Summary
Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus
Abstract
In Blütenpflanzen, entwickelt der Embryo innerhalb einer nährenden Gewebe - das Endosperm - von den mütterlichen Saatgut Integumente (oder Samenschale) umgeben ist. Als Folge wird die Isolierung von pflanzlichen Embryonen in frühen Stadien (1 Zelle Kugelsternhaufen Stufe) technisch anspruchsvolle aufgrund ihrer relativen Unzugänglichkeit. Effiziente manuelle Zerlegung in frühen Stadien ist stark durch die geringe Größe der jungen Arabidopsis Samen und die Haftfähigkeit des Embryos in die umliegenden Gewebe beeinträchtigt. Hier beschreiben wir eine Methode, die die effiziente Isolierung von jungen Arabidopsis Embryonen ermöglicht, wodurch bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden, abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Die Embryonen werden in die Isolation Puffer durch leichtes Quetschen 250-750 Samen mit einer Kunststoff-Stößel in ein Eppendorf-Röhrchen veröffentlicht. Ein Glas entweder mit einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren (über einen Gummischlauch) oder eine hydraulisch gesteuerte Mikroinjektor wird verwendet, um Embryonen aus Tröpfchen Ort zu sammelnd auf einer Multi-Well-Folie auf einem invertierten Lichtmikroskops. Die technischen Fähigkeiten erforderlich sind einfach und leicht übertragbar, und die grundlegende Einrichtung erfordert keine teure Ausrüstung. Erhaltene Embryonen sind geeignet für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, DNA-Methylierungsanalyse, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Immunfärbung und Reportergen-Assays.
Introduction
Der Embryo von Blütenpflanzen wird durch das Endosperm, ein Nährgewebe von einer zweiten Düngung Veranstaltung abgeleitet umgeben. Sowohl Embryo und Endosperm durch mehrere Zellschichten der Samenschale umgeben. Gemeinsam bilden diese Gewebe einen Samen, der in der Frucht zu entwickeln. So werden Gewebe-und Zell-spezifische Analysen von Arabidopsis Embryonen stark beeinträchtigt durch ihre Unzugänglichkeit. Dennoch sind Embryonen bei den späten Kugelsternhaufen oder späteren Phasen relativ gut zugänglich manuelle Dissektion mit feinen Wolfram Nadeln unter dem Stereomikroskop, oder durch leichten Druck auf das Saatgut mit einer Pinzette, um sie zu extrahieren. Solche Techniken wurden erfolgreich für Transkriptom oder epigenome Profiling Analysen wie Microarray-Hybridisierung, Bisulfit-Sequenzierung oder RNA-Sequenzierung (zB 1-3) verwendet. Im Gegensatz dazu bleiben Studien von Embryonen bei der Zygote bis Anfang globulären Stadium technisch anspruchsvoll. Bisher haben nur wenige Studien reported Transkriptomanalysen auf junge Embryonen entweder mit Laser-Mikrodissektion (LCM) von embryonalen Geweben von festen Samen Abschnitten 4 oder manuelle Extraktion einzelner Embryonen aus Samen mit feinen Werkzeugen 5. Allerdings ist LCM Ausrüstung nicht allgemein verfügbar und manuelle Extraktion Embryos in frühen Stadien ist zeitaufwendig und erfordern hervorragende Präparation Fähigkeiten, die nicht leicht übertragbar. Neben genomweite Analysen, in situ Genexpressionsanalysen sind auch schwierig, auf junge, whole-mount Embryonen von Arabidopsis durchzuführen. In gewissem Umfang können junge Embryonen auf Objektträgern durch sanften Druck auf die Samen freigesetzt werden und für Reportergen-Assays oder Protein Erkennung durch Immunfärbung (siehe zum Beispiel 6,7). Diese Technik ist jedoch nicht erlaubt High-Throughput-Embryo Isolierung und behindern so quantitative Analysen.
