Summary
En enkel metod beskrivs för att analysera effekterna av vävnads-fibroblaster på tillhörande epitelceller. Kombinationen av detta förfarande och tredimensionella vävnadskultur kan underlätta analys av celler efter isolering av 3D. Tekniken är tillämpbar på celler av varierande malign potential, så att systematisk studie av effekterna av tumörassocierad stroma på tumörcellerna.
Abstract
Medan stora ansträngningar har gjorts för att identifiera signalvägar och molekyler är involverade i normala och maligna celler beteenden 1-2, mycket av detta arbete har gjorts med hjälp av klassiska två-dimensionella modeller cellodling, som möjliggör enkel cell manipulation. Det har blivit uppenbart att intracellulära signalsystem påverkas av extracellulära krafter, inklusive dimensionalitet och cell ytspänning 3-4. Flera metoder har tagits för att utveckla tredimensionella modeller som mer exakt representerar arkitektur biologisk vävnad 3. Även om dessa modeller har flerdimensionalitet och arkitektoniska påfrestningar, är studiet av de därav följande effekter på celler mindre lättvindigt än tvådimensionella vävnadskultur på grund av begränsningar av modeller och svårigheten att utvinna celler för efterföljande analys.
Den viktiga roll mikroomgivningen omkring tumörer i tumörbildning och tumör beteende is alltmer erkänns 4. Tumörstroma består av flera celltyper och extracellulära molekyler. Under tumörutveckling finns dubbelriktade signaler mellan tumörceller och stromaceller 5. Även om vissa faktorer som deltar i tumör-stroma co-evolution har identifierats, finns det fortfarande ett behov av att utveckla enkla tekniker för att systematiskt identifiera och studera full uppsättning av dessa signaler 6. Fibroblaster är den vanligaste celltypen i normala eller tumör-associerad stromala vävnader, och bidra till deponering och underhåll basalmembranet och parakrina tillväxtfaktorer 7.
Många grupper har använt tredimensionella kultur-system för att studera betydelsen av fibroblaster på olika cellulära funktioner, inklusive tumör svar på terapier, rekrytering av immunceller, signalmolekyler, spridning, apoptos, angiogenes och invasion 8-15. Vi har optimerat en enkel metod för assEssing effekterna av mammära fibroblaster på bröstepitelialceller med användning av en kommersiellt tillgänglig extracellulär matris modell skapa tre-dimensionella odlingar av blandade cellpopulationer (samkulturer) 16-22. Med fortsatt samodling av cellerna bilda sfäroider med fibroblaster klustring i det inre och de epiteliala cellerna i hög grad på det yttre av de sfäroider och bildar multi-cellulära utsprång in i matrisen. Manipulation av fibroblaster som leder till förändrad epitelceller invasivt kan lätt kvantifieras av förändringar i antal och längd epiteliala projektioner 23. Dessutom har vi utvecklat en metod för att isolera epitelceller av tre-dimensionella co-kultur som underlättar analysen av effekterna av fibroblast exponering på epitelial beteende. Vi har funnit att effekterna av samodling kvarstår under flera veckor efter epitelcell isolering, vilket medger tillräcklig tid för att utföra flera analyser. Denna metod kan anpassas till celler avvarierande malign potential och kräver ingen specialutrustning. Denna teknik medger snabb utvärdering av in vitro-cell-modeller under flera villkor, och de motsvarande resultaten kan jämföras med in vivo-djurmodeller vävnader såväl som humana vävnadsprover.
Protocol
1. Upprätta Tredimensionella Samkulturer
- Dagen före fastställande av samodlingar, avlägsna Matrigel från frysen och upptining på is i en 4 ° C kylskåp över natten.
- På dagen för experimentet, framställa ett medium för samodling, som motsvarar mediet för de epiteliala cellerna som skall användas (HMEC medium i detta exempel: DME/F12-medium med 10% bovint kalvserum, 5 | ig / ml insulin , 1 ^ g / ml hydrokortison och 1 ng / ml EGF). Hålla mediet på is under minst 1 timme före blandning med Matrigel.
- Att späda den tinade Matrigel, bestämma den totala önskade mängden av Matrigel: medel (300 | il per brunn för 24-brunnsplattor) och tillsätt halv att volymen av iskall HMEC-medium till ett sterilt rör på is. Tillsätt sedan samma halv-total volym av upptinad Matrigel till röret för att åstadkomma en 1:1 utspädning. Hålla röret på is.
- Ställe 50 | il av Matrigel: mediumblandningen mitten väl i utsedda brunnar i en 24-brunnsplatta ochinkubera under 10 min i en 37 ° C inkubator med fuktad luft och 5% CO2.
