Summary
Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de
Abstract
Chez les plantes à fleurs, l'embryon se développe au sein d'un tissu nourricier - l'endosperme - entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l'isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d'Arabidopsis et l'adhérence de l'embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'isolement efficace des jeunes embryons d'Arabidopsis, produisant jusqu'à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d'isolement d'un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l'intermédiaire d'un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d'un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d'applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l'ARN, des analyses de méthylation de l'ADN, l'hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.
Introduction
L'embryon de plantes à fleurs est entouré par l'albumen, un tissu nutritif dérivé d'un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l'endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l'enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l'intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d'embryons d'Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au microscope stéréoscopique, ou en appliquant une légère pression sur la graine en utilisant une pince pour les extraire. Ces techniques ont été utilisées avec succès pour les analyses de profilage épigénome telles que l'hybridation de puces à ADN, séquençage au bisulfite, ou de l'ARN (par exemple 1-3) ou transcriptome. En revanche, les études d'embryons au zygote jusqu'au début du stade globulaire restent techniquement difficile. À ce jour, seules quelques études ont repLes analyses du transcriptome signalés auparavant sur les jeunes embryons en utilisant soit microdissection laser-capture (LCM) de tissus embryonnaires de sections de semences fixe 4 ou extraction manuelle des embryons individuels de semences à l'intérieur en utilisant des outils fines 5. Toutefois, l'équipement LCM n'est pas couramment disponibles et extraction de l'embryon aux premiers stades manuel prend du temps et exige d'excellentes compétences de dissection qui ne sont pas facilement transférables. En plus des analyses du génome entier, dans les analyses d'expression génique in situ sont également difficiles à réaliser sur les jeunes, l'ensemble du montage embryons d'Arabidopsis. Dans une certaine mesure, les jeunes embryons peuvent être libérés sur des lames de microscope par une légère pression sur les graines et utilisés pour des essais de gène rapporteur ou la détection des protéines par coloration immunologique (voir par exemple 6,7). Cette technique, cependant, ne permet pas l'isolement des embryons à haut débit, entravant ainsi les analyses quantitatives.
Par conséquent, nous avons développé un protocole efficace et rapidepour l'isolement précoce de l'embryon à partir de graines d'Arabidopsis qui est simple à mettre en place, facilement transférable et approprié pour une variété d'applications en aval. Le principe de base est d'écraser doucement graines - disséqué de jeunes siliques dans un tube Eppendorf à l'aide d'un pilon en plastique dans un tampon d'isolement approprié. L'extrait de graines est placée sous forme de gouttelettes sur un chariot multi-puits et est projeté pour la présence d'embryons libérés au stade souhaité à l'aide d'un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l'aide d'un verre MICROCAPILLAIRE attaché à un micro-injecteur ou une pipette de laboratoire standard. Pour les applications moléculaires, les embryons sont lavés deux fois par libération répétées dans des gouttes d'un nouveau tampon d'isolement avant de les transférer à la mémoire tampon de destination dans un volume minimal. Pour les applications cytologiques (dosages de rapporteur, immunomarquage, poisson), des étapes de lavage peuvent être omises.
La méthode présente plusieurs avantages: (i) il donne 25-40 embryons ~ 45 min pour app cytologiquecations ou à 3-4 h pour les applications moléculaires (qui comprend les étapes de lavage), (ii) il permet l'isolement des stades embryonnaires spécifiques, (iii) il est facilement transférable à d'autres personnes et les laboratoires en raison de sa configuration simple, (iv) nécessite un équipement abordable pour la configuration de base qui se prête à la mise à niveau et (v) il a été utilisé avec succès pour diverses applications en aval telles que séquençage de l'ARN 8, analyse méthylation de l'ADN spécifique du gène 9, des dosages de rapporteur (10 et Raissig et al., en prép.) et le poisson (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédit, voir figure 5).
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Protocol
La procédure est résumée dans l'organigramme de la figure 1. Le microcapillaires et la configuration instrumentale sont présentés dans la figure 2 et la figure 3, et les étapes typiques de l'isolement de l'embryon sont présentés dans la figure 4.
1. Matière et mémoire tampon Préparation
1.1 Silicon revêtement de verre microcapillaires
- Placez le microcapillaires dans un tube Falcon de 15 ml avec environ 5 ml de Sigmacote (Sigma) et inverser plusieurs fois.