Deshalb entwickelten wir eine effiziente und schnelle Protokollfür frühe Embryo isoliert von Arabidopsis Samen, die einfach zu installieren, leicht übertragbar und eignet sich für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Das Grundprinzip besteht darin, vorsichtig zerdrücken Samen - seziert von jungen Schoten in ein Eppendorf-Röhrchen mit einem Kunststoff-Stößel in einer geeigneten Isolierung Puffer. Der Extrakt wird in Tröpfchen auf einer Multi-Well-Objektträger aufgebracht und auf das Vorhandensein des freigesetzten Embryonen bei der gewünschten Stufe gescreent unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Die Embryonen werden gesammelt mit einem Glas zu einem Mikroinjektor oder einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren. Für molekulare Anwendungen werden Embryonen zweimal durch wiederholte Freisetzung in Tropfen neue Isolierung Puffer vor der Übertragung auf den Zielpuffer in einem minimalen Volumen gewaschen. Für zytologische Anwendungen (Reporter-Assays, Immunfärbung FISH), können Waschschritte verzichtet werden.
Das Verfahren bietet mehrere Vorteile: (i) es ergibt 25-40 Embryonen in ~ 45 min für die zytologische Appfentlichungen oder in 3-4 Stunden für die molekulare Anwendungen (einschließlich der Waschschritte), (ii) es ermöglicht Isolierung spezifischer embryonalen Stadien, (iii) es ist leicht auf andere Personen übertragbar und Labors aufgrund seiner einfachen Setup, (iv) es erfordert erschwinglichen Geräten für die Grundeinstellungen, die zugänglich für Upgrades ist, und (v) wurde erfolgreich für verschiedene nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Sequenzierung 8, Gen-spezifischen DNA-Methylierung Analyse 9, Reporter-Assays (10 und Raissig et al. verwendet, in prep.) und FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux unveröffentlicht, siehe Abbildung 5).
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Protocol
Das Verfahren ist in dem Flussdiagramm in 1 gezeigt zusammengefasst. Die Mikrokapillaren und die instrumentale Setup sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt und typische Schritte Embryo Isolierung sind in Abbildung 4 dargestellt.
1. Material-und Buffer Vorbereitung
1.1 Silicon Beschichtung von Glas Mikrokapillaren
- Legen Sie die Mikrokapillaren in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) und invertieren mehrmals.
- Entfernen Sie die Lösung, platzieren Sie den Falcon Röhrchen mit der Kapillaren in einer Aluminiumfolie und backen Sie sie für 3 Stunden bei 60 ° C Lagerung bei Raumtemperatur.
1.2 Erhalten ~ 50-100 um Durchmesser mikrokapillaren Tipps
- Ziehen 1 mm Durchmesser Glaskapillaren entweder manuell über einen Bunsenbrenner oder durch Verwendung eines handelsüblichen Abzieher (vertikale Faden Abzieher oder Feinpipettenziehvorrichtung).
- Verwenden Sie eine Diamant-Filzstift oder Klinge, um die Spitze der Kapillare gezogen geschnitten, um die gewünschte Öffnung zu schaffen. Wählen Sie die beste-förmigen Kapillaren unter einem Stereomikroskop. Die Öffnung sollte 50-100 um (Abbildung 2).
1.3 Slide Vorbereitung
- Siliconize sauber Schlitten durch die alle Vertiefungen mit Sigmacote (~ 1 ml / Folie) für 5 min, zu entfernen. Bake 3 Stunden in Alufolie. Lagerung bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Multi-Well-Glas Objektträger für 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in Nuklease-freiem Wasser (DEPC autoklaviert-ddH 2 O), 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 100% Ethanol, Luft- trocknen. Alle Schritte werden in autoklavierte Coplin Gläser getan. Folien können mehrmals verwendet werden, sofern eine gründliche Reinigung zwischen jedem Gebrauch.
- Unmittelbar vor dem Embryo isoliert Ausbreitung ~ 0,5 ul 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Pipette über die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung und an der Luft trocknen.
1.4 Mikroskop und Kapillar-Setup
<ol>1.5 Puffer
Tabelle 1 listet die Isolierung und Zielpuffer Abhängigkeit von den Downstream-Anwendungen.
- Bereiten ~ 1 ml Isolation Puffer pro Probe vor Gebrauch frisch und bewahren Sie es auf Eis.
- Bereiten Sie die Ziel-Puffer in einem 0,5 ml Eppendorf schwach bindende Röhrchen auf Eis (molekulare Anwendungen) oder auf einem Objektträger (zytologische Anwendungen) in einer feuchten Kammer.
2. Seed Dissection und Embryo Extraction
2.1 Synchronisation von Seed Entwicklung
- Emasculate Blumen und halten sie 2 Tage im Wachstum der Kammer, während die Vermeidung von Kontakt der exponierten pistils mit anderen Blumen, dann bestäuben sie (z. B. 11).
