Summary
في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا عزل السكان من الخلايا الجذعية البالغة، ووصف الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية أو ASCS، من الأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة عزلة ASCS من lipoaspirates باستخدام دليل، بروتوكول الهضم الأنزيمية باستخدام كولاجيناز.
Abstract
في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، وعزل السكان جديدة من الخلايا الجذعية البالغة من liposuctioned الأنسجة الدهنية التي أسموه في البداية خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. منذ ذلك الحين، تم إعادة تسمية هذه الخلايا الجذعية الخلايا الجذعية الدهنية كما مشتقة أو ASCS وذهبت لتصبح واحدة من خلايا جذعية للبالغين الأكثر شعبية للسكان في مجالات أبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي. وصف الآلاف من المقالات الآن استخدام ASCS في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجدد، بما في ذلك تجديد العظام، وإصلاح الأعصاب الطرفية والهندسة القلب والأوعية الدموية. وقد بدأت المقالات الأخيرة لوصف عدد لا يحصى من الاستخدامات لASCS في العيادة. ويحدد البروتوكول هو موضح في هذه المقالة الإجراء الأساسي لليدويا وإنزيمي عزل ASCS من كميات كبيرة من lipoaspirates تم الحصول عليها من الإجراءات التجميلية. يمكن بسهولة أن تحجيم هذا البروتوكول أعلى أو لأسفل لaccommodأكلت حجم lipoaspirate ويمكن تكييفها لعزل ASCS من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من خلال abdominoplasties وإجراءات أخرى مماثلة.
Introduction
في عام 2001، وقد وصفت مجموعة من السكان المفترضة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من الأنسجة الدهنية في مجلة هندسة الأنسجة 1. أعطيت هذه الخلايا اسم معالجتها Lipoaspirate أو جيش التحرير الشعبى الصينى الخلايا بسبب اشتقاقها من الأنسجة المصنعة lipoaspirate الحصول عليها من خلال الجراحة التجميلية. واستند أسلوب العزل الموضحة في هذه المقالة على الاستراتيجيات القائمة الأنزيمية للعزلة من انسجة الوعائية الكسر (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية 2. تم تعريف صندوق التبرعات الخاص باعتباره الحد الأدنى من السكان معالجة خلايا الدم الحمراء، والخلايا الليفية، الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء، pericytes وقبل الخلايا الشحمية التي لم تنضم إلى ثقافة الركيزة الأنسجة 2، 3. ويقترح زراعة هذا SVF مع مرور الوقت للقضاء على العديد من هؤلاء السكان الخلية تلويث ويؤدي إلى ملتصقة والسكان ليفية. وقد تم تحديد هذه الخلايا الليفية في الأدب على مدى السنوات ال 40 الماضية بأنها مرحلة ما قبلالخلايا الشحمية. ومع ذلك، أظهر فريق بحثنا أن هذه الخلايا تمتلك أرومية متوسطة multipotency وإعادة تسمية السكان SVF ملتصقة باسم خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. وأضافت دراسات لاحقة من قبل العديد من المجموعات البحثية الأخرى لهذه الإمكانات، مما يشير إلى كل من الأديم الباطن وإمكانات الأدمة (للمراجعة انظر 4). منذ ذلك الوقت، ظهرت العديد من الشروط الإضافية لهذه الخلايا في الأدب. من أجل توفير نوع من التوافق في الآراء، اعتمد مصطلح الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة أو ASCS في المؤتمر الثاني IFATS السنوية 2. على هذا النحو، سيتم استخدام ASC المدى في هذه المقالة.
بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة هو إجراء بسيط نسبيا والتي تتطلب معدات المختبرات القياسية ويستخدم الكواشف بسيطة مثل الفوسفات مخزنة المالحة والكواشف وسائل الاعلام زراعة الأنسجة القياسية وكولاجيناز. ويمكن ان تنتج أعداد كبيرة من ASCS اعتمادا على كمية من النسيج الدهني بدءا حجم وج اللاحقةالوقت ulture. ومع ذلك، فإن معالجة مثل هذا المبلغ الكبير من الأنسجة الدهنية يمكن أن تقدم بعض القضايا المادية التي يمكن تخفيفها إلى درجة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول لا تتطلب مرافق زراعة الأنسجة عقيمة واغطية وافق السلامة الأحيائية، مما يجعل من الضروري استخدام مرفق زراعة الأنسجة المعتمدة. يمكن هذا الشرط أيضا خفض فائدة السكان ASC في التطبيقات السريرية ما لم يتم عزل كانوا في الممارسات التصنيعية الجيدة مرافق (GMP) وافق المصممة لعزل وتوسيع المواد للاستخدام السريري. كبديل، فإن النظم الآلية التي يمكن عزل ASCS في نظام مغلق في غرفة العمليات تجنب هذه المسألة الأساسية والسماح للاستخدام الفوري من ASCS دون أي حاجة لاحقة التوسع في المختبر. حتى الآن، هناك ستة النظم الآلية المتوفرة تجاريا لعزل الخلايا من الأنسجة البشرية. هذه الأنظمة قد تجعل من الممكن عزلعدد كبير من ASCS من كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية التالية الحصاد على الفور. ويمكن عندئذ أن يعيد هذه ASCS في جسم المريض لمجموعة متنوعة من الأغراض دون التجدد المريض الاضطرار إلى مغادرة غرفة العمليات. بالإضافة إلى هذا البروتوكول يصف العزلة دليل ASCS، وتعطى بروتوكول لعزل الآلي ASCS باستخدام نظام Celution أيضا في مقال مصاحب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول المعروضة هنا يصف العزلة دليل ASCS من lipoaspirates الحصول عليها من خلال العمليات التجميلية باستخدام الهضم الأنزيمي والتفاضلية الطرد المركزي. تم نشر هذا البروتوكول لأول مرة في مجلة هندسة الأنسجة في عام 2001 1، حيث كانت تسمى الخلايا الناتجة خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى بسبب عزلتهم من lipoaspirates. ومع ذلك، فقد تم استبدال الآن الخلية جيش التحرير الشعبى الصينى الأمد مع الأجل المستمدة الدهنية الخلايا الجذعية أو ASCS لإعطاء المجال نوعا من المطابقة من حيث التسمية. وقد تبين أن الخلايا المعزولة من خلال هذا البروتوكول من قبل العديد من لامتلاك إمكانات أرومية متوسطة سواء في التجارب المختبرية والحية (انظر للمراجعة 4). بالإضافة إلى ذلك، تم أيضا استكشاف الأدمة والأديم الباطن إمكانات ASC 4. تقنية العزل هو بسيط ومباشر ويتطلب ما يقرب من ساعة واحدة لإكمال. الخلية الناتجةيتم تربيتها و في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية. مع مرور الوقت والثقافة، ويصبح السكان ASC أكثر تجانسا، تتألف من خلايا ليفية التي توسع بسهولة وتظهر قابلية جيدة على المدى الطويل في الثقافة.
ملاحظة: يتم سرد القطع التالية من المعدات المطلوبة في نهاية هذه المقالة. ويجب تعقيم جميع الأواني الزجاجية، وسائل الإعلام والكواشف من خلال التعقيم أو تصفيتها من خلال 0.22 ميكرون مرشحات. وينبغي اتباع العقيم تقنيات زراعة الأنسجة في جميع الأوقات. لضمان ذلك، وجميع المواد وضعت في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية يجب تعقيم عن طريق الرش بمحلول الإيثانول 70٪ والمسح مع مناشف ورقية نظيفة.