- Retirez la solution, placer le tube Falcon contenant les capillaires dans une feuille d'aluminium et cuire au four pendant 3 heures à 60 ° C. Stocker à température ambiante.
1.2 Obtenir ~ 50-100 um de diamètre conseils microcapillaires
- Tirez 1 mm de diamètre capillaires en verre soit manuellement sur un bec Bunsen ou en utilisant un extracteur commercial (extracteur filament vertical ou micropipette extracteur).
- Utiliser un diamantStylo à pointe ou une lame pour couper le bout du capillaire tiré pour créer l'ouverture souhaitée. Sélectionnez les capillaires meilleure forme sous un microscope stéréo. L'ouverture devrait être 50-100 um (Figure 2).
1.3 Préparation de la lame
- Siliconize lames propres en couvrant tous les puits avec Sigmacote (~ 1 ml / slide) pendant 5 min, retirer. Cuire 3 heures dans du papier d'aluminium. Stocker à température ambiante.
- Laver les lames microscopiques verre multi-puits pendant 10 min dans 10% SDS, 2 x 2 min dans de l'eau sans nucléase (autoclave DEPC-DDH 2 O), 2 min dans de l'éthanol à 70%, 2 min dans de l'éthanol à 100%, air- sécher. Toutes les étapes sont effectuées dans des bocaux Coplin autoclave. Les diapositives peuvent être réutilisés plusieurs fois fournir un nettoyage en profondeur entre chaque utilisation.
- Juste avant l'embryon propagation d'isolement ~ 0,5 ul de 10 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) avec une pipette sur toute la surface de chaque puits et séché à l'air.
1.4 Microscope et la configuration capillaire
<ol>1,5 Tampons
Le tableau 1 présente l'isolement et la destination des tampons en fonction des applications en aval.
- Préparer ~ 1 tampon d'isolement ml par échantillon fraîchement avant l'utilisation et le garder sur la glace.
- Préparer le tampon de destination dans un tube à faible liaison 0,5 ml Eppendorf sur la glace (applications moléculaires) ou sur une lame de microscope (applications cytologiques) dans une chambre humide.
2. Dissection de semences et d'extraction de l'embryon
2.1 Synchronisation de développement des semences
- Émasculer fleurs et les garder 2 jours dans la chambre de croissance, tout en évitant le contact des pistils exposés avec d'autres fleurs, alors les polliniser (par exemple 11).
- Testez le stade de développement sous vos conditions de croissance par étude microscopique des graines compensés. Grâce à nos conditions de croissance (16 heures de lumière à 21 ° C, 8 h obscurité à 18 ° C et 70% d'humidité) de graines collectées 2,5 jours après la pollinisation (DAP) ont livré principalement 2-4 embryons cellulaires et les graines collectées 3,5 à 4 DAP a donné globulaire embryons.
2.2 Seed Dissection et Rupture
- Retirez le seeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sous une loupe binoculaire avec des pinces et des aiguilles à insuline.
- Plonger les graines dans 20 tampon d'isolement ul dans un tube Eppendorf 2 ml à fond rond placé sur la glace.
- Écraser délicatement les graines avec un pilon en plastique (préalablement nettoyé avec 10% de SDS, rincé avec DEPC-DDH 2 O et lavé avec de l'éthanol à 70%) pour libérer les embryons jusqu'à ce que l'extrait de pépins est trouble. La force à appliquer doit être déterminé par chaque utilisateur lors de son procès.
- Rincer le pilon avec 300 pi de tampon d'isolement pour laver le pilon et diluer l'échantillon.
- Spin-bas l'extrait à 5000 g pendant 5 sec. Resuspendre doucement l'extrait granulés par aspiration-et-vient 2-3 fois.
- Filtrer l'extrait avec une maille de nylon de 30 um (monté sur les adaptateurs de tubes, par exemple de PartecCelltricks). Rincez le filet avec un tampon d'isolement supplémentaire de 200 ul.
3. Isolation des embryons
3.1 Préparation de la lame
- <li> Placez une lame multi-puits propre, BSA-couché et siliconé sur la scène du microscope inversé, remettre en suspension l'extrait de graines filtrée par un léger pipetage de haut en bas et d'une pipette 2 gouttes de 40-50 ul extrait de graines dans 1 ou 2 puits . Dépistage seulement 1 ou 2 gouttes à la fois empêche l'évaporation de l'échantillon.