- Testen Sie die Stufe der Entwicklung unter den Wachstumsbedingungen durch mikroskopische Untersuchung von Saatgut gelöscht. Mit unserem Wachstumsbedingungen (16 Stunden Licht bei 21 ° C, 8 Stunden Dunkelheit bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit) Samen gesammelt 2,5 Tage nach der Bestäubung (DAP) lieferte hauptsächlich 2-4 Embryonen und Samen gesammelt 3,5-4 DAP ergab Kugelsternhaufen Embryonen.
2.2 Seed Dissection und Rupture
- Entfernen Sie die seeds 10-15 Schoten (~ 2,5 DAP) unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette und Insulin Nadeln.
- Tauchen Sie die Samen in 20 ul Isolation Puffer in einem 2-ml-Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt.
- Vorsichtig zerdrücken Sie die Samen mit einer Kunststoff-Stößel (mit 10% SDS Pre-gereinigt, gespült mit DEPC-ddH2O gewaschen und mit 70% Ethanol), um die Embryonen freizugeben, bis die Samen-Extrakt ist bewölkt. Die Kraft anzuwenden ist, die von jedem Benutzer bei Versuch bestimmt werden.
- Spülen Sie den Stößel mit 300 ul Puffer, um die Isolation Stößel waschen und Verdünnen Sie die Probe.
- Spin-down der Extrakt bei 5.000 xg für 5 Sekunden. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Extrakt durch Pipettieren up-and-down 2-3 mal.
- Der Extrakt wird mit einer 30 um Nylon-Mesh (montiert auf Rohr-Adapter, zB von PartecCelltricks). Spülen Sie die Masche mit einer zusätzlichen Isolierung 200 ul Puffer.
3. Embryo Isolation
3.1 Slide Vorbereitung
- <li> Ein sauberes, BSA-beschichteten und silikonisierten Multi-Well-Schieber auf der Bühne des inversen Mikroskop, suspendieren die gefilterte Extrakt durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten und Pipette 2 Tropfen von 40-50 ul-Extrakt in 1 oder 2 Brunnen . Screening nur 1 bis 2 Tropfen auf einmal verhindert die Verdunstung der Probe.
- Platz 50 ml frisches Isolation Puffer (1. wash & Drop) in eine Vertiefung einer anderen Folie wie zuvor vorbereitet. Bewahren Sie diese Folie in einem überdachten, feuchten Kammer, um Verdunstung zu verhindern.
3.2 Bildschirm, reinigen, sammeln
- Bildschirm Der Tropfen Extrakt für Embryonen in der gewünschten Stufe mit dem 10-facher Vergrößerung Ziel. Bestätigen Sie ggf. die Bühne mit dem 20-facher Vergrößerung. Die Embryonen in der Regel an der Unterseite des Schlittens sinken.
- Manuell entfernen Sie Schmutz rund um den Embryo mit einer Wolfram-Nadel, einer Insulin-Nadel oder ähnlichen Geräten.
- Bewegen Sie die Glaskapillare in der Nähe der Embryo mit dem Mikromanipulators take up des Embryos mit so wenig wie möglich Lösung.
- Sammle mehrere Embryonen (z. B. alle ein Tröpfchen) und lassen sie in der 1. Wäsche Tropfen (molekulare Anwendung) oder in Ziel-Puffer (zytologische Anwendungen). Jede Runde sammeln sollte innerhalb von 5-10 min und Embryonen aufbewahrt werden sollten in einem minimalen Volumen (das Gesamtvolumen aller Sammeln Runden sollte <5 ul sein) gesammelt werden.
- Wiederholen Sie das Screening und Sammlung, bis die gewünschte Menge an Embryonen in der 1. Wäsche Tropfen gesammelt (zentral, wenn möglich, um Erinnerung zu erleichtern).
- Erinnern Sie alle Embryonen auf einmal aus der Wäsche Tropfen (wenn Schutt durchgeführt werden über, entfernen Sie sie mit einer Nadel vor Erinnerung).
- Lassen Sie die Embryonen in einem 2. waschen Tropfen von 50 pl. Wiederholen 3.2.6.
- Lassen Sie die Embryonen in der Ziel-Puffer. Die Übertragung sollte beinhalten nur einen Kontakt, und nicht Eintauchen der Kapillare Spitze.
- Ersetzen Sie die microcapillARY für die nächste Probe.