1. قبل الحصاد، تحضير التالية:
- العقيمة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل lipoaspirates. إعداد حوالي 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X مقابل كل 100 مل من lipoaspirate. الأوتوكلاف برنامج تلفزيوني وجميعآه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. كخيار، ويمكن إضافة المضادات الحيوية / مضاد فطري إلى تركيز النهائي من: 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 2.50 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B مرة واحدة قد بردت في برنامج تلفزيوني.
- العقيمة 0،075-0،1٪ نوع كولاجيناز IA (من نسج كلوستريديوم) لالأنزيمية الهضم من lipoaspirate. سوف تركيز تعتمد على نوعية ومصدر هذه كولاجيناز - أي مقابل الخام المنقى. أنواع كولاجيناز أخرى يمكن استخدامها (على سبيل المثال نوع كولاجيناز الثاني أو الرابع) بتركيزات مماثلة. إعداد في برنامج تلفزيوني 1X وتصفية العقيمة باستخدام نظام الترشيح 1،000 مل مع مرشح 0.22 ميكرون (الشكل 1A). ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام الزجاجات المعقمة مزودة أعلى مرشح زجاجة. إعداد واستخدام في درجة حرارة الغرفة. قد يتم تخزين حلول كولاجيناز على المدى القصير عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. لا تجميد الحل كولاجيناز لأنه قد يقلل من نشاطه.
- العقيمة تحكم متوسط (CM) لتعطيل كولاجيناز وزراعة السكان ASC. ل500 مل من سم، والجمع بين ما يلي: 500 مل DMEM (4.5 غرام / لتر الجلوكوز، مع L-الجلوتامين)، 50 مل مصل بقري جنيني (الحرارة المعطل)، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). كخيار، ويمكن أن يضاف أيضا 5 مل الأمفوتريسين B (250 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B). مطلوب الترشيح العقيمة من هذه الوسائط إذا تم استخدام الكواشف غير معقمة. وضع سم في 37 ° C حمام الماء 30 دقيقة قبل استخدامها لتدفئة المتوسط.
- الأواني الزجاجية وبلستيكور معقمة لعزل. الأوتوكلاف كوب 1،000 مل كوب ويترك ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، لديهم استعداد بلستيكور التالية: ماصات المصلية العقيم (5 مل، 10 مل و 25 مل)، و 50 مل أنابيب الطرد المركزي، والأطباق ثقافة تعامل زراعة الأنسجة.
2. عزل ASCS من Lipoaspirates
يتم جمع معظم lipoaspirates في وعاء الطموح (انظر الشكل 1B) ويمكن أن تتألف من ثلاث طبقات متميزة: 1) الطبقة العليا من النفط نتيجة لتحلل الخلايا الشحمية ناضجة، 2) وطبقة وسطى من الأنسجة الدهنية، و3) القاع، غمير السائلة التي تحتوي على المياه المالحة والملوثة أنواع الخلايا مثل خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). طبقة النفط أعلى قد لا تكون موجودة بكميات كبيرة. إذا كان موجودا، وينبغي أن يستنشق أنها التلوث النفطي للثقافة ASC الناتجة يمكن أن تؤثر على بقاء الثقافة. يجب إزالة غمير السفلي قبل تجهيزها للحد من التلوث من الثقافات ASC مع كرات الدم الحمراء. هذا وسوف يغادر الوسط، طبقة الأنسجة الدهنية، والتي سوف ثم غسلها وهضمها لتحرير الخلوية، جزء الأوعية الدموية في انسجة (صندوق التبرعات الخاص) إنزيمي.
- غسل lipoaspirate: فتح الحاوية lipoaspirate في زراعة الأنسجة حالعود وصب بعناية lipoaspirate الى العقيمة 1 L زجاج الدورق. السماح للطبقات lipoaspirate لفصل حتى يتم فصل طبقة الأنسجة الدهنية بشكل جيد (الشكل 1B).
- نضح قبالة طبقة النفط (إذا كان موجودا) باستخدام معقم، ماصة الزجاج والمالحة غمير السفلي باستخدام 10 مل ماصة المصلية. سيؤدي ذلك إلى إزالة الغالبية العظمى من تلويث خلايا الدم الحمراء والمالحة.
- تقييم حجم طبقة الأنسجة الدهنية الناتجة وإضافة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X في حجم مساو. تحريك نضح مع ماصة تستخدم لطموح من أجل خلط lipoaspirate مع برنامج تلفزيوني. تسمح طبقتين لتسوية. كما ذكر أعلاه، فإن برنامج تلفزيوني 1X يمكن أن تستكمل مع المضادات الحيوية / antimycotics.
- نضح غمير باستخدام 10 مل ماصة المصلية.
- الاستمرار في غسل جزء الأنسجة الدهنية على النحو المبين في الخطوات 2.1.2. و2.1.3. حتى الطبقة الدهنية لديه أصفر / لون الذهب. ال نضحه غمير الماضي مرة واحدة، وترك جزء الأنسجة الدهنية في الدورق الزجاجي. لضمان إزالة كافية من غمير، والسماح للطبقات lipoaspirate لتسوية لمدة 5 دقائق بعد غسل الماضي وقبل تطلع النهائي.
- الأنزيمية الهضم من lipoaspirate: تحضير محلول معقم كولاجيناز 1A على النحو المبين أعلاه في وحدة التصفية. إعداد حجم مساوية لجزء الدهنية وتصفية العقيمة.
- بعد الترشيح من الحل كولاجيناز، تجاهل وحدة تصفية العلوي، صب بعناية الكسر الدهنية غسلها في حل كولاجيناز ويغلق بإحكام الزجاجة.
- وضع خليط كولاجيناز / الدهنية في 37 ° C حمام الماء وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. دوامة بلطف الخليط كولاجيناز / الدهنية كل 5-10 دقيقة ووضع مرة أخرى في حمام مائي. طبقة الأنسجة الدهنية يجب أن تأخذ على "سلاسة" مظهر (الارقام ..ه 1B) أثناء سير عملية الهضم. مرات الهضم إضافية (أي ما يصل الى 2 ساعة) يمكن أن تستخدم إذا كانت طبقة الأنسجة الدهنية لا يزال يبدو أن القطع الصلبة من الدهون داخله.
- عزل ASCS: ضع خليط هضمها كولاجيناز / الدهنية مرة أخرى إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تأكد من تعقيم وحدة التصفية مع الايثانول 70٪ قبل وضعها مرة أخرى في مجلس الوزراء.
- ماصة 25 مل مأخوذة من غمير تحتوي على صندوق التبرعات الخاص في أنابيب معقمة 50 مل الطرد المركزي.
- إضافة 25 مل من CM إلى كل أنبوب. السماح للCM لإبطال نشاط كولاجيناز التي يحتضنها في درجة حرارة الغرفة في مجلس الوزراء لمدة 5 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1،200 x ج لجمع صندوق التبرعات الخاص باعتباره بيليه.
- في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ونضح طاف من كل أنبوب. ضمان أعلى طبقة النفط ويستنشق أي الخلايا الشحمية العائمة مع هذا طاف (
- الجمع بين الكريات صندوق التبرعات الخاص في واحدة باستخدام أنبوب الطرد المركزي 30 مل سم ويقسم بالتساوي على اثنين من جديد 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.3. ونضح supernatants من اثنين من الكريات صندوق التبرعات الخاص (لا يظهر في الشكل).