- Placer 50 pi de tampon d'isolement frais (1 goutte de lavage st) dans un puits d'une autre diapositive préparée comme avant. Gardez cette diapositive dans une chambre humide couverte pour éviter l'évaporation.
3.2 Ecran, nettoyer, collecter
- Écran les gouttelettes d'extrait de pépins pour les embryons au stade souhaité avec l'objectif de grossissement de 10x. Si nécessaire, confirmez la scène avec un grossissement de 20x. Les embryons coulent généralement vers le bas de la glissière.
- Retirer manuellement les débris autour de l'embryon d'une aiguille de tungstène, d'une aiguille d'insuline ou d'un équipement similaire.
- Déplacez le capillaire en verre près de l'embryon à l'aide du micromanipulateur, take l'embryon avec aussi peu de solution possible.
- Rassemblez plusieurs embryons (par exemple tous une gouttelette) et les libérer dans la chute de lavage 1er (demande moléculaire) ou dans un tampon de destination (applications cytologiques). Chaque tour de collecte doit être conservé dans les 5-10 min et embryons doivent être collectés dans un volume minimal (le volume total de tous les tours de collecte doit être <5 pi).
- Répéter le dépistage et la collecte jusqu'à la quantité désirée d'embryons est rassemblée dans la chute de lavage 1er (au centre, si possible, afin de faciliter souvenir).
- Rappelez tous les embryons à la fois de la baisse de lavage (si des débris sont reportés, retirez-les avec une aiguille avant de souvenir).
- Relâchez les embryons dans une goutte de lavage 2 ème de 50 pi. Répétez 3.2.6.
- Relâchez les embryons dans le tampon de destination. Le transfert devrait impliquer seulement un contact, et non l'immersion, de la pointe capillaire.
- Remplacez le microcapilLary pour l'échantillon suivant.
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Representative Results
Notre procédure d'isolement de l'embryon (figure 1) permet d'isoler jusqu'à 40 embryons à 4 heures si les lavages sont effectués, par exemple pour les applications moléculaires, ou en moins d'une heure si lavages sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. Figure 2 affiche haut et bas Conseils microcapillaires qualité et la figure 3 montre la configuration de la machine d'isolement de l'embryon. Figure 4 affiche le processus d'isolement de l'embryon sur le microscope inversé.
Nous avons appliqué avec succès notre procédure pour diverses applications publiées dans plusieurs articles récents. La méthode a été initialement développé pour analyser la contribution des parents au début du transcriptome embryonnaire. Embryons hybrides générés par croisements entre deux accessions d'Arabidopsis différents (Landsberg erecta (L er) et Columbia (Col-0)) ont été isolées au stade de la cellule 2-4. ARN totaux ont été extraits, ADNcbibliothèques ont été produites en utilisant une amplification linéaire et séquencées sur une plate-forme solide. Les transcriptomes allèle-spécifiques ont été générés à partir de l'analyse des SNP 8. Pour contrôler nos banques d'ADNc embryonnaires avant le séquençage nous avons amplifié transcriptions embryon spécifiques, WUSCHEL-HOMEOBOX 2, 8 et 9 (WOX2, WOX8, WOX9) et l'actine 11 (13,14, figure 5A).
En outre, cette méthode a été utilisée pour isoler les jeunes embryons pour analyser les tendances méthylation de l'ADN embryonnaires à des loci spécifiques dans le génome. Les embryons ont été isolés et lavés en 1x tampon TE. Séquençage au bisulfite à petite échelle a été réalisée comme décrit 9,15.
De même, l'isolement de l'embryon s'est révélée très utile dans les tests de gènes rapporteurs avec une faible expression embryonnaire, et où le tégument maternelle confond détection ou est masqué par l'expression de journaliste dans les tissus entourant l'embryon (endosperme, tégument). Embryons carr ying le transgène rapporteur sont colorées (ß-glucuronidase; GUS) ou directement analysé (Protéine fluorescente verte ou rouge; GFP, RFP) suite à l'isolement. Un exemple est donné dans la figure 5B pour les embryons exprimant un gène rapporteur GUS sous le contrôle du promoteur MEDEA (p MEA) 10. La relative facilité avec laquelle de nombreux embryons peuvent être isolés permet également à des analyses quantitatives (nombre d'embryons colorés dans différents fonds génétiques, Raissig, Grossniklaus et al. Dans la préparation).
