Summary
En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.
Abstract
En 2001, investigadores de la Universidad de California, Los Ángeles, describen el aislamiento de una nueva población de células madre adultas de tejido adiposo por liposucción que inicialmente denominan células lipoaspirado procesados o células del EPL. Desde entonces, estas células madre se han renombrado como células o ASC madre derivadas de tejido adiposo y han pasado a convertirse en una de las poblaciones de células madre adultas más populares en el campo de la investigación con células madre y la medicina regenerativa. Miles de artículos ahora describen el uso de ASC en una variedad de modelos animales de regeneración, incluyendo la regeneración del hueso, la reparación del nervio periférico y la ingeniería cardiovasculares. Artículos recientes han comenzado a describir la miríada de usos para las ASC en la clínica. El protocolo se muestra en este artículo se describe el procedimiento básico para la mano y el aislamiento de las ASC enzimáticamente a partir de grandes cantidades de lipoaspirates obtenidos de los procedimientos cosméticos. Este protocolo se puede escalar fácilmente hacia arriba o hacia abajo para accommodcomió el volumen de lipoaspirado y puede ser adaptado para aislar las ASC de tejido graso obtenidos a través de abdominoplastías y otros procedimientos similares.
Introduction
En el año 2001, una población putativo de células madre multipotentes a partir de tejido adiposo se describe en la revista Tissue Engineering 1. Estas células se les dio el nombre de Procesado células lipoaspirado o PLA, debido a su derivación a partir de tejido lipoaspirado procesado obtenidos a través de la cirugía estética. El método de aislamiento se describe en este artículo se basa en las estrategias enzimáticas existentes para el aislamiento de la fracción del estroma vascular (SVF) a partir de tejido adiposo 2. El SVF se ha definido como una población mínimamente procesado de las células rojas de la sangre, fibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos y pre-adipocitos que aún tienen que adherirse a un sustrato de cultivo de tejido 2, 3. Se propone El cultivo de esta SVF con el tiempo para eliminar muchas de estas poblaciones de células contaminantes y resultar en una, población fibroblástica adherente. Estos fibroblastos han sido identificados en la literatura en los últimos 40 años, como se pre-adipocitos. Sin embargo, nuestro grupo de investigación demostró que estas células poseían multipotencialidad mesodérmico y renombraron la población SVF adherente como células del EPL. Estudios posteriores de otros numerosos grupos de investigación se han sumado a este potencial, lo que sugiere tanto endodérmico y potenciales ectodérmicas (para revisión ver 4). Desde entonces, numerosos términos adicionales para estas células han aparecido en la literatura. Con el fin de proporcionar algún tipo de consenso, se adoptó el término células o ASC madre derivadas de tejido adiposo en la II conferencia anual IFATS 2. Como tal, el término ASC se utiliza en este artículo.
El protocolo descrito en este artículo es un procedimiento relativamente simple que requiere un equipo de laboratorio estándar y utiliza reactivos simples tales como solución salina fosfo-tamponada, reactivos estándar de los medios de cultivo de tejidos y la colagenasa. Se puede producir un gran número de ASC en función de la cantidad de volumen de partida tejido adiposo y la subsiguiente Ctiempo ulture. Sin embargo, el procesamiento de una gran cantidad de tejido adiposo como puede presentar algunos problemas físicos que pueden ser mitigados hasta cierto punto el uso de este protocolo. Además, este protocolo no requiere instalaciones de cultivo de tejidos estériles y campanas de bioseguridad aprobados, necesitando por ello el uso de una instalación de cultivo de tejidos aprobado. Este requisito también puede disminuir la utilidad de la población ASC en aplicaciones clínicas a menos que se aislaron en las buenas prácticas de fabricación de instalaciones aprobadas (GMP) diseñados para el aislamiento y la expansión de los materiales para su uso clínico. Como alternativa, los sistemas automatizados que pueden aislar ASC en un sistema cerrado en el quirófano evitaría este tema clave y permitir el uso inmediato de ASC sin ninguna necesidad para la posterior expansión in vitro. Hasta la fecha, hay seis sistemas automatizados que están disponibles comercialmente para el aislamiento de células a partir de tejido humano. Estos sistemas pueden hacer que sea posible aislar unimportante número de ASC de grandes cantidades de tejido adiposo inmediatamente después de su cosecha. Estos ASC podrían ser reintroducidas en el paciente para una variedad de propósitos regenerativos sin el paciente tener que salir de la sala de operaciones. Además de este protocolo que describe el aislamiento manual de los ASC, un protocolo para el aislamiento automatizado de ASC utilizando el Sistema Celution se da también en un artículo complementario.
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Protocol
El protocolo que se muestra aquí describe el aislamiento Manual de ASC de lipoaspirates obtenidos a través de procedimientos cosméticos mediante digestión enzimática y centrifugación diferencial. Este protocolo se publicó por primera vez en la revista Tissue Engineering en 2001 1, en donde las células resultantes se denominan células lipoaspirado procesados o células del EPL a causa de su aislamiento a partir lipoaspirates. Sin embargo, la celda de PLA término ahora ha sido reemplazado por el término células o ASC para dar el campo de una especie de la conformidad en términos de nomenclatura madre derivadas de tejido adiposo. Las células aisladas a través de este protocolo se ha demostrado por muchos que poseen potencial mesodérmico tanto in vitro como in vivo (para revisión ver 4). Además, los ectodérmicas y endodérmicas potenciales de la ASC también se han explorado 4. La técnica de aislamiento es simple y directa y requiere aproximadamente una hora para completar. La célula resultantes se cultivan en condiciones de cultivo de tejidos estándar. Con el tiempo la cultura, la población se vuelve más homogénea ASC, compuesto por células de fibroblasto que se expanden fácilmente y muestran una buena viabilidad en el largo plazo en la cultura.
Nota: Las siguientes piezas de equipo que se requiere se enumeran al final de este artículo. Todos los artículos de vidrio, medios de comunicación y los reactivos deben ser esterilizados mediante autoclave o por filtración a través de 0,22 micras filtros. Asépticas técnicas de cultivo de tejidos se deben seguir en todo momento. Para asegurar esto, todos los materiales colocados en la cabina de bioseguridad deben ser esterilizados por pulverización con una solución de etanol al 70% y limpiar con toallas de papel limpias.
