través de los fibroblastos transwells perforadas se evaluó en las semanas 2, 4 y 8 después del aislamiento de co-cultivo.
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Discussion
El método aquí presentado representa un método sencillo para analizar los efectos de los fibroblastos del estroma de las células epiteliales, incluyendo las células tumorales. Permite directo célula-célula interacción dentro de un contexto tridimensional apoyada por la matriz extracelular de la membrana basal, al tiempo que permite una fácil extracción de las células de la matriz para su posterior análisis. Esto se puede aplicar al estudio de la estroma asociado al tumor, como fibroblastos de líneas puede ser manipulado para afectar las vías de señalización de elección y líneas epiteliales puede variar en el potencial invasivo, tal como se muestra en la Figura 1. El 3D co-cultivo modelo permite la verificación visual de que los cambios en la invasión de células han sido inducida. El protocolo de aislamiento permite la extracción de las células de los cultivos 3D con un mínimo de manipulación y evita el uso de tripsina o de matriz agentes disolventes que podrían afectar a las propiedades de células. Los efectos de la exposición a los fibroblastos en 3D co-cultivo de persistir en las células epiteliales de popaer aislamiento de 3D co-cultivo, lo que facilita su posterior análisis (Figura 4). Aunque el ejemplo mostrado aquí representa los efectos sobre la migración celular, cualquier ensayo aplicable a las células que crecen en 2D se puede utilizar en las células aisladas. Hemos utilizado este método para analizar los efectos de la variación de fibroblastos Tiam1 expresión en el comportamiento de los asociados células epiteliales mamarias. Tiam1 deficiencia en los fibroblastos promueve la invasión de células tumorales de mama y metástasis en la cultura en 3D y modelos animales de tumores 23. Este método nos ha permitido analizar las posibles vías involucradas utilizando técnicas moleculares, bioquímicas y funcionales (Liu y Buchsbaum, en prensa).
Es importante utilizar sólo las líneas celulares con excelente salud y adherirse a una técnica estéril riguroso con el fin de evitar la contaminación de los cultivos durante el proceso. Los mejores resultados se obtienen utilizando las células de principios más que pasajes finales (paso número exacto variará dependiendo de la específiic células de líneas celulares) y de cosecha en densidades entre 50-80% de confluencia. Manipulación precisa de Matrigel acuerdo con el protocolo es clave para facilitar tanto licuación completa antes de establecer los co-cultivos y para asegurar la solidificación completa de la matriz antes de la adición de las células. Cantidad inadecuada o la solidificación de la matriz se traducirá en células que crecen como una monocapa en lugar de en esferoides en los cultivos. La primera vez que se establece el esferoide de co-cultivos, la colocación de un tapón de inicial de 50 l en el pozo permite la solidificación sólido anclaje y más uniforme de la matriz final, que es clave para la formación distribuida uniformemente esferoide. La eliminación de todos los esferoides fantasma en las distintas fases de paso de aislamiento posterior es crítico si la clasificación de células automatizado se va a utilizar para separar poblaciones mixtas. Los ejemplos mostrados aquí usan fenol-rojo Matrigel libre con la composición de proteína de aproximadamente 10 mg / ml. La preparación libre de rojo fenol permite la detección de color en Assays, tales como fluorescencia.
Esta técnica se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células con el fin de estudiar los efectos de los fibroblastos estromales sobre asociados tumores de células epiteliales o la inversa de los efectos de las células tumorales en los fibroblastos asociados. Esta técnica permite la evaluación rápida de los modelos de células in vitro bajo condiciones múltiples, y los resultados correspondientes a continuación, se puede comparar con modelos in vivo de tejidos animales, así como muestras de tejidos humanos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