- Tillsätt en ytterligare 450 | il av Matrigel: medel blandningen till brunnarna och inkubera under ytterligare 60 minuter.
- Under inkubationen framställa en 1:1 suspension av fibroblaster (här h-TERT-immortaliserade Reduction Mammary Fibroblaster som uttrycker GFP) och epitelceller (här h-TERT-immortaliserad human bröstepitelialceller cellinje som uttrycker RFP) vid en koncentration av 0,5 x 10 5 celler vardera i 0,5 ml av HMEC-medium.
- Efter 60 minuters inkubering steg försiktigt släppa cellsuspensionen på toppen av den stelnade gelén, och återgå kulturen till inkubatorn.
- Stör inte kulturerna under 2 dagar. Därefter kan mediet bytas var 2-3 dagar genom att mycket försiktigt suga medium från sidan av brunnen och försiktigt ersätta med nytt HMEC medium.
- Övervaka sfäroid formation dagligen under mikroskop. Kulturer är i allmänhet mogna efter 10-14 dagar. Bilden somlämpligt att använda ljus eller fluorescerande mikroskopi. Sfäroid storlek och utsprånget längd kan mätas under ljusmikroskop.
2. Isolering av celler från sfäroid Samkulturer
- Mycket försiktigt pipettera kulturen upp och ner 10x med en steril 2-ml glaspipett. Alternativt skära av toppen av en 1000 mikroliter plastpipett tips med sax steriliseras genom autoklavering eller nedsänkning i 70% etanol för att pipettera odlingen. Överföra kulturen med antingen glaspipett eller den skurna plast pipettspetsen till en steril 15 ml centrifugrör och centrifugera under 5 min vid 2000 rpm vid rumstemperatur. De cellulära sfäroider sedimenterar vid botten.
- Använd en steril Pasteur pipettspets att försiktigt ta bort störde Matrigel från toppen av den centrifugerade röret.
- Tillsätt 1 ml HMEC-medium till de pelleterade sfäroider, pipettera upp och ner 2-3 gånger med en steril 2 ml glaspipett, och överföra den kultur till en brunn i en 24-brunnarsvävnadsodlingsplatta.
- Låt sfäroiderna att fästa skålen på minst 48 timmar före ändra mediet. Med tiden cellerna kommer att lämna de sfäriska strukturer och växa som monoskikt.
- Passage av cellkulturer när cellerna når 50% konfluens. Första expandera kulturen till en 35 mm skål (ungefär 2-4 dagar), och sedan till en 100 mm skål (ungefär 3-5 dagar). Omedelbart före varje passage steg använda ett sterilt pasteurpipett att manuellt ta bort så många återstående "Ghost sfäroiderna" som möjligt.
- Analysera celler genom flödescytometri för populationen renhet med användning av lämpliga markörer på cellytan och ytterligare separera olika cellpopulationer genom fluorescens cellsortering om nödvändigt. De isolerade cellerna är nu redo för ytterligare analys om så önskas.
3. Representativa resultat
I tredimensionell sfäroid samkulturer, fibroblaster med konstruerade Tiam1 tystande inducera ökad invasion in matrix genom bröstepitelialceller (figur 1, jämför D, E, F till A, B, C). Fibroblaster med konstruerade överuttryck av Tiam1 framkalla minskade matrix invasion av bröstcancer cellinje SUM159 (figur 1, jämför J, K, L till G, H, I).
Gång samodlade sfäroider har fastställts, kan cellpopulationer isoleras från sfäroider genom att åter plätering i ett tvådimensionellt samband, som visas i figur 2. Beroende på de relativa tillväxten av de testade cellerna, kan rena populationer ut genom seriepassage (såsom visas i figur 3) eller kan sorteras med användning av lämpliga cellmarkörer. Efter isolering från 3D co-kultur, epitelceller behåller de egenskaper som följer av samodling med fibroblaster under längre perioder, vilket stora möjligheter för analys. I detta exempel inducerade exponering för Tiam1-brist fibroblaster ökad migration i samarbete odlade HMECs som kvarstod i veckorfter isolering från 3D co-kultur (Figur 4).
Figur 1. Avbildning av etablerade sfäroid samkulturer enligt ljus och fluorescensmikroskopi. Sfäroid kulturer är etablerade med bröstepitelialceller och fibroblast-cellinjer och fick växa i odling under 10-14 dagar. AF: epiteliala = HMEC-mCherry celler. GL: epitelceller = SUM159-mCherry celler. AC, GI: fibroblast = kontroll RMF-GFP-celler. DF: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 ljuddämpning. JL: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 över-uttryck. Pilar indikerar epiteliala prognoser invaderande i matris.