اختياري: إذا كان المطلوب RBC تحلل، في resuspend كل بيليه صندوق التبرعات الخاص في 10 مل من العازلة تحلل RBC (160 ملي NH 4 الكلورين) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.3. ونضح supernatants لانتاج الكريات صندوق التبرعات الخاص (لا يظهر في الشكل).- الجمع بين اثنين من الكريات صندوق التبرعات الخاص في واحدة أنبوب الطرد المركزي الجديدة باستخدام 5-10 مل سم (الشكل 1B).
- لتصفية جزيئات الأنسجة أكبر، ماصة للصندوق التبرعات الخاص بيليه معلق على مرشح شبكة 100 ميكرون وضعت على رأس من جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي والسماح للتصفية حسب تدفق الجاذبية.
- ماصة مأخوذة من معلق(وتصفيتها) صندوق التبرعات الخاص بيليه الذي يحتوي على ASCS على الأنسجة ثقافة الأطباق ثقافة المعالجة. تكملة كل طبق مع حجم مناسب من CM.
- ثقافة الخلايا في CM لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 دون تغيير من وسائل الإعلام.
- الجمع بين الكريات صندوق التبرعات الخاص في واحدة باستخدام أنبوب الطرد المركزي 30 مل سم ويقسم بالتساوي على اثنين من جديد 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.3. ونضح supernatants من اثنين من الكريات صندوق التبرعات الخاص (لا يظهر في الشكل).
بعد هذه الفترة الثقافة الأولية، وسائل الإعلام والثقافة يمكن أن يستنشق وأي تلويث خلايا الدم الحمراء إزالة بلطف بواسطة الغسيل مع 1XPBS العقيمة. استبدال CM ومواصلة ثقافة ASCS حسب الحاجة. سوف نوع الطبق زراعة الأنسجة المستخدمة وكيف يتم تقسيم صندوق التبرعات الخاص بيليه معلق بين هذه الأطباق تعتمد على عدد الخلايا المطلوب التالية زراعة الأنسجة التقليدية.
3. توصيف للسكان ASC: التدفق الخلوي والتمايز Multilineage
مرة واحدة معزولة، يجب أن يتم تنفيذ توصيف السكان ASC. النهج التقليدي لهذا التدفق الخلوي تشملمترى لتوصيف سطح الخلية الشخصي مستضد CD من الخلايا والتمايز في المختبر للتأكد من قدرتها التمايز multilineage. في حين الأنساب متعددة يمكن تقييمها في ASCS، يحدد هذا البروتوكول تمايز ASCS إلى خلايا مكون الشحم، المكونة للعظم والأنساب مكون للغضروف كوسيلة لتأكيد إمكانات أرومية متوسطة multilineage 5.
في المختبر التمايز المتعدد النسب من ASCS
- التمايز المكونة للعظم من ASCS: قبل الاستقراء، وإعداد المكونة للعظم متوسطة (OM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 25.0 مل من FBS (5.0٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و 10،000 ملغ / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء المكونة للعظم التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: ديكساميثازون (0.1 ميكرومتر النهائي)، L-حمض الاسكوربيك 2 فوسفات (50.0 ميكرومتر النهائي) وβ-جليسروفوسفات (10.0 ملي النهائي).
- قبل الاستقراء، والحصاد لوحة للASCS مثقف في طبق زراعة الأنسجة المطلوب بحيث يتم التوصل إلى confluency ما يقرب من 50٪. لكل طبق التجريبية مطلي، لوحة طبق إضافي لعنصر تحكم غير التي يسببها. الثقافة بين عشية وضحاها في CM.
ملاحظة: ينصح 50٪ confluency من أجل السماح لاستمرار انتشار التي قد تحدث على مدار الاستقراء - في اليوم التعريفي، وإزالة المتوسطة وإضافة ما يلي: OM إلى الآبار التجريبية المكونة للعظم المطلوب وسم إلى آبار المراقبة. فإن حجم الوسائط المستخدمة تعتمد على حجم الطبق زراعة الأنسجة. لمدة 12 الأطباق جيدا، 1.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. لمدة 6 أطباق جيدا، 2.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. ل100 ملم الأطباق، وينبغي أن تستخدم 10.0 مل من وسائل الإعلام في الطبق.
- ثقافة الخلايا مدة لا تقل عن 14 يوما مع التغيرات في المتوسط كل مناسبة 3-4أيام. قد تظهر السكان ASC المكونة للعظم غاية علامات ترسب المعادن خارج الخلية في وقت مبكر من 7 أيام الاستقراء.
- قد يتم تأكيد التمايز المكونة للعظم (أي ترسب المعادن خارج الخلية) باستخدام نسيجية وصمة عار فون كوسا للفوسفات الكالسيوم. وهذا وصمة عار تنتج راسب أسود اللون البني تحديد وجود فوسفات الكالسيوم خارج الخلية (انظر الشكل 2).
وصمة عار مع فون كوسا كاشف:- إزالة OM من الخلايا التجريبية وCM من الخلايا السيطرة
- إصلاح الخلايا لمدة 60 دقيقة في بارافورمالدهيد 4.0٪ أعدت في برنامج تلفزيوني 1X.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- احتضان الخلايا مع نترات الفضة 2.0٪ (المعد في الماء) في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- إزالة نترات الفضة، ويغسل مرتين مع الماء المقطر والهواء الجاف الخلايا.
- تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة لتطوير كالcium راسب الفوسفات.
- غسل الخلايا عدة مرات مع 1XPBS.
- مباين الخلية مع الهيماتوكسيلين اذا شئت.
- قبل الاستقراء، والحصاد لوحة للASCS مثقف في طبق زراعة الأنسجة المطلوب بحيث يتم التوصل إلى confluency ما يقرب من 50٪. لكل طبق التجريبية مطلي، لوحة طبق إضافي لعنصر تحكم غير التي يسببها. الثقافة بين عشية وضحاها في CM.
- التمايز مكون الشحم من ASCS: قبل الاستقراء، وإعداد مكون الشحم المتوسطة (AM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 50.0 مل من FBS (10.0٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و 10،000 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء مكون الشحم التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: ديكساميثازون (1.0 ميكرومتر النهائي)، 3 الاستيوفينون-1-الميثيل (IBMX - 0.5 ملي النهائي)، اندوميثاسين (0.2 ملي النهائي) والانسولين (10.0 ميكرومتر النهائي ).
- قبل الاستقراء، والحصاد لوحة للASCS مثقف في طبق زراعة الأنسجة المطلوب بحيث يتم التوصل إلى confluency ما يقرب من 80٪. لكل طبق التجريبية مطلي، إضافة لوحةطبق القاعدة في عنصر تحكم غير التي يسببها. . التمايز مكون الشحم من ASCS يبدو لتكون أكثر كفاءة مع زيادة confluency: الثقافة بين عشية وضحاها في ملاحظة CM.
- في اليوم التعريفي، وإزالة المتوسطة وإضافة ما يلي: AM إلى الآبار التجريبية المكونة للعظم المطلوب وسم إلى آبار المراقبة. فإن حجم الوسائط المستخدمة تعتمد على حجم الطبق زراعة الأنسجة. لمدة 12 الأطباق جيدا، 1.0.ml من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. لمدة 6 أطباق جيدا، 2.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. ل100 ملم الأطباق، وينبغي أن تستخدم 10.0 مل من وسائل الإعلام في الطبق.