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Representative Results
Unsere Embryo Isolation Verfahren (Abbildung 1) ermöglicht die Isolierung von bis zu 40 Embryonen in 4 Stunden, wenn Waschungen durchgeführt werden, z. B. für die molekulare Anwendungen oder in weniger als einer Stunde, wenn Wäschen weggelassen werden, zB für die zytologische Anwendungen. Abbildung 2 zeigt hohe und niedrige Qualität mikrokapillaren Tipps und Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Embryos Isolierung Maschine. Abbildung 4 zeigt den Prozess der Embryo Isolation auf dem inversen Mikroskop.
Wir haben erfolgreich angewendet unser Verfahren für verschiedene Anwendungen in mehreren Artikeln veröffentlicht. Die Methode wurde ursprünglich entwickelt, um die Kindersicherung Beitrag zur frühen embryonalen Transkriptom analysiert. Hybrid Embryonen durch Kreuzungen zwischen zwei verschiedenen Arabidopsis Akzessionen (Landsberg erecta (L r) und Columbia (Col-0)) erzeugt wurden, an der 2-4 Zell-Stadium isoliert. Gesamt-RNA wurde extrahiert, cDNABibliotheken wurden unter Verwendung von linearer Verstärkung und sequenziert auf einer soliden Plattform. Die Allel-spezifische Transkriptomen wurden basierend auf SNP-Analyse 8 erzeugt. Um unsere embryonalen cDNA-Bibliotheken vor der Sequenzierung wir verstärkt Embryo-spezifischen Transkripte, Wuschel-homeobox 2, 8 und 9 (WOX2, WOX8, WOX9) und Aktin 11 (13,14, 5A) zu steuern.
Außerdem wurde diese Methode verwendet, um junge Embryonen zu isolieren, um die embryonale DNA-Methylierungsmuster in bestimmten Orten im Genom zu analysieren. Die Embryonen wurden isoliert und gewaschen in 1x TE-Puffer. Kleines Bisulfit-Sequenzierung wurde durchgeführt, wie 9,15.
Ebenso hat Embryo Isolation als sehr nützlich erwiesen in Reportergenassays mit niedrigen embryonalen Ausdruck, und wo die mütterliche Samenschale Erkennung verwechselt oder durch Reporter Expression in Geweben um den Embryo (Endosperm, Samenschale) maskiert. Embryos Carr ying das Reporter-Transgen sind gebeizt (ß-Glucuronidase; GUS) oder direkt analysiert (grün oder rot Florescent Protein; GFP, RFP) nach der Isolierung. Ein Beispiel ist in Fig. 5B für Embryonen Expression eines GUS-Reportergen unter der Kontrolle des Promotors MEDEA (p MEA) 10 gegeben. Die Leichtigkeit, mit der relativ viele Embryonen isoliert werden erlaubt auch quantitative Analysen (zB Anzahl von Embryonen in verschiedenen genetischen Hintergründen, Raissig, Grossniklaus et al gefärbt. In Vorbereitung).
Schließlich haben wir erfolgreich angewandt in situ Hybridisierung (FISH) und Immunfärbungstechniken die nukleare Architektur in isolierten Embryonen in Acrylamid-Pads auf Folien eingebettet studieren Fluorescent. Ein Beispiel für FISH mit Sonden gegen die Zentromer Wiederholungen und nucleolar Organisation Regionen in 5C gezeigt.
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Abbildung 1. Ablaufschema des Embryos Isolierungsprozedur Das Protokoll ist in drei Teile gegliedert: 1 - Material Vorbereitung; 2 - Seed Dissektion; 3 - Embryo Isolation..
Abbildung 2. Mikrokapillar Tipps. A. Hochwertige mikrokapillaren Spitzen mit einer glatten Öffnung von etwa 100 um. B. Low-Qualität mikrokapillaren Spitzen mit größerer Öffnung und unregelmäßige Kontur (diese Tipps sind für die zytologische Anwendungen nur akzeptabel). Maßstab: 2 mm.