Enfin, nous avons appliqué avec succès hybridation fluorescente in situ (FISH) et des techniques d'immunocoloration pour étudier l'architecture nucléaire dans les embryons isolés embarquée dans les plaquettes de l'acrylamide sur des lames. Un exemple de FISH utilisant des sondes contre les répétitions centromériques et régions nucléolaires organisation est illustrée à la figure 5C.
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Figure 1. Organigramme de la procédure d'isolement de l'embryon Le protocole est divisé en trois parties: 1 - Préparation du matériel; 2 - Semences dissection; 3 - isolement de l'embryon..
Figure 2. Conseils microcapillaires. A. astuces microcapillaires de haute qualité avec une ouverture en douceur de l'ordre de 100 um. B. Conseils microcapillaires qualité réduite à large ouverture et le contour irrégulier (ces conseils sont acceptables pour les applications cytologiques seulement). Barre d'échelle: 2 mm.
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Figure 3. Mise en place de l'isolation microscope de l'embryon. A. et B. Le dépistage est effectué sur des lames de microscope sous un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l'aide d'un verre MICROCAPILLAIRE fixé sur un micromanipulateur de contrôler précisément sa position (voir aussi la figure 4) et relié soit à un micro-injecteur (A) ou de la norme laboratoire pipette (B). A. Le verre microcapillaires est lié à une commande hydraulique de micro-injecteur (par exemple Eppendorf cellulaire Tramway Vario) pour un contrôle précis lors de la collecte embryon B. Le micro-capillaire de verre est fixée à un P-200 pipette standard au moyen d'un tube flexible en caoutchouc. collecte d'embryons et de libération est contrôlée en tournant la molette de calibrage de la pipette. Embouts de pipette Cut-end sont utilisés comme connecteurs et les jonctions sont scellés avec du parafilm. La microcapillary est fixé sur le micromanipulateur via des blocs de polystyrène, tubes Falcon et du ruban adhésif.
Figure 4. processus d'isolement de l'embryon. A. A 2-4 embryon de cellule (flèche) a été identifiée dans l'extrait de graines (gouttelettes de dépistage) et est entourée par des débris (fragments du tégument). B. Les débris environnant a été enlevé manuellement à l'aide d'une aiguille. C. Le capillaire en verre a été déplacé juste à côté de l'embryon (flèche). D. L'embryon a été recueilli et est maintenant dans les capillaires (flèche). E. Plusieurs embryons dans la dernière goutte après lavages. Scale = 50 um.
F igure 5. Applications en aval de l'isolement de l'embryon A. analyses d'expression génique.: Amplification PCR de WOX9, WOX2, WOX8 et ACTIN11 13,14 sur des banques d'ADNc (généré comme décrit 8) 2-4 embryons de cellules lavées 1x fois (1ère voie) et génomique . l'ADN (2ème voie) B. dosage Reporter: Un embryon à 8 cellules isolées à partir de plantes portant ap MEA :: GUS construction était tachée sur une lame dans une solution standard de coloration GUS (reproduit à partir Raissig et al, 2011, après autorisation de l'. Plant Cell, ASPB copyright). C. Fluorescent hybridation in situ (FISH): un embryon à 8 cellules a été hybridé avec des sondes contre répétitions centromériques (rouge), et ADNr 45S répétitions (vert) avant immunodétection indirecte 16. Les images de poissons bicolores ont été superposées avec la contre-coloration DAPI et images DIC (DM6000B épifluorescence microscope, Leica, Allemagne).
| Demande | un tampon d'isolement | buffer de destination |
| Extraction de l'ARN (par exemple pour l'amplification et transcriptomique) | 1x tampon premier volet (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | Un tampon d'extraction d'ARN |
| Extraction d'ADN (par exemple pour le séquençage au bisulfite) | Tris 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8 (TE) | Tampon d'extraction de l'ADN ou de tampon TE 1x |
| Analyse de reporter GFP | 1 M glycine en 0.5x MS 1 | 1 M glycine en 0.5x MS |
| Analyse rapporteur GUS | tampon de coloration 2 sans X-Gluc (substrat) | tampon de coloration avec X-gluc (substrat) |
| FISH & Immunocoloration | 100 mM de phosphate (PBS) | Acrylique activée: mélange Bisacryl (33:3) sur un Superfrost plus slide-polymériser pendant 30 min |
Tableau 1. Isolement et destination des tampons pour différentes applications en aval. Les tampons peuvent être adaptées aux besoins expérimentaux spécifiques. 1 Murashig & Skoog. 2 ex Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
Nous avons élaboré un protocole d'isolement de l'embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d'autres laboratoires.