- ثقافة الخلايا مدة لا تقل عن 14 يوما مع التغييرات المناسبة من المتوسطة كل 3-4 أيام. قد تظهر السكان ASC مكون الشحم غاية بوادر تشكيل فجوة الدهون في وقت مبكر من 7 أيام الاستقراء.
- سوف تمر ASCS التمايز مكون الشحم تطوير فجوات الدهون المتعددة التي يمكن تصور بسهولة تحت المجهر الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، قد تمايز مكون الشحموأكد أن استخدام النفط وصمة عار نسيجية الأحمر O التي سوف تتراكم داخل هذه الفجوات (انظر الشكل 2).
وصمة عار مع زيت الأحمر O:- إزالة وسائل الإعلام من الخلايا التجريبية والضابطة واصلاحها لمدة 60 دقيقة باستخدام 10٪ تثبيتي الكالسيوم رسمية. لإعداد هذا تثبيتي، والجمع بين ما يلي: 1.0 غرام من الماء و CaCl 2، 25.0 مل 16٪ بارافورمالدهيد (النهائية 4.0٪) و75.0 مل المقطر.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- غسل الخلايا لفترة وجيزة مع الايثانول 70٪.
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع الحل النفط الأحمر O. لإعداد الحل النفط الأحمر O، حل 2.0 غرام زيت الأحمر O مسحوق في 50.0 مل 70٪ من الإيثانول والأسيتون 50.0 مل.
- غسل الخلايا مع الايثانول 70٪ وبعد ذلك مع مياه الحنفية.
- تصور الخلايا قريبا بعد تلطيخ بسبب يتلاشى من وصمة عار مع مرور الوقت.
- التمايز مكون للغضروف من ASCS: ويتحقق التمايز مكون للغضروف من خلال تقنية ثقافة عالية الكثافة ويشار إلى "ثقافة MICROMASS". قبل الثقافة، وإعداد مكون للغضروف متوسطة (CHM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 5.0 مل من FBS (1٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و10،000 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء مكون للغضروف التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: L-الاسكوربيك-2-الفوسفات (50.0 ميكروغرام / مل النهائي)، الأنسولين (6.25 ميكروغرام / مل النهائي)، ترانسفيرين (6.25 ميكروغرام / مل النهائي) وTGFβ1 (10.0 نانوغرام / مل).
- حصاد ASCS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج لخلايا بيليه. عد الخلايا لتحديد كثافة الخلية تعليق.
- لإعداد الكريات MICROMASS، وإعداد تعليق خلية اثنين: واحد وقف التجريبية في إعداد آلية تبادل المعلومات في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خليةق / مل واحد وقف السيطرة أعد سم في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل.
- وضع 10.0 ميكرولتر "قطرات" لتعليق الخلوية في الآبار الفردية من طبق متعددة جيدا. تسمح الالتزام لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تراكب بلطف قطرات مطلية إما آلية تبادل المعلومات أو سم والحرص على عدم فصل الخلايا.
- ثقافة الخلايا لمدة تصل إلى 14 يوما في آلية تبادل المعلومات أو سم مع التغيرات في المتوسط كل 3-4 أيام. والخلايا المستزرعة في آلية تبادل المعلومات تتكثف أكثر من هذا الوقت لتشكيل MICROMASS بيليه عالية الكثافة مع قليل من دون الخلايا في أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف الخلايا السيطرة مثقف لا الخضوع لهذا التكثيف والعديد من سيتم العثور على أنه أحادي الطبقة.
- لتأكيد تكون الغضروف، وتحديد الكريات لمدة 15 دقيقة في بارافورمالدهيد 4.0٪ (المعد في برنامج تلفزيوني 1X) في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار لوجود البروتيوغليكان مكبرت باستخدام الأزرق نسيجية الألسيان صمة عار.
وصمة عار باستخدام الألسيان الأزرق:- غسل السلطة الفلسطينيةالكريات الثابتة raformaldehyde مرة واحدة في برنامج تلفزيوني 1X.
- احتضان الكريات في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 1.0) لمدة 5 دقائق لخفض درجة الحموضة بهم.
- إزالة حمض الهيدروكلوريك وإضافة 1٪ كاشف الأزرق الألسيان (المعد في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 1.0). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة كاشف الأزرق الألسيان وغسل الكريات مع حمض الهيدروكلوريك 0.1 N (الرقم الهيدروجيني 1.0) لإزالة وصمة عار الزائدة.
- يغسل إضافية باستخدام ماء الصنبور يمكن استخدامها للحد من تلوين الخلفية.
- كبديل، يمكن أن تحصد الكريات MICROMASS ثابتة بين عشية وضحاها في 10٪ من الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين والمقاطع الملون لالألسيان الأزرق.
4. تدفق Cytometric توصيف ASCS
توصيف سطح الخلية الشخصي مستضد CD يمكن تحقيقه من خلال التدفق الخلوي التقليدية.
- إعداد ASCS عن التدفق الخلوي: قبللتحليل، وإعداد التدفق الخلوي العازلة (FCB) تتألف مما يلي: 1.0٪ BSA، 2.0٪ FBS و0.025٪ سابونين أعدت في برنامج تلفزيوني 1X.
- حصاد ASCS وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 1،200 x ج لإنتاج بيليه.
- resuspend الخلايا في العقيمة 1XPBS وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تحديد كثافة الخلية من التعليق.
- تقسيم التعليق يصل الى aliquots من 5 × 10 5 خلايا الكلي وأجهزة الطرد المركزي لبيليه.
- إزالة طاف PBS وإصلاح الخلايا لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مع وجود فائض من الجليد الباردة الايثانول 70٪. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين هذه الخلايا في هذا الايثانول 70٪ في الفريزر -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- بعد التثبيت، نضح بعناية الإيثانول وغسل بلطف بيليه مرتين مع وجود فائض من FCB. لغسل:
- إضافة جود فائض من FCB و resuspend بلطف بيليه.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1،200 x ج لجمع خلاياسا بيليه.
- نضح بعناية طاف FCB.
- تكرار.
- إزالة طاف النهائي غسل FCB من كل قسامة وresuspend في 100 ميكرولتر من FCB. إضافة الأجسام المضادة الأولية المطلوب ملون تألقي مترافق باستخدام اقترح التخفيف الشركة المصنعة. احتضان الخلايا على الجليد مع الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: إذا الأجسام المضادة الأولية تألقي مترافق غير متوفرة، ويمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية غير مترافق. - لكل تألقي المستخدمة (مثل FITC، PE)، واحتضان قسامة من الخلايا مع 100 مل تحتوي على الجماعات الحكومية الدولية FCB مطابقة نمط إسوي كعنصر تحكم السلبية.
- احتضان قسامة واحدة في 100 مل FCB لا تحتوي على الأجسام المضادة كعنصر تحكم إضافية.
- يغسل كل قسامة من الخلايا مرتين مع FCB على النحو المفصل في الخطوة 4.1.5. بعد غسل الماضي، resuspend ومأخوذة في 100 مل من FCB والمضي قدما في تحليل التدفق.
ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية غير مترافق: وبعد هذه الخطوة غسل احتضان مأخوذة على الجليد لمدة 20 دقيقة مع FCB تستكمل مع ملون تألقي مترافق الضد الثانوية المناسبة باستخدام اقترح التخفيف الشركة المصنعة. يغسل مرتين على النحو المبين في الخطوة 4.1.5.
