Summary
En simpel fremgangsmåde er beskrevet til at analysere virkningerne af væv-fibroblaster på tilknyttede epitelceller. Kombinationen af denne fremgangsmåde og tredimensionale vævskultur kan lette analyse af celler efter isolering fra 3D. Teknikken kan anvendes til celler af forskellige maligne potentiale, så systematisk undersøgelse af virkningerne af tumorassocierede stromata på tumorceller.
Abstract
Mens enorme indsats er gået ind i at identificere signalveje og molekyler der er involveret i normale og maligne celle adfærd 1-2, meget af dette arbejde er blevet udført ved hjælp af klassiske to-dimensionelle cellekulturmodeller, der giver mulighed for nem celle manipulation. Det er blevet klart, at intracellulære signalveje påvirkes af ekstracellulære kræfter, herunder dimensioner og celle overfladespænding 3-4. Flere tiltag er blevet taget til at udvikle tre-dimensionelle modeller, der mere præcist repræsenterer biologisk væv arkitektur 3. Selv om disse modeller har multi-dimensionalitet og arkitektoniske understreger undersøgelse af de deraf følgende virkninger på celler er mindre bekvem end i to-dimensionelle vævskultur på grund af begrænsninger i de modeller og vanskeligheden ved at udvinde celler til efterfølgende analyse.
Den vigtige rolle af mikromiljøet omkring tumorer i tumorigenese og tumor adfærd is stigende grad anerkendt 4. Tumorstroma består af flere celletyper og ekstracellulære molekyler. Under tumorudvikling der er bidirektionale signaler mellem tumorceller og stromaceller 5. Selv om nogle faktorer, der deltager i tumor-stroma CO-EVOLUTION er blevet identificeret, er der stadig et behov for at udvikle enkle teknikker til systematisk at kortlægge og studere den fulde vifte af disse signaler 6. Fibroblaster er den mest rigelige celletype i normale eller tumorassocieret stroma væv, og bidrager til aflejring og vedligeholdelse af basalmembran og parakrine vækstfaktorer 7.
Mange grupper er anvendt tredimensionelle dyrkningssystemer at undersøge rollen af fibroblaster på forskellige cellulære funktioner, herunder tumorrespons på terapier, immunceller, signalmolekyler, proliferation, apoptose, angiogenese og invasion 8-15. Vi har optimeret en simpel metode til æselEssing virkninger brystkirtlerne fibroblaster på mammale epitelceller anvendelse af et kommercielt tilgængeligt ekstracellulær matrix model til at skabe tredimensionale kulturer af blandede cellepopulationer (co-kulturer) 16-22. Med fortsat co-dyrkning af cellerne dannelse af sfæroider med fibroblaster klynger i det indre og epitelcellerne i vid udstrækning på det ydre af sfæroider og danne multi-cellulære fremspring i matrixen. Manipulation af fibroblaster, som fører til ændret epitelcelle invasionsevne let kan kvantificeres ved ændringer i antallet og længden af epitel fremskrivninger 23. Endvidere har vi udviklet en fremgangsmåde til isolering af epitelceller ud af tredimensionale co-kultur, der letter analyse af virkningerne af fibroblast eksponering på epitel adfærd. Vi har fundet, at virkningen af co-dyrkning fortsat i flere uger efter epitelcelle isolering, tillader rigelig tid til at udføre multiple assays. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til cellervarierende malignt potentiale og kræver ingen specialiseret udstyr. Denne teknik muliggør hurtig evaluering af in vitro-celle-modeller under flere betingelser, og de tilsvarende resultater kan sammenlignes med in vivo dyreforsøg vævsmodeller samt humane vævsprøver.
Protocol
1. Etablering af tre-dimensionelle cokulturer
- Dagen før indførelse af co-kulturer, fjernes Matrigel fra fryseren og tø på is i en 4 ° C køleskab natten over.
- På dagen for eksperimentet forberede medium til co-kultur, som svarer til medium for epitelceller, der skal anvendes (HMEC medium i dette eksempel: DME/F12 medium med 10% bovint kalveserum, 5 ug / ml insulin , 1 ug / ml hydrocortison og 1 ng / ml EGF). Holde mediet på is i mindst 1 time før blanding med Matrigel.
- At fortynde den optøede Matrigel, bestemme den samlede ønskede mængde af Matrigel: medium (300 uL per brønd i 24-brønds plader), og der tilsættes halvdelen volumen iskold HMEC medium til et sterilt rør på is. Derefter tilsættes den samme halv-samlede optøet Matrigel til røret for at opnå en 1:1 fortynding. Holder røret på is.
- Sted 50 pi Matrigel: medium blanding midten og i udpegede brønde i en 24-brønds plade oginkuber i 10 min i en 37 ° C inkubator med fugtig luft og 5% CO2.