1. Antes de la cosecha, preparar los siguientes:
- Estéril 1X buffer fosfato-salino (PBS) para el lavado de los lipoaspirates. Preparar aproximadamente 1 l de 1x PBS por cada 100 ml de lipoaspirado. Autoclave el PBS y todosow enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Como una opción, antibiótico / antimicótico se puede añadir a una concentración final de: 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2,50 mg / ml de anfotericina B una vez que el PBS se ha enfriado.
- Estéril 0,075-0,1% de colagenasa tipo IA (de Clostridium histolyticum) para la digestión enzimática de la lipoaspirado. Concentración dependerá de la calidad y el origen de la colagenasa - es decir, frente bruto se purificó. Otros tipos de colagenasa se pueden utilizar (por ejemplo, la colagenasa tipo II o IV) en concentraciones similares. Preparar en 1x PBS y filtro estéril utilizando un sistema de filtración de 1.000 ml con un filtro de 0,22 micras (Figura 1A). Sin embargo, también se pueden usar botellas de vidrio estéril equipado con un filtro superior de la botella. Preparar y usar a la temperatura ambiente. Soluciones colagenasa se pueden almacenar en el corto plazo a 4 º C hasta que se necesite. No congelar la solución de colagenasa ya que puede disminuir su actividad.
- Control estéril Medio (CM) para la inactivación de la colagenasa y el cultivo de la población ASC. Para 500 ml de CM, combinar la siguiente: 500 ml de DMEM (glucosa 4,5 g / L, con L-glutamina), suero bovino fetal 50 ml (inactivado por calor), 5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 IU de penicilina, 10.000 g / ml la estreptomicina). Como opción, también se puede añadir 5 ml de anfotericina B (250 mg de anfotericina B / ml). Se requiere filtración estéril de este medio si se utilizan reactivos no estériles. Coloque el CM en un 37 ° C baño de agua 30 minutos antes de usar para calentar el medio.
- Artículos de vidrio estéril y recipientes de plástico para el aislamiento. Autoclave de un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml y dejar enfriar a temperatura ambiente antes del uso. Además, tienen la siguiente plasticware listo: pipetas serológicas aséptica (5 ml, 10 ml y 25 ml), 50 ml tubos de centrífuga, y placas de cultivo de tejidos de cultivo tratadas.
2. Aislamiento de ASC a partir de Lipoaspirates
La mayoría de lipoaspirates se recogen en un recipiente de aspiración (véase Figura 1B) y pueden estar compuestas de tres capas distintas: 1) una capa superior de aceite debido a la lisis de adipocitos maduros, 2) una capa intermedia de tejido adiposo, y 3) un parte inferior, infranadante líquido que contiene solución salina y tipos de células contaminantes tales como las células rojas de la sangre (eritrocitos). La capa de aceite superior puede no estar presente en cantidades significativas. Si está presente, debe ser aspirado como la contaminación del aceite de la cultura ASC resultante podría afectar a la viabilidad del cultivo. El infranadante inferior debe ser removido antes de su procesamiento para minimizar la contaminación de los cultivos de ASC con glóbulos rojos. Esto dejará el medio, la capa de tejido adiposo, que luego se lava y se digirieron enzimáticamente para liberar su fracción celular, del estroma vascular (FVS).
- Lavar el lipoaspirado: Abra el contenedor lipoaspirado en el cultivo de tejidos hood y decantar cuidadosamente el lipoaspirado en un vaso de 1 litro de vidrio estéril. Deje que las capas se separen lipoaspirado hasta la capa de tejido adiposo está bien separado (Figura 1B).
- Aspirar la capa de aceite (si está presente) utilizando una pipeta de vidrio estéril y el infranadante solución salina parte inferior usando una pipeta serológica de 10 ml. Esto eliminará la mayor mayoría de contaminación de las células rojas de la sangre y solución salina.
- Evaluar el volumen de la capa de tejido adiposo resultante y añadir 1x PBS estéril a un volumen igual. Se agita la aspirado con la pipeta usada para la aspiración con el fin de mezclar el lipoaspirado con la PBS. Permita que las dos capas se asienten. Como se señaló anteriormente, el PBS 1x puede ser suplementado con antibióticos / antimicóticos.
- Aspirar el infranadante utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
- Continúe lavando la fracción de tejido adiposo como se indica en los pasos 2.1.2. y 2.1.3. hasta que la capa adiposo tiene un color amarillo / oro. ª Aspirare infranadante por última vez, dejando la fracción de tejido adiposo en el vaso de vidrio. Para asegurar la eliminación adecuada de la infranadante, permiten que las capas lipoaspirado se asienten durante 5 min tras el último lavado y antes de la aspiración final.
- La digestión enzimática de la lipoaspirado: Preparar solución de colagenasa 1A estéril como se describe anteriormente en una unidad de filtro. Preparar un volumen igual a la de la fracción adiposo y filtro estéril.
- Después de la filtración de la solución de colagenasa, desechar la unidad de filtro superior, se vierte cuidadosamente la fracción adiposo lavado en la solución de colagenasa y cerrar herméticamente la botella.
- Coloque la mezcla de colagenasa / adiposo en un 37 ° C baño de agua y digerir a 37 ° C durante 30 min. Agite suavemente la mezcla de colagenasa / adiposo cada 5-10 minutos y colocar de nuevo en el baño de agua. La capa de tejido adiposo debe tomar una apariencia "más suave" (Figure 1B) a medida que avanza la digestión. Tiempos de digestión adicionales (es decir, hasta 2 horas) se pueden utilizar si la capa de tejido adiposo todavía parece tener piezas sólidas de grasa dentro de ella.
- Aislamiento de ASC: Coloque la mezcla de colagenasa / adiposo digerido de nuevo en la cabina de bioseguridad. Asegúrese de esterilizar la unidad de filtro con etanol al 70% antes de poner de nuevo en el armario.
- Transferir 25 ml alícuotas de la infranadante que contiene el SVF en tubos de centrífuga de 50 ml estériles.