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Abbildung 3. Einrichten des Embryos Isolierung Mikroskop. A. und B. Screening auf Objektträger unter einem inversen Mikroskop durchgeführt. Die Embryonen werden gesammelt mit einem Glas auf einem Mikromanipulator zur präzisen Steuerung ihrer Lage fixiert Mikrokapillare (siehe auch Fig. 4) verbunden ist und entweder in eine Mikroinjektor (A) oder Standard-Labor-Pipette (B). A. Das Glas Mikrokapillare mit einem hydraulisch gesteuerten verbunden Mikroinjektor (zB Eppendorf Handy Tram Vario) für eine präzise Steuerung während der Embryonalentwicklung Sammlung B. Das Glas mikrokapillaren ist zu einem Standard-P-200 über eine Pipette Gummi flex Rohr befestigt. Embryo Sammlung und Veröffentlichung wird durch Drehen des Rades Kalibrierung der Pipette gesteuert. Cut-End-Pipettenspitzen sind als Anschlüsse verwendet werden und die Übergänge werden mit Parafilm abgedichtet. Der mibasiert auf der Mikromanipulators über Polystyrolblöcke Falcon-Röhrchen und Klebeband fixiert crocapillary.
Abbildung 4. Embryo Isolierungsverfahren. A. A 2-4 Embryo (Pfeil) in die Extrakt (Screening Tröpfchen) identifiziert und durch Fremdkörper (Samenkornfragmente) umgeben ist. B. Die Umgebung Schutt wurde manuell mit einer Nadel entfernt. C. Die Glaskapillare wurde direkt neben dem Embryo (Pfeil) bewegt. D. Der Embryo wurde gesammelt und ist nun innerhalb der Kapillare (Pfeil). E. Mehrere Embryonen in den letzten Tropfen nach Wäschen. Maßstab = 50 um.
F ild 5. Downstream-Anwendungen von Embryo Isolierung A. Genexpressionsanalysen:. PCR-Amplifikation von WOX9, WOX2, WOX8 und ACTIN11 13,14 auf cDNA Bibliotheken (erzeugt wie beschrieben 8) 2-4 Embryonen gewaschen 1x mal (1. Spur) und auf genomische . DNA (2. Spur) B. Reporter Assay: Ein 8-Zellen-Embryo aus Pflanzen, die ap MEA :: GUS Konstrukt wurde auf einem Objektträger in einem Standard GUS-Färbelösung (reproduziert aus Raissig et al, 2011 nach Genehmigung durch die gefärbten isoliert. Plant Cell, ASPB Copyright). C. Fluorescent in situ-Hybridisierung (FISH): ein 8-Zellen-Embryo wurde mit Sonden gegen Zentromer-Wiederholungen (rot) und 45S rDNA Wiederholungen (grün) vor indirekten Immunnachweis 16 hybridisiert. Die zweifarbige FISH Bilder wurden mit der DAPI Gegenfärbung und DIC Bilder (DM6000B Epifluoreszenzmikroskop, Leica, Deutschland) überlagert.
| Anwendung | Isolation Puffer | Ziel-Puffer |
| RNA-Extraktion (z. B. für die Amplifikation und Transkriptom) | 1x Erste-Strand-Puffer (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | RNA-Extraktionspuffer |
| DNA-Extraktion (z. B. für Bisulfit-Sequenzierung) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA Extraktionspuffer oder 1x TE-Puffer |
| GFP-Reporter-Analyse | 1 M Glycin in 0,5 x MS 1 | 1 M Glycin in 0,5 x MS |
| GUS Reporter Analyse | Färbepuffer 2 ohne X-Gluc (Substrat) | Färbepuffer mit X-Gluc (Substrat) |
| FISH & Immunostaining | 100 mM Phosphat-gepufferte Saline (PBS) | aktiviert Acryl: Bisacryl Mix (33:3) auf einem Superfrost Plus-slide-polymerisieren für 30 min |
Tabelle 1. Isolierung und Ziel-Puffer für verschiedene Downstream-Anwendungen. Die Puffer können bestimmten experimentellen Anforderungen angepasst werden. 1 Murashig & Skoog-Medium. 2 zB Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
Wir entwickelten einen Embryo Isolation Protokoll, das eine schnelle, effektive ist, und kann leicht an andere Labors übertragen werden.