Figur 2. Serial avbildning av kulturer under ljus och fluorescensmikroskopi efter isolering från Matrigel kultur. Dag 0 representerar avbildning omedelbart efter isolering, dag 1, 2 och5 indikerar dagar efter isolering. Koronan av celler som lämnar de sfäroida ökar med tiden. Så småningom en "ghost" sfäroid med mycket få celler är (pil). Mycket få sfäroider kvar efter spöket bort och första passagen.
Figur 3. Flödescytometrianalys av celler efter isolering från Matrigel samodling. Efter sfäroid samkulturer har mognat, celler isolerade från 3D co-kultur med pipettering och seriepassage. Provalikvoter analyserades med flödescytometri (i detta exempel med användning av grön fluorescens och röd fluorescens för att identifiera GFP-uttryckande fibroblaster och mCherry-epitelceller respektive) för att bestämma relativa populationerna av epiteliala och fibroblastceller.
Figur 4. Transwell migration av HMECs kvarstår efter isolatividare från Matrigel co-kultur. När rena populationer har erhållits genom kultur eller fluorescens cellsortering, kan celler analyseras som önskas. Här migrering av HMECs samodlades med antingen kontroll (C) eller Tiam1 deficienta (SHT) fibroblaster runt perforerad transwell bedömdes vid 2, 4 respektive 8 veckor efter isolering från samodling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här representerar en enkel metod för att analysera effekterna av stromala fibroblaster på epitelceller, inklusive tumörcellerna. Den möjliggör direkt cell-cell-interaktion inom en tredimensionell sammanhang stöds av extracellulär basalmembranet matris, samtidigt som lätt utvinning av celler från matrisen för ytterligare analys. Detta kan appliceras på studien av tumörassocierad stroma, såsom fibroblastlinjer kan manipuleras för att påverka signalvägar för val och epiteliala linjer kan variera i invasiv potential, såsom visas i figur 1. 3D samodlingsmodell tillåter visuell kontroll av att förändringar i cellernas invasiv har inducerats. Isolering protokoll möjliggör extraktion av celler från de 3D kulturerna med ett minimum av hantering och undviker användningen av trypsin eller matris upplösande medel som kan påverka cellegenskaper. Effekterna av exponering för fibroblast i 3D samodling kvar i epitelceller akterER isolerat från 3D co-kultur, underlätta efterföljande analys (Figur 4). Medan exemplet visar effekter på cellmigrering kan alla test som gäller för celler som växer i 2D kan användas på de isolerade cellerna. Vi har använt denna metod för att analysera effekterna av olika fibroblast Tiam1 uttryck på beteendet hos tillhörande bröst epitelceller. Tiam1 brist i fibroblaster främjar bröst tumörceller invasion och metastasering i 3D kultur och djurmodeller tumör 23. Denna metod har gjort det möjligt för oss att analysera potentiella inblandade vägar med molekylära, biokemiska och funktionella analyser (Liu och Buchsbaum, in press).
Det är viktigt att endast använda cellinjer i god hälsa och att vidhäfta till rigorös steril teknik i syfte att förhindra kontaminering av kulturer under processen. De bästa resultaten erhålles med användning av celler från början snarare än sena passager (exakt passagen antal kommer att variera beroende på den särskilic cellinje) och från celler skördas vid densiteter mellan 50-80% konfluens. Exakt hantering av Matrigel enligt protokollet är nyckeln för att underlätta både fullständig kondensering före upprättandet av co-kulturer och säkerställa fullständig stelning av matrisen före tillsats av cellerna. Otillräcklig mängd eller stelning av matrisen kommer att resultera i celler som växer som ett monoskikt i stället för sfäroiderna i kulturerna. När den först om upprättandet av sfäroiden samkulturer tillåter placering av en initial 50 ^ plugin i brunnen för fast förankring och mer enhetlig stelning av den slutliga matrisen, som är nyckeln till jämnt fördelad sfäroid formation. Avlägsnande av alla spök sfäroider vid efter isolering passage steg är kritiskt om automatiskt cellsortering skall användas för att separera blandade populationer. De exempel som visas här använda fenolrött fritt Matrigel med proteinkompositionen av ca 10 mg / ml. Fenol-röda utan förberedelser medger färgavkänning i ASSAys, såsom fluorescens.
Denna teknik kan appliceras på en mängd celltyper för att studera effekterna av stromala fibroblaster på tillhörande epitelcellsystem tumörer eller omvänt effekterna av tumörceller på förbundna fibroblaster. Denna teknik medger snabb utvärdering av in vitro-cell-modeller under flera villkor, och de motsvarande resultaten kan sedan jämföras med in vivo-djurmodeller vävnad såväl som humana vävnadsprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