- Añadir 25 ml de CM a cada tubo. Permita que el CM para inactivar la colagenasa mediante la incubación a temperatura ambiente en el gabinete durante 5 min.
- Centrifugar durante 10 min a 1200 x g para recoger el SVF como un pellet.
- En la cabina de bioseguridad, aspirar el sobrenadante de cada tubo. Asegúrese de que la capa de aceite superior y todos los adipocitos flotantes se aspiran con este sobrenadante (
- Combine los pellets SVF en un tubo de centrífuga de 30 ml utilizando CM y dividir por igual entre dos nuevos tubos de centrífuga de 50 ml. Se centrifuga como en el paso 2.3.3. y aspirar los sobrenadantes de los dos gránulos de SVF (no mostrados en la figura).
OPCIONAL: Si se desea RBC lisis, resuspender cada pellet SVF en 10 ml de un tampón de lisis de RBC (160 mM NH 4 Cl) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Se centrifuga como en el paso 2.3.3. y aspirar los sobrenadantes para producir los gránulos de SVF (no mostrados en la figura).- Combinar las dos bolitas SVF en un nuevo tubo de centrífuga utilizando 5-10 ml CM (Figura 1B).
- Para filtrar las partículas más grandes de tejido, pipetear el sedimento se resuspendió SVF sobre un filtro de malla de 100 micras colocado en la parte superior de un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y permitir para filtrar por flujo de gravedad.
- Alícuotas de pipeta de la resuspendido(Y filtrado) pellet SVF que contiene las ASC en cultivo de tejidos tratados placas de cultivo. Suplemento cada plato con un volumen adecuado de CM.
- Cultivar las células en CM durante 3-4 días a 37 ° C, 5% de CO 2 sin cambio de medios de comunicación.
- Combine los pellets SVF en un tubo de centrífuga de 30 ml utilizando CM y dividir por igual entre dos nuevos tubos de centrífuga de 50 ml. Se centrifuga como en el paso 2.3.3. y aspirar los sobrenadantes de los dos gránulos de SVF (no mostrados en la figura).
Después de este período de cultivo inicial, el medio de cultivo puede ser aspirado y cualquier contaminación de las células rojas de la sangre quita suavemente por lavado con 1XPBS estériles. Reemplazar con CM y continuar con la cultura de los ASC, según sea necesario. El tipo de placa de cultivo de tejido utilizado y cómo el sedimento se resuspendió SVF se divide entre estos platos dependerá del número de células deseadas siguiente cultivo de tejidos convencional.
3. Caracterización de la Población ASC: Citometría de Flujo y Diferenciación multilinaje
Una vez aislado, se debe realizar la caracterización de la población de ASC. Los enfoques convencionales para esto incluyen cito flujometría para caracterizar el perfil de antígeno de CD superficie celular de las células y en la diferenciación in vitro para confirmar su capacidad de diferenciación multilinaje. Si bien múltiples linajes pueden ser evaluados en ASC, este protocolo describe la diferenciación de las ASC en las células de la adipogénica, osteogénica y linajes condrogénicas como un medio para confirmar los potenciales mesodérmicas multilinaje 5.
In vitro diferenciación multi-linaje de ASC
- La diferenciación osteogénica de ASC: Antes de la inducción, preparar osteogénica Medio (OM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 25,0 ml de FBS (concentración final 5,0%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y concentraciones finales 10 000 mg / ml, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción osteogénica para dar las concentraciones finales indicadas: dexametasona (0,1 mM final), L-ascórbico 2-fosfato (50,0 M finales) Y β-glicerofosfato (10,0 mM final).
- Antes de la inducción, la cosecha y la placa a las ASC cultivadas en la placa de cultivo de tejido deseado de manera que se consigue una confluencia del aproximadamente 50%. Para cada plato experimental plateado, placa una fuente adicional para un control no inducido. Noche a la mañana la cultura en CM.
Nota: 50% de confluencia se recomienda con el fin de permitir la continua proliferación que pueden ocurrir en el transcurso de la inducción - En el día de la inducción, se elimina el medio y agregue la siguiente: OM a los pozos experimentales osteogénicas deseados y CM a los pocillos de control. El volumen de los medios de comunicación utilizados dependerá del tamaño de la placa de cultivo tisular. Para placas de 12 pocillos, 1,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 6 pocillos, 2,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 100 mm, se deben utilizar 10,0 ml de medio por placa.
- Cultivar las células durante un mínimo de 14 días con los cambios del medio apropiado cada 3-4día. Poblaciones ASC altamente osteogénicas pueden mostrar signos de deposición mineral extracelular ya en 7 días de la inducción.
- La diferenciación osteogénica (es decir, la deposición de minerales extracelular) se puede confirmar mediante una tinción histológica von Kossa para el fosfato de calcio. Esta mancha producirá un precipitado negro-marrón identificar la presencia de fosfato de calcio extracelular (véase la Figura 2).
Para la tinción con reactivo de von Kossa:- Retire la OM de las células experimentales y el CM de las células de control
- Fijar las células durante 60 minutos en 4,0% de paraformaldehído preparado en 1x PBS.
- Lave las células dos veces con 1x PBS.
- Se incuban las células con nitrato de plata 2,0% (preparada en agua) en la oscuridad durante 30 min.
- Retire el nitrato de plata, lavar dos veces con agua destilada y secar al aire las células.
- Exponer las células a la luz UV durante 60 min para desarrollar la calprecipitado de fosfato de calcio.
- Se lavan las células varias veces con 1X PBS.
- Contratinción con hematoxilina la célula si se desea.
- Antes de la inducción, la cosecha y la placa a las ASC cultivadas en la placa de cultivo de tejido deseado de manera que se consigue una confluencia del aproximadamente 50%. Para cada plato experimental plateado, placa una fuente adicional para un control no inducido. Noche a la mañana la cultura en CM.
- La diferenciación adipogénica de las ASC: Antes de la inducción, preparar Adipogénico Medio (AM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 50,0 ml de FBS (concentración final 10,0%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y 10.000 g / ml concentración final, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción adipogénicos para dar las concentraciones finales indicadas: dexametasona (1,0 mM final), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX - 0,5 mM final), indometacina (0,2 mM final) e insulina (10,0 M definitiva ).