Die beschriebenen Geräte besteht hier aus einem inversen Mikroskop, einem Mikromanipulator, Glas-Mikrokapillaren ein vertikaler Faden Abzieher und Mikroinjektor (Abbildung 3A). Das Setup ist ähnlich dem für Einzeltier Zellisolation für Transkriptom-Analysen 17 beschrieben. Wir haben auch erfolgreich mit einem Basis-Setup, wo Glas Mikrokapillaren manuell über einer Flamme wurden gestreckt (und schneiden mit einem Diamant-Klinge) und betätigt über ein Standard-Labor-Pipette (Pipetman P-200) anstelle eines Mikroinjektor (3B) gearbeitet. In diesem Fall wird die Mikrokapillare wurde die Pipette über einen Gummischlauch befestigt. 10 ul filtertips wurden verwendet, um die Verbindungen, die mit Parafilm eingewickelt wurden, um sie luftdicht zu machen. Die Kapillare - gehalten von der Pipettenspitze - wurde auf der micr fixiertomanipulator Arm unter Verwendung von Polystyrol-Blöcke und Tonband (3B). Das grundlegende Setup erwies sich als effiziente und zuverlässige 8. Dennoch war eines der Hauptprobleme der Aufrechterhaltung der luftdichte Verbindungen zwischen der Mikrokapillare und der Pipette, insbesondere bei einem Wechsel der Kapillare. Überprüfen und Einstellen des Drucks in der Kapillare - eine fein abgestimmte Embryo-Entnahme in einem minimalen Volumen sorgen - kann sehr zeitaufwändig sein mit dieser Grundeinstellung. Das verbesserte Setup mit einem hydraulisch gesteuerten Mikromanipulators und einer vertikalen Faden Abzieher ist eine erhebliche Verbesserung und spart Zeit.
Die Fähigkeiten, die für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode erforderlich sind leicht übertragbar. Five Benutzer in unserem Labor erfolgreich gelernt, die Methode in einer relativ kurzen Zeit. Einige Vereinfachungen des Protokolls sind möglich, abhängig von der Benutzer leicht in Manipulation. Zum Beispiel ist es möglich, überspringen Sie die Schritte 2.2.5 und 2.2.6, währendSezieren nur 5 Schoten (statt 15) und die Reinigung der Embryo Umgebung gründlich von Schmutz mit einer Wolfram-Nadel (dieses Verfahren wurde in 8 angelegt). Synchronisation von Saatgut Entwicklung durch Entmannung und verzögerte Bestäubung ist fakultativ, aber empfohlen, die Anzahl der Embryonen im gleichen Entwicklungsstadium zu erhöhen, insbesondere in frühen Stadien. Darüber hinaus können Embryo isoliert beschleunigt, wenn Waschschritte verzichtet werden, z. B. für die zytologische Anwendungen. Weiterhin ist Schieber Silikonisierung (Schritt 1.3.2) nicht notwendig für Anwender schnell, so dass Embryonen, die auf der Glasoberfläche haften nicht im Laufe der Zeit ist ein Problem.
Ob Filterung oder manuelle Reinigung angewendet wird, ist es äußerst wichtig, um zu vermeiden Verschleppung von Gewebedebris die mögliche Kontamination für nachgeschaltete RNA oder DNA-Anwendungen erstellt. Diese Frage wurde kürzlich in einer Transkriptom-Profiling-Studie hob mit einer anderen Methode der Embryo-Isolierung18. Im Gegensatz zum Großteil Embryo Isolation hier beschriebene Protokoll, die Autoren Arabidopsis Embryonen manuell aus einzelnen Samen mit feinen Nadeln, ein langwieriges Verfahren erfordern hervorragende Präparation Fähigkeiten seziert. Dieses Verfahren anscheinend 2 oder mehr Wäschen zu vermeiden carry-over von möglichen Kontamination Zellen aus den umliegenden Samengewebe, eine Situation, wahrscheinlich angetroffen erforderlich, wenn mit dieser Methode aufgrund der geringen Größe der Embryonen, die Schwierigkeiten beim Zugang zu ihnen mit Dissektion Nadeln und die Haftfähigkeit von umgebenden Zellen. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser Verfahren (i) die Verdünnung des Embryonen-extrudierte aus den Samen auf Brech-und die umliegenden Trümmer in einem großen Volumen (500 ul) vor Embryo Sammlung, (ii) die visuelle Selektion von Embryonen ohne Klebstoff verunreinigt Ablagerungen, und (iii) die Verdünnung möglich RNA-Kontamination tritt aus aufgebrochenen Zellen-durch den Waschschritten. Zwar ist es möglich, nur einen Waschschritt, wenn die VerwendungEmbryonen erscheinen sehr sauber und sind in weniger als 5 ul 8 gesammelt, ein zweiter Waschschritt wird empfohlen, insbesondere für Erstanwender, die die Embryonen in mehreren Runden sammeln (dh mit Additiv Volumen) kann. Embryonen sollten in so wenig wie möglich gesammelt Lösung werden, so dass die maximale Verdünnung von Verunreinigungen in jedem Waschschritt. Jede Runde sammeln sollten kurz gehalten werden (innerhalb von 5-10 min), um die Rückforderung bei Freisetzung in die Wäsche Tropfen (mehr Präsenz in der Kapillare neigt dazu, die Recovery Rate zu reduzieren) zu ermöglichen. Weiterhin ist die Übertragung der gesammelten Embryonen in die Extraktionsmittel (nach den Waschschritten) nur um einen Kontakt mit der Öffnung der Mikrokapillare Spitze und nicht Eintauchen der Spitze, wie dies auch übergehen kann Schmutz haftet auf der Wand über Mikrokapillare die Öffnung. Schließlich sollte die Kapillare zwischen jedem neuen Extrakt geändert werden.