L'équipement décrit ici se compose d'un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l'isolement de cellules animales unique pour l'analyse transcriptomique 17. Nous avons également travaillé avec succès avec une configuration plus basique où le verre microcapillaires ont tendu la main dessus d'une flamme (et couper avec une lame de diamant) et exploité par l'intermédiaire d'une pipette de laboratoire standard (Pipetman P-200) à la place d'un micro-injecteur (figure 3B). Dans ce cas, le micro-capillaire était attaché à la pipette via un tube de caoutchouc. 10 Filtertips pi ont été utilisés pour faire les jonctions, qui ont été enveloppés avec du parafilm pour les rendre étanches à l'air. Le capillaire - détenues par la pointe de la pipette - a été fixé sur le MICRBras de omanipulator en utilisant des blocs de polystyrène et la bande (figure 3B). Cette configuration de base s'est avérée efficace et fiable 8. Néanmoins, l'une des principales difficultés était le maintien des jonctions étanches entre le micro-capillaire et la pipette, en particulier lors du passage du capillaire. Vérifier et ajuster la pression dans le capillaire - pour assurer une collecte d'embryons affiné dans un volume minimal - peut être fastidieux à utiliser cette configuration de base. La configuration améliorée avec un micromanipulateur à commande hydraulique et d'un extracteur de filament vertical est une amélioration considérable et gagner du temps.
Les compétences requises pour l'application réussie de cette méthode sont facilement transférables. Cinq utilisateurs dans notre laboratoire ont appris avec succès la méthode en un temps relativement court. Certaines simplifications du protocole sont possibles en fonction de la facilité de l'utilisateur dans la manipulation. Par exemple, il est possible de sauter les étapes 2.2.5 et 2.2.6 toutdissection à 5 siliques (au lieu de 15) et de nettoyage dans les environs de l'embryon à fond contre les débris avec une aiguille de tungstène (cette procédure a été appliquée à 8). Synchronisation de développement des semences à travers l'émasculation et la pollinisation différée est facultative mais recommandée pour augmenter le nombre d'embryons au même stade de développement, en particulier à des stades précoces. En outre, l'isolement de l'embryon peut être accéléré si des étapes de lavage sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. En outre, siliconisation coulissant (étape 1.3.2) n'est pas nécessaire pour les utilisateurs travaillant rapidement, de sorte que les embryons qui collent à la surface du verre au cours du temps n'est pas un problème.
Si le filtrage ou le nettoyage manuel est appliqué, il est extrêmement important d'éviter toute contamination par des débris de tissu qui crée des risques de contamination de l'ARN en aval ou les applications de l'ADN. Cette question a été soulevée récemment dans une étude de profilage transcriptome utilisant une méthode différente de l'isolement de l'embryon18. Contrairement au protocole d'isolement des embryons en vrac décrit ici, les auteurs disséqués embryons Arabidopsis manuellement à partir de graines individuelles à l'aide de fines aiguilles, une longue procédure nécessitant d'excellentes compétences de dissection. Cette procédure apparemment requis 2 ou plusieurs lavages pour éviter le report de cellules contaminantes possibles du tissu environnant de semences, une situation probablement rencontré lors de l'utilisation de cette méthode étant donné la petite taille des embryons, les difficultés pour y accéder avec des aiguilles de dissection, et l'adhérence des cellules environnantes. En revanche, notre procédé permet (i) la dilution de l'embryon-extrudé à partir des graines à l'écrasement et autour des débris dans un grand volume (500 pi) avant la collecte des embryons, (ii) la sélection visuelle des embryons dépourvus de colle, contaminant des débris, et (iii) la dilution de la contamination possible d'ARN-fuite de rupture des cellules par les étapes de lavage. Bien qu'il soit possible de n'utiliser qu'une seule étape de lavage si l'embryons semblent très propres et sont recueillis en moins de 5 pi 8, une deuxième étape de lavage est recommandé, surtout pour les utilisateurs novices peuvent également collecter les embryons dans plusieurs séries (ie avec un volume d'additif). Les embryons doivent être collectés en aussi peu que possible solution, permettant la dilution maximale de contaminants potentiels dans chaque étape de lavage. Chaque tour de collecte doit être court (dans les 5-10 min) pour permettre la récupération maximale après leur libération dans la chute de lavage (plus la présence dans le capillaire tend à réduire le taux de récupération). De plus, le transfert des embryons collectés dans le milieu d'extraction (en suivant les étapes de lavage) doit seulement impliquer un contact avec l'ouverture de la pointe micro-capillaire et de ne pas l'immersion de la pointe, comme ce pourrait tout aussi bien transférer les débris collage sur la paroi microcapillaire ci-dessus l'ouverture. Enfin, le capillaire doit être changée entre chaque nouvel extrait de pépins.