- Antes de la inducción, la cosecha y la placa de las ASC cultivadas en la placa de cultivo de tejido deseada de manera que se consigue una confluencia de aproximadamente 80%. Para cada plato experimental plateado, placa una adiciónal plato para un control no inducido. . Cultivo de una noche en CM Nota: la diferenciación adipogénica de ASC parece ser más eficiente con el aumento de la confluencia.
- En el día de la inducción, se elimina el medio y agregue la siguiente: AM a los pozos experimentales osteogénicas deseados y CM a los pocillos de control. El volumen de los medios de comunicación utilizados dependerá del tamaño de la placa de cultivo tisular. Para placas de 12 pocillos, 1.0.ml de los medios de comunicación por pocillo es suficiente. Para placas de 6 pocillos, 2,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 100 mm, se deben utilizar 10,0 ml de medio por placa.
- Cultivar las células durante un mínimo de 14 días con los cambios del medio apropiado cada 3-4 días. Poblaciones ASC altamente adipogénicos pueden mostrar signos de formación de vacuolas de lípidos ya en 7 días de la inducción.
- ASC se someten a la diferenciación adipogénica desarrollarán múltiples vacuolas de lípidos que pueden ser fácilmente visualizados al microscopio óptico. Además, la diferenciación adipogénica puedeser confirmado mediante una tinción histológica Oil Red O que se acumulan dentro de estas vacuolas (ver Figura 2).
Para la tinción con Oil Red O:- Retire el papel de las células experimentales y de control y corregirlos durante 60 minutos usando un fijador de calcio formal de 10%. Para preparar este fijador, se combinan los siguientes: agua 1,0 g de CaCl2, 25,0 ml 16% de paraformaldehído (4,0% final) y 75,0 ml de agua destilada.
- Lavar las células dos veces con PBS 1x.
- Se lavan las células brevemente con etanol al 70%.
- Se incuban las células a temperatura ambiente durante 5 min con la solución de Oil Red O. Para preparar la solución de Oil Red O, disolver 2,0 g Oil Red O en polvo en 50,0 ml de 70% de etanol y 50,0 ml de acetona.
- Lavar las células con etanol al 70% y después con agua del grifo.
- Visualice las células pronto después de la tinción debido a la decoloración de la mancha con el tiempo.
- La diferenciación condrogénica de ASC: diferenciación condrogénica se logra a través de una técnica de cultivo de alta densidad se refiere como "cultura micromass". Antes de la cultura, preparar condrogénica Medio (CHM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 5,0 ml de FBS (concentración final 1%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y 10.000 g / concentraciones finales ml, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción condrogénicos para dar las concentraciones finales indicadas: L-ascórbico-2-fosfato (finales 50.0 g / ml), insulina (finales 6,25 g / ml), transferrina (finales 6,25 g / ml) y TGFß1 (10,0 ng / ml).
- Cosecha de las ASC y centrifugar durante 5 min a 1200 xg para sedimentar las células. Contar las células para determinar la densidad de la suspensión celular.
- Para preparar los gránulos micromasa, preparar dos suspensiones de células: una suspensión experimental preparado en CHM a una densidad de 1 x 10 7 célulass / ml y una suspensión de control preparado en CM a una densidad de 1 x 10 7 células / ml.
- Coloque 10,0 mu l "gotitas" de la suspensión celular en pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos. Permitir que se adhieran durante 2-3 horas a 37 ° C.
- Superponer suavemente las gotas plateadas, ya sea con CHM o CM teniendo cuidado de no disociar las células.
- Cultivar las células para un máximo de 14 días en CHM o CM con cambios de medio cada 3-4 días. Las células cultivadas en CHM se condensarán durante este tiempo para formar un sedimento Micromass de alta densidad con poco o no hay células en una monocapa circundante. Control de las células cultivadas no sufrirán esta condensación y muchos se encuentran en forma de monocapa.
- Para confirmar la condrogénesis, fijar las pastillas durante 15 min en 4,0% de paraformaldehído (preparados en 1x PBS) a temperatura ambiente. Teñir la presencia de proteoglicanos sulfatados utilizando un Alcian mancha azul histológico.
Para la tinción con Azul de Alcian:- Lave el papellets de raformaldehyde-fijo, una vez en PBS 1x.
- Incubar los pellets en 0,1 N HCl (pH 1,0) durante 5 minutos para reducir su pH.
- Eliminar el HCl y añadir 1% de reactivo azul de Alcian (preparado en HCl 0,1 N, pH 1,0). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Retire el reactivo azul de Alcian y lavar los gránulos con 0,1 N HCl (pH 1,0) para eliminar el exceso de colorante.
- Lavados adicionales utilizando agua del grifo pueden ser utilizados para reducir la tinción de fondo.
- Como alternativa, los gránulos micromasa pueden ser cosechadas, se fijaron durante la noche en 10% de formalina, incluidos en parafina y las secciones se tiñeron para Alcian Blue.
4. Citometría de flujo Caracterización de ASC
Caracterización del perfil de antígeno CD de superficie celular puede llevarse a cabo a través de citometría de flujo convencional.
- Preparación de la ASC para citometría de flujo: Antespara el análisis, preparar un Citometría de Flujo Buffer (FCB) compuesto de los siguientes: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS y 0,025% de saponina preparado en 1x PBS.
- Cosecha de las ASC y centrifugar las células durante 5 min a 1200 xg para producir un gránulo.
- Resuspender las células en estéril 1XPBS y contar las células usando un hemocitómetro. Determinar la densidad celular de la suspensión.
- Divida la suspensión hasta en alícuotas de 5 x 10 5 células totales y de centrifugación para sedimentar.
- Eliminar el sobrenadante de PBS y fijar las células durante 60 min a -20 ° C con un exceso de 70% de etanol enfriado con hielo. Si es necesario, estas células se pueden almacenar en este 70% de etanol en un congelador de -20 ° C hasta que se necesite.
- Después de la fijación, aspirar cuidadosamente el etanol y lavar suavemente el sedimento dos veces con un exceso de FCB. Para lavar:
- Añadir un exceso de FCB y resuspender suavemente el pellet.