- تدفق تحليل ASCS: لتحليل تدفق، ينبغي أن يحسب الحد الأدنى من 10،000 الأحداث. الضوابط غير ملوثين ومطابقة نمط إسوي ينبغي أن تستخدم لضبط بوابات بواسطة مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). لذلك، فإن عدم وجود ضوابط الأجسام المضادة (أي غير ملوثين) الخطوة 4.1.8 وينبغي أن تستخدم من أجل القضاء على الحطام وASCS القتلى. الضوابط مفتش مطابقة نمط إسوي الخطوة 4.1.7. وينبغي أن تستخدم لإنشاء مناطق مضان إيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مخطط بروتوكول أعلاه يصف، طريقة الأنزيمية دليل للعزلة من صندوق التبرعات الخاص من عينة كبيرة الحجم lipoaspirate. في هذا SVF العديد من سكان الخلية، بما في ذلك ASC. العديد من الدراسات تقترح أن زراعة هذا صندوق التبرعات الخاص في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية سنختار السكان الليفية تمسكا المرجح أن تتكون أساسا من نوع ASC. واتساقا مع ذلك، لقد أظهرنا، وذلك باستخدام التدفق الخلوي والمناعي، أن الكريات صندوق التبرعات الخاص مثقف تصبح خالية أساسا من الخلايا الكبرى تلويث أنواع، وهي كرات الدم الحمراء، وخلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية من النسب 1. السكان ASC الناتجة متجانسة نسبيا في المظهر وتتألف من الخلايا مثل الخلايا الليفية (الشكل 2). هذه ASCS تمسكا تنمو بشكل جيد في ظل ظروف ثقافة زراعة الأنسجة القياسية ويحمل السكان معتدلة مضاعفة الوقت 1 مما يجعلها مناسبة للعديد من الجزيئي والخلوي بدراسات iology في المختبر والدراسات التجدد في الجسم الحي. ومع ذلك، في ضوء طبيعة غير متجانسة من صندوق التبرعات الخاص معزولة، والمصادقة من السكان ASC ضروري. وقد استخدمت العديد من الدراسات التدفق الخلوي من أجل تميز CD الشخصي الأنتيجين من ASCS مثقف كوسيلة محتملة لتحديد هذه الخلايا سواء في المختبر والمجراة 5-9. ويلخص الجدول 1 النتائج من العديد من هذه الدراسات. في حين أن التعبير عن بعض هذه المستضدات CD تزال مثيرة للجدل، ومن المتفق عليه عموما أن ASCS المستزرعة هي CD13، CD29، CD34، CD44، CD49d، CD54، CD90 و CD140a إيجابية. غياب العديد من المستضدات CD المكونة للدم، مثل CD31 CD45 و، ويتسق مع الأصل أرومية متوسطة من ASCS، على الرغم من أن التعبير عن علامات المكونة للدم محددة مثل CD34 لا تزال دون حل في هذا الوقت. في الآونة الأخيرة، وملامح الأنتيجين ASC، على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي، وقد استخدمت لتحديد لsubpop محددةulations 10-12 على أمل إنتاج ASCS مع قدرات التمايز المحسنة.
باعتبارها الوسيلة الأكثر شعبية من التحقق من صحة، في الحث المختبر من السكان ASC باستخدام تعريف الظروف الثقافة في نتائج المفاضلة الخاصة بهم في أرومية متوسطة، الأدمة والأديم الباطن الأنساب (للمراجعة انظر 4) (الشكل 2). في حين أدى في المختبر ثلاثي الجرثومية المحتملة طبقة في استخدام ASCS لمجموعة واسعة من أنظمة نموذج التجديدي، والتمايز إلى المكونة للعظم، مكون الشحم والخلايا المولدة للغضروف كافية عموما لتحديد وتأكيد ASC multipotency لها. في أيدينا، والتمايز مكون الشحم النتائج ASCS في الخلايا التي تحتوي على فجوات الدهون الزاهية التي تستخدم النفط وصمة عار الأحمر O 5. نتائج المفاضلة في الخلايا المكونة للعظم الفوسفاتيز القلوية إيجابية وتراكم البقع المعدنية خارج الخلية التي تستخدم فوسفات الكالسيوم فون كوسا وصمة عار 5.التمايز مكون للغضروف في ظل ظروف MICROMASS عالية الكثافة تنتج الكريات التي تحتوي على البروتيوغليكان مكبرت (الكشف باستخدام صمة عار الألسيان الأزرق) والتعبير عن نوع الكولاجين 2 5. ويمكن رؤية كل من العضلات والهيكل العظمي والعضلات الملساء التمايز مع ASCS تلطيخ لالميوسين العضلات والهيكل العظمي وMyoD1 وأكتين العضلات الملساء 5، 13، 14. ويقترح التمايز في نسب الأدمة من خلال افتراض وجود التشكل مثل الخلايا العصبية التي يسببها بواسطة ASCS والتعبير عن العديد من علامات العصبية، بما في ذلك NeuN، عامل النسخ العصبية 5. أخيرا، تحريض ASCS نحو النسب كبدي / الأديم الباطن على أساس الشروط التي 15 نتيجة في الخلايا التي التعبير ألفا فيتو بروتين، علامة معروفة من خلايا الكبد الكبد. هذه علامات، جنبا إلى جنب مع العديد من الآخرين نشرت على مدى السنوات ال 10 الماضية تشير بقوة إلى أن الرابطة هي المحفزة على السكان الخلية الجذعية التي يمكن الحفاظ بسهولة ونشر في المختبر والتي يسببها نحو خلايا الجرثومية الجنينية الأنساب الثلاثة. إلى جانب لإمكاناتها التجدد في الجسم الحي (للمراجعة انظر 4)، قد يكون ASC إضافة قوية إلى أدوات عالم أبحاث التجدد أو الطبيب.
الشكل 1. دليل والعزلة الأنزيمية من ASCS الإنسان من عينات lipoaspirate. A. التحضير للعزلة: قبل العزلة ينبغي إعداد المكونات التالية: 1) برنامج تلفزيوني 1X (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم)، تعقيمها التعقيم عبر، 2) محلول 0،075-،1٪ نوع كولاجيناز IA، الذي أعد في برنامج تلفزيوني 1X وتعقيمها من خلال الترشيح باستخدام 0.22 ميكرون وحدة التصفية، 3) تحكم متوسط (CM) للثقافة اللاحقة من السكان ASC. B. عزل ASCS: ويرد دليل خطوة بخطوة لعزل من انسجة الوعائية الكسر (صندوق التبرعات الخاص) من lipoaspirates. وتشمل الخطوات غسل lipoaspirate مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X، والهضم باستخدام نوع كولاجيناز IA، وجمع من صندوق التبرعات الخاص بواسطة الطرد المركزي، وصندوق التبرعات الخاص الترشيح. سوف زراعة لاحقة من صندوق التبرعات الخاص يؤدي إلى السكان تمسكا الخلايا الليفية التي تحتوي على السكان ASC. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. متعددة النسب المحتملة التمايز من السكان ASC ملتصقة. الخلايا صندوق التبرعات الخاص مثقف يؤدي إلى السكان متجانسة نسبيا من ملتصقة، ASCS يفية. تحريض السكان ASC تحت ظروف محددة النتائج في خلايا مكون الشحم، المكونة للعظم، مكون للغضروف، والهيكل العظمي والأنساب عضلي عضلي أملس.بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تكون متباينة ASCS في خلايا الأدمة النسب، معربا عن NeuN، علامة من الخلايا العصبية وألفا فيتو بروتين (اف ب) علامة المعمول بها في الأديم الباطن / الكبدي خلية النسب. يتم أخذ بعض الصور والأنسجة مناعي من النتائج المنشورة سابقا 1،5،6،7،8،9. يظهر النسب التمايز، جنبا إلى جنب مع نسيجية، immunohistologic أو وصمة الفلورسنت. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.