Notre protocole permet à plusieurs downstream applications en utilisant simplement un tampon d'isolement appropriée qui préservent l'intégrité moléculaire de l'ARN, de l'ADN, la chromatine, reporter enzymatique ou fluorescent. Nous avons réussi à isoler les embryons dans le tampon d'isolement d'ARN-protecteur pour les analyses transcriptomiques extraction de l'ARN et 8, 1x TE-tampon pour les analyses de méthylation de l'ADN 9, phosphate 100 mM (PBS) pour les poissons et immunohistochimique (Jaenisch, Grossniklaus et Baroux, inédit, figure 5C), et une solution de coloration sans substrat pour les dosages de rapporteur GUS (19, figure 5B). L'application la plus sensible aux conditions d'isolement / qualité de l'embryon est certainement extraction de l'ARN et amplification. La quantité d'ARN extrait à partir d'embryons isolés a été plutôt faible. De ~ 30 embryons au stade de cellules 2-4 (donc 60-120 cellules au total) nous avons estimé un montant d'environ 1 ng d'ARN total sur la base de deux bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies) et des mesures qubit (Invitrogen). Following extraction de l'ARN, l'ARN qualité a été vérifiée sur un RNA 6000 Pico puce Agilent (Agilent Technologies). Cependant, la faible quantité d'ARN extrait n'est pas toujours suffisante pour produire un profil fiable. Ainsi, des tests supplémentaires doivent être effectués sur le matériel amplifié (ADNc) (par exemple PCR de détection de basse exprimées, les gènes de l'embryon spécifiques et / ou un profil Bioanalyzer).
Enfin, la possibilité d'isoler embryons par des critères visuels dans notre protocole est un grand atout. Embryons provenant de la même siliques (fruits Arabidopsis) ne se développent pas de manière synchrone. Ainsi, en travaillant sur des extraits de siliques ensemble (par exemple pour des analyses RT-PCR ou rapporteurs quantitatives) ne permet pas une corrélation parfaite avec un stade de développement donné. Isoler embryons à un stade de développement spécifique résout ce problème. En outre, un problème similaire présente lorsque l'on travaille avec des mutants hétérozygotes où siliques contiennent différents génotypes d'embryons. Isoler les embryons en fonction de critères visuels à distinguish par exemple de type sauvage de phénotypes d'embryons mutants permet de corréler les analyses en aval avec le génotype. Nous l'avons fait avec succès pour analyser la méthylation de l'ADN à des loci spécifiques dans différents génotypes 20.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Tal Nawy et Martin Bayer pour leurs conseils sur l'isolement de l'embryon. MTR, VG, UG et CB conçu le matériel d'isolation de l'embryon. MTR, VG et CB ont développé le protocole d'isolement de l'embryon. MTR, VG et CB établi le protocole, isolés les embryons, et l'embryon ADNc généré, VG réalisé la PCR, le MTR de coloration GUS, JJ des expériences du poisson. MTR, VG, CG et UG écrit le manuscrit. Ce travail a été financé par l'Université de Zürich, une bourse de la Fondation de recherche Roche (à MTR), et des subventions de la Fondation nationale suisse (à UG et CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
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