- Centrifugar durante 5 min a 1200 x g para recoger las células de unpellet sa.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante FCB.
- Repita.
- Retire la final sobrenadante de lavado FCB de cada alícuota y resuspender en 100 l de FCB. Añadir el anticuerpo primario conjugado con fluorocromo deseado utilizando dilución sugerido por el fabricante. Se incuban las células en hielo con el anticuerpo durante 30 min.
Nota: si anticuerpos primarios conjugados con fluorocromo no están disponibles, se pueden usar anticuerpos primarios no conjugados. - Para cada fluorocromo utilizado (por ejemplo, FITC, PE), incubar una alícuota de células con 100 FCB ml que contiene IgG isotipo como control negativo.
- Incubar una alícuota en 100 ml de FCB que no contiene anticuerpos como un control adicional.
- Lave cada alícuota de las células dos veces con FCB como se detalla en el paso 4.1.5. Tras el último lavado, resuspender las alícuotas en 100 ml de FCB y proceder con el análisis de flujo.
Nota: Si se utilizaron anticuerpos primarios no conjugados: Después de esta etapa de lavado incubar las partes alícuotas en hielo durante 20 min con FCB suplementado con el anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo usando la dilución apropiada sugerido por el fabricante. Lavar dos veces como se describe en el paso 4.1.5.
- Análisis de las ASC de flujo: Para el análisis de flujo, un mínimo de 10.000 eventos debe ser contado. Controles sin teñir y isotipo se deben utilizar para establecer puertas de dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC). Para esto, los controles de anticuerpos no (es decir, no teñidas) de la etapa 4.1.8 se deben utilizar con el fin de eliminar los desechos y ASC muertos. Los controles de isotipo IgG de paso 4.1.7. debe utilizarse para establecer áreas de fluorescencia positiva.
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Representative Results
El contorno protocolo anterior describe un método manual, enzimática para el aislamiento de un SVF de una gran muestra lipoaspirado volumen. Dentro de este SVF son numerosas poblaciones de células, incluyendo la ASC. Numerosos estudios proponen que el cultivo de esta SVF en condiciones de cultivo de tejidos estándar se seleccione para una población de fibroblastos adherente probable que se compone principalmente del tipo ASC. Consistente con esto, hemos demostrado, usando citometría de flujo e inmunofluorescencia, que pellets de SVF cultivadas se vuelven esencialmente libre de los principales tipos de células contaminantes, es decir, glóbulos rojos, células musculares lisas y células del linaje endotelial 1. La población ASC resultante es relativamente homogéneo en apariencia y formado por células similares a fibroblastos (Figura 2). Estos ASC adherentes crecen bien en cultivo en condiciones de cultivo de tejidos estándar y exhiben una población moderada tiempo de duplicación 1 haciéndolos adecuados para numerosos molecular y celular Bestudios iology in vitro e in vivo estudios regenerativos. Sin embargo, a la luz de la naturaleza heterogénea de la SVF aislado, la validación de la población ASC es necesario. Numerosos estudios han utilizado citometría de flujo con el fin de caracterizar el perfil antigénico de CD de ASC cultivadas como un posible medio de la identificación de estas células tanto in vitro como in vivo 5-9. Tabla 1 resume los resultados de muchos de estos estudios. Si bien la expresión de algunos de estos antígenos CD sigue siendo controvertido, se acuerda generalmente que las ASC cultivadas son CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 y CD140a positivo. La ausencia de numerosos antígenos CD hematopoyéticas, tales como CD31 y CD45, es consistente con el origen mesodérmico de ASC, aunque la expresión de marcadores hematopoyéticos específicos como CD34 sigue sin resolverse en este momento. Recientemente, los perfiles antigénicos de la ASC, como se determina por citometría de flujo, se han utilizado para seleccionar para SUBPOP específicaulations 10-12 con la esperanza de producir ASC con capacidades mejoradas de diferenciación.
A medida que los medios más populares de la validación, en la inducción in vitro de la población ASC utilizando definidas condiciones de cultivo resultados en su diferenciación en mesodérmico, ectodérmicas y endodérmicas linajes (para revisión ver 4) (Figura 2). Si bien in vitro potencial capa de tri-germen se ha traducido en el uso de la ASC para una amplia variedad de sistemas modelo de regeneración, la diferenciación en osteogénico, adipogénico y células condrogénicas es generalmente suficiente para identificar la ASC y confirmar su multipotencia. En nuestras manos, la diferenciación adipogénica de ASC resultados en las células que contienen vacuolas lipídicas brillantes que tiñen utilizando Oil Red O 5. Resultados La diferenciación osteogénica en células de fosfatasa-positivo alcalinas y la acumulación de minerales extracelular que se tiñe usando un fosfato de calcio tinción de von Kossa 5.Diferenciación condrogénica en condiciones micromasa alta densidad produce gránulos que contienen proteoglicanos sulfatados (detectados usando una mancha azul Alcian) y expresan el colágeno tipo 2 5. Tanto el músculo esquelético y la diferenciación del músculo liso se pueden ver con las ASC tinción para la miosina del músculo esquelético y MyoD1 y actina músculo liso 5, 13, 14. La diferenciación en el linaje ectodérmica se sugiere a través de la asunción de una morfología neuronal como por ASC inducidos y la expresión de numerosos marcadores neuronales, incluyendo la de NeuN, un factor de transcripción neuronal 5. Finalmente, la inducción de ASC hacia un linaje hepática / endodérmico basadas en las condiciones establecidas 15 resultados en células que la expresión de alfa-fetoproteína, un marcador bien conocido de los hepatocitos del hígado. Estos marcadores, junto con muchos otros publicados en los últimos 10 años sugiere fuertemente que la ASC es una población de células madre pluripotentes que pueden ser fácilmente mantenido ypropagada in vitro e inducida hacia las células de los tres linajes germinales embrionarias. Junto a su potencial de regeneración in vivo (para una revisión véase 4), el ASC puede ser una poderosa adición a las herramientas de un científico de investigación regenerativa o médico.