| الملف الشخصي التعبير | ||
| التعبير الإيجابي | التعبير السلبي | |
| CD9، CD10، CD13، CD29، CD34، CD44، CD49a، CD49b، CD49d، CD49e، CD51، CD54، CD55، CD59، CD61، CD63، CD71، CD73، CD90، CD105، CD138، CD140a، CD146، CD166، HLA-ABC، المرحاض رائحة-1 | CD11a، CD11b، CD11c و، CD14، CD16، CD18، CD31، CD41a، CD49f، CD45، CD50، CD56، CD62e، CD62L، CD62P، CD104، CD106، CD133، CD144، CD146، HLA-DR، SMA، ABCG2 | |
| النمط الظاهري المقترح ASCS (مشتركة بين اثنين أو أكثر من الدراسات) | CD10، CD13، CD29، CD34، CD44، CD49d، CD54، CD90، CD140a، HLA-ABC، المرحاض رائحة-1 | CD11a، CD11b، CD11c و، CD14، CD31، CD45، CD106، CD144 |
| علامات مثيرة للجدل في ASCS (نتائج الفرق خلال دراسات متعددة) | CD105، CD117، CD140b، CD146، CD166، SMA، HLA-DR | |
| اللحمية معلامات ليرة لبنانية | CD29، CD44، CD73، CD90، CD166 | |
| علامات المكونة للدم | CD31، CD34، CD45، ABCG2 | |
| علامات مشتركة بين 2 أو أكثر الدراسات أظهرت بالخط العريض SMA = أكتين العضلات الملساء HLA = مستضد الكريات البيض البشرية ABCG2 = أدوية المتعددة البروتين الناقل G2 | ||
الجدول 1. ملامح التعبير سطح الخلية من ASCS الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأنسجة الدهنية لعزل ASCS يمكن أن يأتي في أشكال كثيرة: من قطعة صلبة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من خلال استئصال أو رأب الشحم إلى قطع أصغر الحصول عليها عن طريق إما استخراج حقنة أو بمساعدة شفط رأب الشحم (أي شفط الدهون). ما إذا كان المزيد من الخلايا صندوق التبرعات الخاص (وبالتالي ASCS) يمكن الحصول عليها من العينات الدهنية مقطوعة أو يستنشق غير واضح كما تم عرض الدراسات المتضاربة 16، 17. فمن الممكن أن إما شكل الأنسجة الدهنية أكثر من مناسبة لعزل الخلايا صندوق التبرعات الخاص وASCS طالما أن المشغل هو يتقن تقنية عزلتهم. ومع ذلك، وشفط الدهون لا تعقد ميزة على استئصال في هذا هو أقل الغازية ويتطلب أقل بكثير الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية. في حين أن أنواع شفط الدهون قد زادت خلال العقد الماضي، بما في ذلك تقنيات مثل بمساعدة الموجات فوق الصوتية، بمساعدة السلطة وبمساعدة الليزر شفط الدهون 18، لا يزال الأكثر شيوعا شفط الدهون متورم،التي أغرقت مقصورة الدهنية مع كميات كبيرة من المياه المالحة عقيمة، ومواد التخدير وvasoconstrictors قبل التطلع 19. اختيار الأسلوب يمكن أن تختلف من جراح لجراح. ومع ذلك، في حين أن وسائل استخراج قد يبدو غير مهم للباحث، من المهم أن ندرك أن هذه التقنية قد يكون لها تأثير على عدد ASC وقدرتها على البقاء. على سبيل المثال، يمكن زيادة الضغوط فراغ شفط الدهون تؤثر سلبا على العائد الخلية صندوق التبرعات الخاص 20. علاوة على ذلك، انخفاض في انتشار ASC تم قياسها على شفط الدهون بمساعدة الموجات فوق الصوتية 17.
ومع ذلك حصل، ينبغي معالجة نضح أسرع وقت درجات حرارة التخزين قد تؤثر الجدوى صندوق التبرعات الخاص والعائد ASC في نهاية المطاف. وقد أظهرت الدراسات التي ماتسوموتو آخرون أن العائد ASC يقلل إذا تم تخزين نضح في درجة حرارة الغرفة لمدة أطول من 24 ساعة 21. إذا لزم الأمر، والتخزين على مدار 24 ساعة في 4 درجات مئوية ويمكن استخدامها بدون أي تأثير ضارق على الخواص البيولوجية للسكان ASC لكن، مرة أخرى، بقاء الخلية يمكن أن تقلل إذا زادت هذه المرة التخزين أبعد من تلك النقطة. سهولة معالجة lipoaspirate يرتبط مباشرة إلى حجمه الكلي. أحجام أصغر، التي تم الحصول عليها من خلال عمليات استخراج حقنة، من السهل نسبيا لهذه العملية. ومع ذلك، يمكن حرف هاء حجم أكبر، والحصول عليها عن طريق شفط الدهون، تحديات المادية. على سبيل المثال، يمكن لشيء بسيط مثل نقل الدهون من الحاوية طموح بحيث يمكن غسلها عرض المشاكل عندما يكون حجم نضح كبيرة. والمقصود البروتوكول المذكورة في هذه المقالة لتخفيف بعض هذه التحديات.
إلى حد كبير، وعزل السكان ASC من lipoaspirates باستخدام طريقة الأنزيمية الموصوفة في هذه المقالة لم يتغير بشكل ملحوظ على مدى السنوات ال 10 الماضية. وهناك العديد من البروتوكولات متاح من خلال مجلات التي هي ممتازة في وصفها للعزلة ASCS من lipoaspirates. Mمعاهدة الفضاء الخارجي منها الخطوط العريضة لبروتوكول متشابهة جدا مع تعديلات طفيفة. في الأساس، ويتم غسل lipoaspirate من الملوثات، وهضم إنزيمي للافراج عن صندوق التبرعات الخاص وصندوق التبرعات الخاص، التي تحتوي على السكان ASC، يتم جمعها من خلال الطرد المركزي. تصل معظم lipoaspirates الحجم الكبير في نوع من الحاويات فراغ - تكوين التي يمكن أن تختلف من جراح لجراح. هذا البروتوكول توصي إزالة نضح في، دورق معقمة كبيرة قبل الغسيل، لأن الحاوية نفسها قد تكون مصدرا للتلوث إذا لم يتم تنظيفها بشكل صحيح قبل وضعها في غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية. مرة واحدة نقلت وسمح لتسوية عن طريق الجاذبية، فإن نضح فصل إلى ثلاث طبقات: أعلى، طبقة النفط التي تنتج من تحلل من الخلايا الشحمية ناضجة، وطبقة الدهنية المتوسطة والطبقة السفلى من المياه المالحة والملوثة خلايا الدم الحمراء. يجب إزالة طبقة النفط كما لاحظنا أنه قد تكون سامة إلى مزارع الخلايا الناتجة (الملاحظات غير منشورة). أيضا هذا بروتوتوصي العقيد أن غمير من المياه المالحة وكرات الدم الحمراء وإزالتها قبل غسل الأولى من أجل تقليل العدد المحتمل للتلوث كرات الدم الحمراء مرة واحدة في ASCS يتم تربيتها. ومع ذلك، فقد اقترح دراسة أجراها فرانسيس وآخرون أن هذا غمير قد تكون أيضا مصدرا للASCS 22. استخدام 10 مل ماصة المصلية يجعل إزالة هذا غمير سهلة نسبيا. ما تبقى هو طبقة الدهنية التي يمكن بعد غسلها بسهولة باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، أو إذا رغبت في ذلك، على أن تستكمل برنامج تلفزيوني العقيمة بالمضادات الحيوية ومضاد فطري لتقليل فرصة التلوث 23-25. بعد الغسيل، يتم هضم الأنسجة الدهنية إنزيمي باستخدام محلول معقم من نوع كولاجيناز IA. استخدام وحدة الترشيح مثل وحدة ميليبور هو مبين في هذا الفيديو يجمع بين وسيلة مريحة لتصفية جو معقم و مطهر للكولاجيناز في حاوية مغلقة والتي يمكن أن تضاف الأنسجة الدهنية غسلها لاحقة الهضم المياه حمام عند 37 درجة مئوية.