Unser Protokoll ermöglicht für mehrere Tiefentream Anwendungen einfach durch Verwendung eines geeigneten Puffers, der Isolierung molekularen Integrität der RNA, DNA, Chromatin, Enzym oder fluoreszierende Reporter zu erhalten. Wir haben erfolgreich Embryonen im RNA-Schutzisolation Puffer zur RNA-Extraktion und Transkriptom-Analysen 8, 1x TE-Puffer für DNA-Methylierung Analysen 9, 100 mM Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für Fische und Immunfärbung (Jaenisch, Grossniklaus und Baroux, unveröffentlicht, Abbildung isoliert 5C) und Färbelösung ohne Substrat für GUS Reporter Assays (19, Abbildung 5B). Die Anwendung am empfindlichsten auf Isolierungsbedingungen / Embryo Qualität ist sicherlich RNA-Extraktion und Amplifikation. Die Menge der extrahierten RNA aus isolierten Embryonen war eher gering. Von ~ 30 Embryonen im 2-4 Zell-Stadium (also 60-120 Zellen insgesamt) schätzten wir einen Betrag von ~ 1 ng Gesamt-RNA sowohl Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) und Qubit (Invitrogen) Messungen. Following RNA Extraktion wurde die RNA-Qualität auf einem Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies) verifiziert. Allerdings ist die geringe Menge an RNA extrahiert nicht immer ausreichend, um eine zuverlässige Profil zu erzeugen. Daher müssen weitere Tests des amplifizierten Materials (cDNA) (z. B. PCR-Nachweis von niedrig ausgedrückt Embryo-spezifischer Gene und / oder ein Bioanalyzer sichtbar) erfolgen.
Schließlich ist die Möglichkeit, Embryonen durch visuelle Kriterien isolieren in unserem Protokoll eine große Bereicherung. Embryonen aus der gleichen Schote (Arabidopsis Frucht) nicht synchron entwickeln. Somit muss Verarbeitung ganzer silique Extrakte (zB für RT-PCR-Analysen oder quantitative Reporter-Assays) nicht erlauben eine perfekte Korrelation mit einem bestimmten Entwicklungsstadium. Isolieren Embryonen zu einem bestimmten Entwicklungsstadium löst dieses Problem. Darüber hinaus präsentiert ein ähnliches Problem bei der Arbeit mit heterozygoten Mutanten wo Schoten enthalten verschiedene Genotypen Embryo. Isolieren Embryonen auf visuellen Kriterien bis distinguish zB Wildtyp-von mutierten Embryo Phänotypen ermöglicht Korrelation Downstream-Analysen mit dem Genotyp. Wir haben dies erfolgreich auf DNA-Methylierung an bestimmten Orten in verschiedenen Genotypen 20 analysieren getan.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir möchten Tal Nawy und Martin Bayer für ihre Beratung auf den Embryo Isolierung danken. MTR, VG, UG und CB entwickelt der Embryo Isolierung Ausrüstung. MTR, VG und CB entwickelt der Embryo Isolation Protokoll. MTR, VG und CB etablierte das Protokoll, die Embryonen isoliert und erzeugten Embryo-cDNA durchgeführt VG die PCR, MTR die GUS-Färbung, JJ die FISH Experimente. MTR, VG, CG und UG schrieb das Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, ein Stipendium der Roche Research Foundation (MTR) und Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds (UG und CB) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
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