Figura 1. Manual de aislamiento, enzimática de ASC humanos a partir de muestras lipoaspirado. A. Preparación para el aislamiento: antes del aislamiento de los siguientes componentes se debe preparar: 1) 1x PBS (sin calcio o magnesio), esterilizada a través de la esterilización en autoclave, 2) una solución de 0,075-0,1% de colagenasa de tipo IA, preparado en 1x PBS y esterilizado a través de la filtración utilizando una unidad de filtro de 0,22 micras, 3) Control Medio (CM) para su posterior cultivo de la población ASC. B. Aislamiento de ASCs: Se muestra una guía paso a paso para el aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) desde lipoaspirates. Pasos incluyen el lavado del lipoaspirado con 1x PBS estéril, la digestión usando colagenasa tipo IA, la recopilación de la SVF mediante centrifugación y filtración SVF. Cultivo subsiguiente del SVF dará lugar a una población de fibroblastos adherente que contiene la población ASC. Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 2. Multi-linaje potencial de diferenciación de la población ASC adherente. Células SVF cultivadas como resultado una población relativamente homogénea de, ASC fibroblásticos adherentes. La inducción de la población ASC en condiciones definidas resultados en las células de la adipogénica, osteogénica, condrogénica, miogénica esquelético y linajes miogénico lisas.Además, ASC también se pueden diferenciar en células del linaje ectodérmica, expresar NeuN, un marcador de neuronas y alfa-fetoproteína (AFP) un marcador establecido de la endodérmico / hepática linaje de células. Algunas imágenes de histología y de inmunofluorescencia se han tomado de los resultados publicados anteriormente 1,5,6,7,8,9. Se muestra el linaje diferenciación, junto con el histológico, inmunohistoquímico o la mancha fluorescente. Haga clic aquí para ver más grande la figura.
| Expresión perfil | ||
| expresión positiva | expresión negativa | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62E, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| propuesto fenotipo de ASC (Común entre dos o más estudios) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| marcadores controvertidos en ASC (Resultados diferenciales en múltiples estudios) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| ce estromalmarcadores ll | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| marcadores hematopoyéticos | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| marcadores en común entre 2 o más estudios mostrados en negrita SMA = actina de músculo liso HLA = antígeno leucocitario humano ABCG2 = a múltiples fármacos proteína transportadora G2 | ||
Tabla 1. Los perfiles de expresión de la superficie celular de las ASC humanos.
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Discussion
El tejido adiposo para el aislamiento de las ASC puede venir en muchas formas: desde piezas sólidas de tejido obtenidas mediante resección o lipoplastia en trozos más pequeños obtenidos a través de cualquiera de extracción jeringa o lipoplastia asistida por succión (es decir, la liposucción). Ya sea que las células más SVF (y por tanto ASC) pueden obtenerse a partir de muestras de tejido adiposo resecados o aspirado es claro como estudios contradictorios se han presentado 16, 17. Es posible que cualquiera de las formas de tejido adiposo es más que adecuado para el aislamiento de células SVF y ASC, siempre y cuando el operador es competente en su técnica de aislamiento. Sin embargo, la liposucción hace mantener una ventaja sobre la resección en que es menos invasiva y requiere mucho menos cuidado postoperatorio. Mientras que los tipos de liposucción han aumentado en la última década, incluyendo técnicas como la asistida por ultrasonido, asistida por el poder y la liposucción asistida por láser 18, el más común sigue siendo la liposucción tumescente,en el que el compartimento adiposo se inunda con grandes cantidades de solución salina estéril, anestésicos y vasoconstrictores antes de por aspiración 19. La elección de la técnica puede variar de cirujano a cirujano. Sin embargo, mientras que los medios de extracción pueden parecer poco importante para el investigador, es importante darse cuenta de que la técnica pueda tener un efecto sobre el número de ASC y viabilidad. Por ejemplo, el aumento de la presión de vacío liposucción puede impactar negativamente en el rendimiento de células SVF 20. Por otra parte, la disminución de la proliferación ASC se han medido en el ultrasonido liposucción asistida 17.
Sin embargo obtenido, el aspirado debe ser procesada más rápidamente las temperaturas de almacenamiento pueden afectar la viabilidad y el rendimiento SVF ASC eventual. Los estudios realizados por Matsumoto et al. Han demostrado que el rendimiento de ASC disminuye si el aspirado se almacena a temperatura ambiente durante más de 24 horas 21. Si es necesario, de almacenamiento de 24 horas a 4 ° C se puede utilizar sin ningún efecto perjudicials sobre las propiedades biológicas de la población ASC pero, de nuevo, la viabilidad celular pueden disminuir si este tiempo de almacenamiento se incrementa más allá de ese punto. La facilidad de procesamiento de lipoaspirado está directamente relacionado con su volumen global. Los volúmenes más pequeños, obtenidos a través de la extracción de la jeringa, son relativamente fáciles de procesar. Sin embargo, los aspirados de mayor volumen, obtenidos a través de la liposucción, se pueden presentar problemas físicos. Por ejemplo, algo tan simple transferencia de la grasa del recipiente de aspiración de manera que puede ser lavado puede presentar problemas cuando el volumen aspirado es grande. El protocolo descrito en este artículo está destinado a aliviar algunos de estos desafíos.