- Tilføje en ekstra 450 pi Matrigel: medium blanding til brøndene og inkuberes i yderligere 60 minutter.
- Under inkuberingen fremstille en 01:01 suspension af fibroblaster (her h-TERT-immortaliserede reduktion brystkirtler Fibroblaster udtrykker GFP) og epitelceller (her h-TERT-immortaliserede humane mammae epithelial cellelinie, der udtrykker RFP) ved en koncentration på 0,5 x 10 5 celler hver i 0,5 ml HMEC medium.
- Efter 60 minutters inkubation, drop forsigtigt cellesuspensionen på toppen af den størknede gel, og returnere kultur til inkubatoren.
- Må ikke forstyrre de kulturer i 2 dage. Efter dette kan mediet skiftet hver 2-3 dage ved meget forsigtigt aspiration medium fra siden af brønden og forsigtigt erstatning med frisk HMEC medium.
- Overvåge sfæroid dannelse dagligt under mikroskopi. Kulturer er generelt modne efter 10-14 dage. Billede sompassende ved hjælp af lys eller fluorescensmikroskopi. Sfæroid størrelse og fremspring længde kan måles under lysmikroskopi.
2. Isolering af celler fra klumpformet cokulturer
- Meget forsigtigt, pipetteres kulturen op og ned 10x hjælp af en steril 2-ml glas pipette. Alternativt skæres spidsen af en 1000 mikroliter plastpipette spids med en saks steriliseret ved autoklavering eller nedsænkning i 70% ethanol for at pipettere kulturen. Overføre kultur med enten glaspipette eller snittet plast pipettespidsen til et sterilt 15 ml centrifugerør og centrifugeres i 5 minutter ved 2000 rpm ved stuetemperatur. De cellulære sfæroider vil sedimentere på bunden.
- Anvende en steril Pasteur pipettespidsen forsigtigt at fjerne det sprængte Matrigel fra toppen af den centrifugerede røret.
- Tilsæt 1 ml HMEC medium til de pelleterede sfæroider, pipetteres op og ned 2-3 gange med en steril 2 ml glaspipette, og overføre kulturen til en brønd i en 24-brøndsvævskulturplade.
- Lad sphæroider at fastgøre til fadet i mindst 48 timer før at ændre mediet. Tiden cellerne vil forlade de kugleformede struktur og vokser som monolag.
- Passage cellekulturer når cellerne når 50% konfluens. Første udvide kulturen til en 35 mm skål (ca. 2-4 dage), og derefter til en 100 mm skål (ca. 3-5 dage). Umiddelbart før hver passage trin anvender en steril Pasteur-pipette til manuelt at fjerne så mange resterende "spøgelses sfæroider" som muligt.
- Analysere celler ved flow-cytometri for populationen renhed ved hjælp af passende celleoverflademarkører og yderligere separate forskellige cellepopulationer ved fluorescensaktiveret cellesortering, hvis nødvendigt. De isolerede celler er nu klar til yderligere analyse som ønsket.
3. Repræsentative resultater
I det tredimensionale sfærisk co-kulturer, inducerer fibroblasterne med konstruerede Tiam1 silencing forøget invasion i matrix af mammale epitelceller (fig. 1, sammenlign D, E-, F til A, B, C). Fibroblaster med manipuleret overekspression af Tiam1 inducere faldt matrix invasion af brystkræft cellelinien SUM159 (figur 1, sammenlign J, K, L og G, H, I).
Når co-dyrkede sfæroider er blevet etableret, kan cellepopulationer isoleret fra sfæroider ved re-udpladning på et todimensionalt kontekst, som vist i figur 2. Afhængigt af de relative vækstrater for de testede celler kan rene populationer opstå via seriel passage (som vist i figur 3) eller kan sorteres ved hjælp af passende cellemarkører. Efter isolering af 3D co-kultur, bevarer epitelceller de egenskaber, som co-kultur med fibroblaster over længere tidsrum, hvilket tillader rig mulighed for analyse. I dette eksempel induceres udsættelse for Tiam1-deficiente fibroblaster forøget migration i co-dyrkede HMECs der varede i uge enfter isoleret fra 3D co-kultur (figur 4).
Figur 1. Billeddannelse af etablerede sfæroid co-kulturer under lys-og fluorescensmikroskopi. Sfæroid kulturer etableres med brystepitelceller og fibroblast-cellelinjer og fik lov til at vokse i kultur i 10-14 dage. AF: epitel = HMEC-mCherry celler. GL: epitelceller = SUM159-mCherry celler. AC, GI: fibroblast = kontrol RMF-GFP-celler. DF: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 lyddæmpning. JL: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 over-udtryk. Pilene angiver epitel fremspring invaderende i matrixen.