وقد تفاوتت نوع كولاجيناز المستخدمة من مجموعة إلى أخرى مع نوع كولاجيناز IA يبدو أن يكون أكثر انتشارا 1، 24، 25. ومع ذلك، هناك أكثر من 11 أنواع مختلفة من كولاجيناز المتاحة تجاريا، مع كل الانتماءات الهضم لأنسجة معينة. لهضم الأنسجة الدهنية، وشركات مثل سيغما الدريتش يوصي أنواع كولاجيناز الأول والثاني، وكلا النوعين ممثلة تمثيلا جيدا في الأدب اليوم 1، 24-27. في المادة الأصلية، Zuk آخرون استخدام نوع كولاجيناز IA تم الحصول عليها من مصادر الأبقار بتركيز 0.075٪ 1. ومع ذلك، ويتم الحصول على معظم مصادر تجارية من نوع كولاجيناز IA الآن من البكتيريا اللاهوائية المطثية نسج أو E. القولونية المعدلة وراثيا مع C. نسج الجينات. العديد من الشركات تقدم العديد من التحضيرات من نوع كولاجيناز IA، من النفط الخام لتلك التي أعدت من خلال سلفات الأمونيوم هطول الأمطار. اليستخدم بروتوكول الموضحة في هذه المقالة إن الرب إعداد الخام من نوع IA كولاجيناز الذي يحتوي على أنشطة كولاجيناز ليس فقط، ولكن أيضا البروتيني غير محددة، clostripain والأنشطة الأنزيمية زيتية. في حين أن هذه الانزيمات إضافية حاسمة لكفاءة الهضم 28، هناك تلك التي يقدم تقريرا إلى الكثير الكثير تقلب المرتبطة نوع كولاجيناز الخام IA 28 و 29 و زيادة تركيزاتها من كولاجيناز تصل إلى 0.2٪ للحصول على كفاءة الهضم 23. تلك الجماعات باستخدام نوع كولاجيناز الخام IA أيضا يوصي مكملات مع ألبومين المصل البقري (0،1-1،0٪ BSA) من أجل تحسين الأداء الانزيم وزيادة الاستقرار في الخلايا الدهنية داخل المصفوفة. ولكن هذا قد لا يكون ضروريا، كبروتوكول الموضحة في هذه المقالة يستخدم كولاجيناز دون مكملات مع عدم وجود تأثير سلبي على كفاءة الهضم.
بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في استخدام كولاجيناز شركات أكثر تحديداosition، مصادر تجارية تحتوي على كولاجيناز العالية النقاء جنبا إلى جنب مع مزيج دقيق من البروتياز متاحة الآن. هذه الاستعدادات تنقية أنواع كولاجيناز المطثية الأول والثاني لارتفاع النشاط والجمع بينها وبين أنشطة البروتيني محايدة المعروفة، مثل dispase وthermolysin. وقد تم الإبلاغ عن كفاءة الهضم الدهنية باستخدام كولاجيناز وthermolysin بواسطة Zachar آخرون 27. في اتفاق مع هذا العمل، Pilgaard آخرون أيضا 30 تقريرا كفاءة الهضم ممتازة باستخدام مزيج من عدة كولاجيناز وthermolysin. ومع ذلك، فإنها لا تراعي أفضل كفاءة الهضم استخدام مستحضرات من كولاجيناز وdispase.
مرات الهضم لعزل الخلايا من الأنسجة الدهنية يمكن أن تختلف من دراسة إلى دراسة. العديد من البروتوكولات نشرت يوصي مرات الهضم من 1-2 ساعة 27، 30. ومع ذلك، فمن المهم أن ندرك أن الأوقات الهضم المفرطة قد تؤثر في نهاية المطاف على عدد قابلة للحياة ASخدمات العملاء والنمط الظاهري الخلايا الجذعية الخاصة بهم. Pilgaard وزملاؤه قد قرر أن 2 ساعة الهضم عند 37 درجة مئوية يعطي أفضل توازن بين تفارق الأنسجة وظيفة ASC 30، مع Zachar آخرون أن التوصية الهضم، 45 دقيقة الماضية، لوحظ أن كل 15 دقيقة حتى 2 ساعة كحد أقصى، مع الهضم يجري توقف مرة واحدة يأخذ الأنسجة الدهنية على مظهر أكثر تجانسا 27. ونحن نتفق مع هذه التوصية. ومع ذلك، فمن تجربتنا أن معظم نوع كولاجيناز IA الاستعدادات في 0،075-0،1٪ قادرة على هضم كميات كبيرة من lipoaspirates في 30-45 دقيقة وأن هذه الأوقات الكافية لتحرير عدد كاف من الخلايا. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول توصي وقت هضم 30 دقيقة. إذا كان مطلوبا المزيد من الوقت، وينبغي رصد اتساق lipoaspirate وتوقفت عملية الهضم عندما يفترض lipoaspirate على "دسم" أو مظهر "سوبي" (الشكل 1).
مرة واحدة عشره الهضم كاملة، ويتم إنجاز عزل صندوق التبرعات الخاص سراح ببساطة عن طريق استخدام الطرد المركزي. ومع ذلك، مثل الضغط الطموح، والآثار المادية للالطرد المركزي قد يكون لها تأثير على جدوى صندوق التبرعات الخاص وعدد من ASCS المتاحة للثقافة. وقد أظهرت دراسة أجرتها كوريتا وزملاؤه أن 31 بسرعة تزيد عن 3،000 x ج يمكن أن تلحق الضرر ASC. ومع ذلك، ينبغي أن تكون بسرعة كبيرة بما يكفي لضمان التكوير كافية من صندوق التبرعات الخاص. وكقاعدة عامة، فإن معظم البروتوكولات، بما في ذلك هذا واحد، والتوصية سرعة الطرد المركزي من 1،200-1،500 ز س. ينبغي توخي الحذر من قبل الباحث لضمان أن يفهموا العلاقة بين قوة الطرد المركزي (تقاس ز) وسرعات الطرد المركزي (التي تقاس على أنها دورة في الدقيقة)، كما يعتمد على العلاقة الدوار الطرد المركزي محددة. ومع ذلك، كقاعدة عامة، القوى النابذة أقل، مثل 1،200 x ج، غالبا ما تكون أي ما يعادل سرعة الطرد المركزي، ويمكن أن تستخدم بأمان بالتبادل.