En general, el aislamiento de las poblaciones de la ASC de lipoaspirates utilizando el método enzimático descrito en este artículo no ha cambiado significativamente en los últimos 10 años. Hay numerosos protocolos disponibles a través de PubMed que son excelentes en su descripción del aislamiento de las ASC de lipoaspirates. MOst de ellos delinear un protocolo muy similar, con modificaciones menores. Básicamente, el lipoaspirado se lava de contaminantes, digiere enzimáticamente para liberar el SVF y el SVF, que contiene la población ASC, se recaba a través de centrifugación. La mayoría de los grandes lipoaspirates volumen llegan a algún tipo de contenedor vacío - cuya configuración puede variar de un cirujano a otro. Este protocolo recomienda la eliminación de la aspirado en un vaso de precipitados grande, estéril antes de lavar, ya que el propio recipiente puede ser una fuente de contaminación si no se limpian adecuadamente antes de colocar en la campana de bioseguridad. Una vez transferido y se dejó sedimentar por gravedad, el aspirado se separará en tres capas: una capa superior, el aceite que resulta de la lisis de adipocitos maduros, una capa adiposo media y una capa inferior de solución salina y contaminación de las células rojas de la sangre. La capa de aceite debe ser eliminado como hemos dado cuenta de que puede ser tóxico para los cultivos de células resultantes (observaciones no publicadas). También este protoCol recomienda que el infranadante de solución salina y los glóbulos rojos se retira antes de la primera de lavado con el fin de disminuir el número potencial de contaminación de glóbulos rojos una vez que las ASC se cultivan. Sin embargo, un estudio realizado por Francis et al. Ha sugerido que este infranadante también puede ser una fuente de ASC 22. El uso de una pipeta serológica de 10 ml hace que la eliminación de este infranadante relativamente fácil. Lo que queda es la capa de tejido adiposo que a continuación se puede lavar fácilmente usando PBS estéril, o si se desea, PBS estéril suplementado con antibióticos y antimicóticos para disminuir la posibilidad de contaminación 23-25. Tras el lavado, el tejido adiposo se digiere enzimáticamente usando una solución estéril de colagenasa tipo IA. El uso de una unidad de filtración, tales como la unidad de Millipore se muestra en este vídeo combina un medio conveniente de asépticamente el filtrado de la colagenasa en un recipiente cerrado a la que el tejido adiposo lavado se puede añadir para la posterior digestión-baño de agua a 37 ° C.
El tipo de colagenasa utilizada ha variado de un grupo a otro con colagenasa tipo IA parecía ser la más frecuente 1, 24, 25. Sin embargo, hay más de 11 tipos diferentes de colagenasa comercialmente disponibles, cada uno con afinidades de digestión para tejidos específicos. Para la digestión del tejido adiposo, las compañías tales como Sigma Aldrich recomiendan tipos de colagenasa I y II y ambos tipos están bien representadas en la literatura de hoy 1, 24-27. En su artículo original, Zuk et al. Utilizan colagenasa tipo IA obtenido a partir de fuentes de la especie bovina a una concentración de 0,075% 1. Sin embargo, la mayoría de las fuentes comerciales de colagenasa tipo IA se obtienen a partir de ahora la bacteria anaeróbica Clostridium histolyticum o E. coli modificada genéticamente con C. histolyticum genes. Muchas compañías ofrecen numerosas preparaciones de colagenasa tipo IA, de crudo a las preparadas por precipitación con sulfato de amonio. Laprotocolo descrito en este artículo JoVe utiliza una preparación cruda de tipo IA colagenasa que contiene no sólo las actividades de la colagenasa, pero también de proteasa no específica, clostripaína y actividades enzimáticas trípticos. Si bien estas enzimas adicionales son fundamentales para la eficiencia de digestión 28, que son los que reportan un lote a la variabilidad asociada con colagenasa crudo tipo IA 28, 29 y aumentan sus concentraciones de la colagenasa de hasta 0,2% para obtener una digestión eficiente 23. Esos grupos utilizando colagenasa tipo IA crudo también recomiendan su suplementación con albúmina de suero bovino (0,1-1,0% de BSA) con el fin de mejorar el rendimiento de la enzima y aumentar la estabilidad de las células dentro de la matriz adiposo. Sin embargo, esto puede no ser necesario, como el protocolo descrito en este artículo utiliza colagenasa sin suplementación con ningún efecto adverso sobre la eficiencia de la digestión.
Para aquellos que desean utilizar un borrador colagenasa mayor definidoosición, fuentes comerciales que contienen colagenasa altamente purificada junto con una mezcla exacta de las proteasas están ahora disponibles. Estas preparaciones purifican tipos colagenasa clostridial I y II a la alta actividad y combinarlos con las actividades de la proteasa neutra conocidos, como dispasa y termolisina. La digestión eficiente adiposo usando colagenasa y termolisina ha sido reportado por Zachar et al. 27. De acuerdo con este trabajo, Pilgaard et al. 30 también reportan una excelente eficiencia de la digestión usando varias mezclas de colagenasa y termolisina. Sin embargo, ellos observan una mayor eficiencia de digestión utilizando preparaciones de colagenasa y dispasa.
Tiempos de digestión para el aislamiento de células a partir de tejido adiposo pueden variar de un estudio a otro. Muchos protocolos publicados recomiendan tiempos de digestión de 1-2 horas 27, 30. Sin embargo, es importante darse cuenta de que los tiempos de digestión excesivas pueden afectar en última instancia el número de viables ASCs y su fenotipo de células madre. Pilgaard y sus colegas han determinado que la digestión 2 horas a 37 ° C proporciona el mejor equilibrio entre la disociación del tejido y funcionalidad ASC 30, con Zachar et al. Recomendando que la digestión, más allá de 45 minutos, se observa cada 15 minutos hasta 2 horas máximo, con la digestión de ser detenido una vez que el tejido adiposo adquiere un aspecto más homogéneo 27. Estamos de acuerdo con esta recomendación. Sin embargo, es nuestra experiencia que la mayoría de tipo colagenasa IA preparativos a 0,075 hasta 0,1% son capaces de digerir grandes cantidades de lipoaspirates en 30-45 minutos y que estos tiempos son los adecuados para liberar a un número suficiente de células. Por lo tanto, este protocolo recomienda un tiempo de digestión de 30 min. Si se requiere más tiempo, la consistencia de la lipoaspirado debe controlarse y la digestión se detuvo cuando el lipoaspirado asume un "cremosa" o apariencia "espesa" (Figura 1).
Una vez the digestión es completa, aislamiento de la SVF liberada se lleva a cabo simplemente mediante centrifugación. Sin embargo, como la presión de aspiración, los efectos físicos de la centrifugación pueden tener un efecto sobre la viabilidad de SVF y el número de ASC disponibles para el cultivo. Un estudio realizado por Kurita y cols 31 han demostrado que las velocidades superior a 3.000 xg pueden dañar la ASC. Sin embargo, las velocidades deben ser lo suficientemente importantes como para garantizar la granulación adecuada del SVF. Como regla general, la mayoría de los protocolos, incluido éste, recomiendan una velocidad de centrifugado de 1.200-1.500 x g. Se debe tener cuidado por el investigador para asegurarse de que entienden la relación entre la fuerza centrífuga (medido en g) y la velocidad de centrifugación (medidas como rpm), ya que la relación depende del modelo específico de centrífuga. Sin embargo, como regla general, las fuerzas centrífugas inferiores, tales como 1.200 xg, son a menudo equivale a la velocidad de centrifugación y segura se pueden usar indistintamente.