Figur 2. Serial billeddannelse af kulturer under lys-og fluorescensmikroskopi efter isolering fra Matrigel kultur. Dag 0 er billeddannelse umiddelbart efter isolering, dag 1, 2 og5 viser dage efter isolering. Korona af celler forlader den sphæroide stiger over tid. Til sidst et "spøgelse" kugleformet med meget få celler forbliver (pil). Meget få kugler tilbage efter spøgelse fjernelse og første passage.
Figur 3. Flowcytometrianalyse af celler efter isolering fra Matrigel co-kultur. Efter sfæroid co-kulturer er modnet, celler isoleret fra 3D co-kultur med pipettering og seriel passage. Prøvealikvoter analyseres ved flowcytometri (i dette eksempel ved anvendelse af grøn fluorescens og rød fluorescens identificere GFP-udtrykkende fibroblaster og mCherry-udtrykkende epithelceller henholdsvis) for at bestemme relative populationer af epitel-og fibroblast-celler.
Figur 4. Transwell migration af HMECs fortsætter efter isolatipå fra Matrigel co-kultur. Når rene populationer er blevet opnået ved dyrkning eller fluorescens cellesortering, kan cellerne analyseres som ønsket. Her migration HMECs co-dyrket med enten kontrol (C) eller Tiam1 deficiente (SHT) fibroblaster tværs perforerede transwells blev vurderet efter 2, 4 og 8 uger efter isolering fra co-kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåden præsenteres her repræsenterer en enkel fremgangsmåde til at analysere virkningen af stromacellerne fibroblaster på epitelceller, herunder tumorceller. Det giver mulighed for direkte celle-celle interaktion i et tredimensionalt forbindelse understøttet af ekstracellulær basalmembranmatrix, samtidig med at lette ekstraktion af celler fra matrixen til yderligere analyse. Dette kan anvendes til studiet af tumorassocierede stromata, som fibroblastlinier kan manipuleres til at påvirke signaleringsveje foretrukne og epitel linier kan variere i invasiv potentiale, som vist i figur 1. 3D co-kultur model giver mulighed for visuel kontrol af, at ændringer i celle invasionsevne er blevet fremkaldt. Isolering protokol muliggør ekstraktion af celler fra 3D kulturer med et minimum af håndtering og undgår anvendelse af trypsin eller matrix-opløsende midler, der kan påvirke celleegenskaber. Virkningerne af eksponering for fibroblast i 3D co-kultur stadig i epitelceller bagesteis isoleret fra 3D co-kultur, lette efterfølgende analyse (fig. 4). Medens det viste eksempel afbilder virkningerne på cellemigrering, kan ethvert assay anvendes til celler, der vokser i 2D anvendes på de isolerede celler. Vi har brugt denne metode til at analysere virkningerne af varierende fibroblast Tiam1 udtryk på opførsel af associerede brystepitelceller celler. Tiam1 mangel på fibroblaster fremmer brysttumor celleinvasion og metastase i 3D kultur dyretumormodeller 23. Denne fremgangsmåde har gjort det muligt at analysere eventuelle involveret veje ved anvendelse af molekylære, biokemiske og funktionelle assays (Liu og Buchsbaum, i trykken).
Det er vigtigt kun at anvende cellelinier i fremragende helbred og til at klæbe til streng steril teknikken for at forhindre kontaminering af kulturerne under fremgangsmåden. De bedste resultater opnås ved anvendelse af celler fra begyndelsen stedet sene passager (nøjagtige antal passager vil variere afhængigt af SPECIFIKTic cellelinie) og fra celler høstet ved densiteter mellem 50-80% konfluens. Præcis håndtering af Matrigel i henhold til protokol er nøglen for at lette både komplet flydendegørelsesmiddel forud for etableringen af de co-kulturer og for at sikre grundig størkning af matrix før tilsætning af cellerne. Utilstrækkelig mængde eller størkning af matrixen vil resultere i celler, der vokser som et monolag i stedet for sfæroider i kulturerne. Når først om den sphæroide co-kulturer, placeringen af en indledende 50 gl stik i brønden giver mulighed for solid forankring og mere ensartet størkning af den endelige matrix, som er nøglen til jævnt fordelt klumpformet dannelse. Fjernelse af alle spøgelses sfæroider ved post-isoleringsmetoder passage trin er kritisk, hvis automatiseret cellesortering skal anvendes til at adskille blandede populationer. De her viste eksempler anvendes phenol-rød uden Matrigel med protein sammensætning på ca 10 mg / ml. Phenol-rød frit præparat muliggør farve påvisning i ASSAys, såsom fluorescens.
Denne teknik kan anvendes på en række celletyper, for at undersøge virkningerne af stromacellerne fibroblaster på tilknyttede epiteliale tumorer eller omvendt virkningerne af tumorceller på tilknyttede fibroblaster. Denne teknik muliggør hurtig evaluering af in vitro-celle-modeller under flere betingelser, og de tilsvarende resultater kan derefter sammenlignes med in vivo dyreforsøg vævsmodeller samt humane vævsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