بعد الغزل، عدة ديويلاحظ طبقات stinct في أنبوب الطرد المركزي (الشكل 1): أ الطبقة العليا من النفط و "رقيق" الخلايا الشحمية البيضاء، وطبقة المتوسطة وكولاجيناز بيليه الخلية. بيليه نفسه قد يكون طبقتين متميزتين: الطبقة العليا من كرات الدم الحمراء وأقل بيليه SVF الأبيض، الذي يحتوي على ASCS. هذا البروتوكول توصي تطلع حذرا من النفط والخلايا الشحمية، حيث أن النفط قد تكون سامة للخلية ثقافة وثبت أن الخلايا الشحمية قادرة على فقد التمايز مرة أخرى إلى نوع من الخلايا أكثر بدائية 32. ومع ذلك، قد يكون حصاد هذه الخلايا الشحمية في هذه المرحلة اذا شئت. بسبب هذه الملوثات، ويوصي هذا البروتوكول خطوة الغسيل اضافية لضمان إزالتها كافية. هذه الخطوة كما يسمح الباحث إلى الجمع بين الكريات SVF متعددة لسهولة اللاحقة من الترشيح. ومن المرجح أن تكون ضرورية بسبب وجود قطعة كبيرة من المواد متليفة والمجاميع الخلوية التالية الهضم الترشيح. يتم إزالة هذه المواد بسهولةمن خلال بسيطة الترشيح على أساس الجاذبية من خلال 70 أو 100 ميكرون شبكة المرشحات. يمكن أن تؤخذ قسامة من الراشح من أجل حساب عدد الخلايا الأنوية وإذا رغبت في الترشيح المتبقية مطلي لتمسك ASC والتوسع.
على الرغم من المحاولات الحثيثة لإزالة العديد من كرات الدم الحمراء ممكن، وسوف لا يكون إعداد ASC تماما دون تلوث RBC. في مقالنا الأصلي، اقترحنا إزالة هذه كرات الدم الحمراء من خلال إعادة تعليق بيليه في محلول ناقص التوتر من 160 ملي NH 4 CL. غالبية المواد العزلة اللاحقة تحتوي على هذه الخطوة وتنصح باستخدام NH 4 الحلول القائمة على الكلور أو الماء المعقم 22-24، 27، 33، على الرغم من أن الرعاية يجب اتخاذها في حالة استخدام الماء المعقم، لتقليل الوقت تتعرض الخلايا صندوق التبرعات الخاص إلى الحل ناقص التوتر 27. ومع ذلك، هذه الخطوة قد لا يكون ضروريا كما كرات الدم الحمراء هي خلية السكان غير ملتصقة ويسهل إزالتها بعد الثقافة بين عشية وضحاها منالسكان ASC. وعلاوة على ذلك، في حين القصصية في أحسن الأحوال، تظهر هذه كرات الدم الحمراء لتحسين التوسع الأولي من الناتج الخلايا الملتصقة (Zuk والملاحظات غير منشورة). على هذا النحو، يلغي هذا البروتوكول خطوة تحلل RBC ويقترح أن يسمح الثقافات ASC الأولي للتوسع في وجود هذه كرات الدم الحمراء خلال الأيام الأولى 3-4 دون أي تغيير الثقافة المتوسطة. قد يكون السبب وراء هذه الملاحظة بسبب نوع من الإشارات نظير الصماوي من تلويث خلايا الدم أو قد يكون ببساطة نتيجة لتحسين الجدوى مع استبعاد خطوة تحلل RBC. وفي أعقاب ذلك، مستنبت يمكن أن يستنشق وغالبية كرات الدم الحمراء إزالتها عن طريق غسل بلطف مع لوحات العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. مع مرور الوقت، فإن أي كرات الدم الحمراء المتبقية يموت في نهاية المطاف وإزالتها من الثقافة.
وقدرت الدراسات التي Zachar وBoquest أن 25-50٪ من صندوق التبرعات الخاص بيليه معلق تتمسك زراعة الأنسجة البلاستيك 23، 27. الناتج "مرور 0" ASC مكعبltures غير متجانسة، تتكون من خلايا صغيرة مستديرة يعتقد أن ASCS والخلايا على شكل غير منتظم أكثر المقترح أن تكون البطانية في الأصل. في حين أكدت الدراسات من قبل العديد من الجماعات بما في ذلك بلدنا غياب تلويث أنواع الخلايا مثل SMCS، الخلايا المكونة للدم والخلايا الليفية في الثقافات ASC 1، لا يمكن استبعاد وجود أنواع الخلايا إضافية خارج. في الواقع، اتسمت تاللوني آخرون مرور 0 الثقافات، ولاحظ السكان أربعة متميزة: 1) صغيرة، مستديرة، وخلايا تجديد بسرعة، 2) خلايا ليفية المغزل على شكل فكرت أن يكون ASC، 3) تكرار ببطء خلايا كبيرة مع أكثر تقييدا المحتملة (أي ما قبل الخلايا الشحمية-) و 4) الخلايا البطانية مكعبية التي فقدت مع مرور 34. وقد أظهرت دراسات لاحقة أن الجولة، تجديد السريعة في عدد السكان الخلية تمتلك أعلى multipotentiality والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية نموذجي 35 و 36. وعلاوة على ذلك، فإنها قد تشكل "الكروية" نظرا لوغالبا ما تحيط الانتشار السريع وعن طريق الخلايا الليفية المغزل على شكل. على هذا النحو، فمن الممكن أن المغزل على شكل السكان ASC المقترحة أعلاه قد تنشأ من هذه الخلايا. بعد التوسع الأولي من هذه الثقافات مرور 0 ASC، أنه يعتقد أن استمرار زراعة بمرور الوقت يختار لASC، مع الثقافات الناتجة افتراض أكثر يفية، وتكوين متجانسة. ومع ذلك، بقايا الخلايا الملوثة لا يمكن استبعاد تماما من و، وبالتالي، لا يزال ينبغي أن تعتبر السكان ASC غير المتجانسة.
في حين أن البروتوكول هو موضح في هذا المقال واضح ومباشر، وغير مكلفة ولا تحتاج إلى أي قطعة من المعدات التي لا توجد عادة في منشأة زراعة الأنسجة، فإن لديها عيب تتطلب مثل هذا المرفق. وقد حقق العديد من الدراسات والتطبيقات متعدية من ASCS من خلال النماذج الحيوانية وبدأت الدراسات السريرية باستخدام ASC أن يظهر (للمراجعة انظر 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعو هذه المخطوطة هي المخترعين المشارك على براءة اختراع تمتلكها الحكام من جامعة كاليفورنيا ومرخصة لCytori التداوي.
Acknowledgments
الكتاب أود أن تقر وأشكر هؤلاء الأفراد البحوث الإضافية التي ساهمت في تطوير بروتوكول صفها وعزلتها من ASCS، بما في ذلك: الدكتور H. بيتر لورنز، دكتوراه في الطب، الدكتور هيروشي Muzuno، دكتوراه في الطب، الدكتور جيري هوانغ، MD الدكتور آدم كاتز، دكتوراه في الطب، والدكتور وليام Futrell، دكتوراه في الطب، الدكتور رونغ تشانغ، DDS، دكتوراه، والدكتور لاريسا رودريجيز، دكتوراه في الطب، الدكتور زيني ألفونسو، دكتوراه، والدكتور جون فريزر، دكتوراه. وقد مولت النتائج المقدمة، في جزء منه، من خلال المنح البحثية المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، بما في ذلك NIAMS ومعاهد NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M.
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