Después de la hilatura, varios dicapas instinto se observan en el tubo de centrífuga (Figura 1): una capa superior de aceite y "suaves" adipocitos blancos, una capa media de colagenasa y un pellet celular. El sedimento sí mismo puede tener dos capas distintas: una capa superior de los glóbulos rojos y un pellet de SVF blanco inferior, que contiene las ASC. Este protocolo recomienda la aspiración cuidadosa del aceite y adipocitos, ya que el aceite puede ser tóxica para el cultivo celular y los adipocitos se ha demostrado que ser capaz de desdiferenciación de vuelta a un tipo celular más primitivo 32. Sin embargo, estos adipocitos se pueden recoger en este punto si se desea. Debido a estos contaminantes, este protocolo recomienda un paso de lavado extra para asegurar su eliminación adecuada. Este paso también permite al investigador para combinar múltiples bolitas SVF para la posterior facilidad de filtración. La filtración es probable que sea necesario debido a la presencia de grandes piezas de material fibrótico y agregados celulares después de la digestión. Estos materiales son fácilmente removidaspor simple filtración por gravedad a través de 70 o 100 filtros de malla micras. Una alícuota del filtrado se puede tomar con el fin de contar el número de células nucleadas, si se desea, y el filtrado restante chapada a la adhesión ASC y expansión.
A pesar de los intentos diligentes para eliminar la mayor cantidad de glóbulos rojos de lo posible, ninguna preparación ASC será totalmente sin contaminación de la FC. En nuestro artículo original, hemos propuesto la eliminación de estos glóbulos rojos a través de la resuspensión del sedimento en una solución hipotónica de 160 mM NH 4 Cl. La mayoría de los artículos de aislamiento posteriores contienen este paso y recomienda el uso de NH 4 soluciones basadas en Cl o agua estéril 22-24, 27, 33, aunque se debe tener cuidado si se utiliza agua estéril, para reducir al mínimo el tiempo de las células SVF están expuestos a la solución hipotónica 27. Sin embargo, puede no ser necesario este paso como glóbulos rojos son una población de células no adherentes y se pueden quitar fácilmente después de un cultivo de una noche dela población ASC. Además, aunque anecdótica, en el mejor, estos glóbulos rojos parecen mejorar la expansión inicial de las células adherentes resultantes (Zuk, observaciones no publicadas). Como tal, este protocolo elimina la etapa de lisis RBC y propone que los cultivos iniciales ASC les permitirá expandirse en la presencia de estos glóbulos rojos durante los primeros 3-4 días, sin ningún cambio de medio de cultivo. La razón de esta observación puede ser debido a algún tipo de señalización paracrina de contaminación de las células de sangre o puede ser simplemente debido a una mejor viabilidad con la exclusión de la etapa de lisis de glóbulos rojos. Después de esto, el medio de cultivo puede ser aspirado y la mayoría de los glóbulos rojos eliminó lavando suavemente las placas con PBS 1x estéril. Con el tiempo, todos los glóbulos rojos restantes eventualmente morir y ser eliminado de la cultura.
Los estudios realizados por Zachar y Boquest han estimado que el 25-50% de la pastilla SVF resuspendido se adhiere al cultivo de tejidos de plástico 23, 27. El "paso 0" cu ASC resultanteltures son heterogéneos, compuesto de células pequeñas y redondas que se cree que las ASC y las células en forma más irregular propuestos ofrezcan endotelial en origen. Mientras que los estudios por parte de muchos grupos, entre ellos el nuestro han confirmado la ausencia de contaminación de los tipos de células, como las CML, las células hematopoyéticas y los fibroblastos de las culturas del ASC 1, la presencia de otros tipos de células no se puede descartar. . De hecho, Tallone et al ha caracterizado pasaje 0 culturas y observaron cuatro poblaciones distintas: 1) pequeñas, redondas, células que renuevan rápidamente, 2) células de fibroblasto en forma de huso que se cree que la ASC, 3) replicando lentamente células grandes con más restringidos potenciales (es decir, pre-adipocitos) y 4) las células endoteliales cúbicas que se pierden con el paso 34. Estudios posteriores han demostrado que la población de células redondas, renovar rápidamente posee el más alto multipotencialidad y expresar marcadores de células madre típicos 35, 36. Por otra parte, pueden formar "esferoides" debido arápida su proliferación y son a menudo rodeado de fibroblastos fusiformes. Como tal, es posible que la población de ASC en forma de huso propuesta anterior puede originarse a partir de estas células. Después de la expansión inicial de estos pasaje 0 culturas ASC, se cree que el cultivo continuo con el tiempo selecciona para la ASC, con los cultivos resultantes suponiendo una más fibroblástica, composición homogénea. Sin embargo, los restos de células contaminantes no se pueden descartar por completo y, por lo tanto, la población ASC todavía debe ser considerada heterogénea.
Si bien el protocolo descrito en este artículo es sencillo, barato y no requiere ningún piezas de equipo que no se encuentran normalmente en un centro de cultivo de tejidos, tiene la desventaja de requerir una instalación de este tipo. Numerosos estudios han investigado las aplicaciones de traslación de ASC a través de modelos animales y estudios clínicos utilizando la ASC han comenzado a aparecer (para revisión ver 4
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Disclosures
Los autores de este manuscrito son co-inventores de una patente propiedad de la Junta de Regentes de la Universidad de California y licenciado a Cytori Terapéutica.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer y agradecer a aquellos más personal de investigación que han contribuido al desarrollo del protocolo descrito y su aislamiento de la ASC, incluyendo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , el Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodríguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, y el Dr. John Fraser, PhD. Los resultados presentados fueron financiados, en parte, por las becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, incluidos los NIAMS e Institutos NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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