In vivo ^19F MR for Cell Tracking

Summary

Vi beskriver en generel protokol for in vivo-sporing ved hjælp af MRI i en musemodel med ex vivo-mærkede celler. En typisk protokol for celle mærkning, forarbejdning og kvantificering billede erhvervelse er inkluderet.

Abstract

In vivo ^19F MRI tillader kvantitativ cellesporing uden anvendelse af ioniserende stråling. Det er en ikke-invasiv teknik, der kan anvendes til mennesker. Her beskriver vi en generel protokol for celle mærkning, billedbehandling og billedbehandling. Teknikken er anvendelig til forskellige celletyper og dyremodeller, selv om vi her at fokusere på en typisk musemodel til sporing murine immunceller. De vigtigste emner for celle mærkning er beskrevet, da disse er relevante for alle modeller. Tilsvarende er de vigtigste imaging-parametre er anført, skønt detaljerne vil variere afhængigt af MRI-system og den enkelte installation. Endelig har vi medtage et billede behandling protokol for kvantificering. Variationer for dette, og andre dele af protokollen, vurderes i diskussionen afsnit. Baseret på den detaljerede procedure der er beskrevet her, vil brugeren nødt til at tilpasse protokol for hver specifik celletype, celle etiket dyremodel, og billedbehandling setup. Bemærk, at protokol kan også tilpasses til humant brug, så længe kliniske begrænsninger overholdes.

Introduction

In vivo celle tracking er afgørende for optimering og overvågning af cellulære terapi ^1. På grund af sin noninvasive natur, billedbehandling byder på fremragende muligheder for at overvåge celler in vivo. Magnetic Resonance Imaging (MRI) er uafhængig af ioniserende stråling og tillader en overlegen billedbehandling opløsning og iboende bløde væv kontrast. MRI-baserede celle sporing er allerede blevet anvendt klinisk til at følge dendritiske celler i melanom patienter ^2. Konventionel klinisk MRI udføres på ^1H kerne, til stede i mobile vand i væv. Det er også muligt at udføre MRI på andre aktive kerner, såsom ^{13C, 19F} og ^23. Na. Imidlertid har kun ¹⁹ F MRI blevet anvendt med succes til at in vivo-sporing, da det giver den højeste følsomhed efter ^1. H. Fraværet af MRI-påviselige endogene ^19F i væv tillader højt signal selektivitet forpåvisning af exogene ¹⁹ F kontrastmidler og tillader kvantificering af fluor direkte fra billeddataene. For en detaljeret diskussion om ^19F MR, se ^3-5. Et centralt problem med ^19F MR er behovet for at udvikle og optimere egnede ^19F celle etiketter, selv om der er udviklet flere etiketter, med en tendens til multimodale agenter ^6.

Protokollen vi beskriver her, er baseret på undersøgelser af vores grupper ^7-9, herunder de første artikler, der er beskrevet i vivo kvantitativ ^19F MRI-baserede celle sporing ^10,11. Den generelle procedure for cellesporing hjælp ^19F MRI er opsummeret i figur 1.. Vi beskriver en generel protokol for mærkning og billeddannelse af dendritiske celler (DCS) ved hjælp af en skræddersyet perfluorcarbon kontrastmiddel ^8. De billeddannende protokollen er generelt anvendelig til forskellige celletyper, etiketter og dyremodeller. Dencelletype og dyremodel beskrevet her bør kun tages som et eksempel, og derfor har vi ikke give oplysninger om celleisolering og mærkning, men snarere fokusere på imaging-protokollen. Modifikationer vil være nødvendigt for hver etiket, celletype dyremodel og billedbehandling opsætning, og disse kan findes i litteraturen eller kan skal optimeres af forskere. Nogle almindelige ændringer er medtaget i diskussionen.

Protocol

Bemærk: Alle eksperimenter og forsøg med dyr skal udføres i overensstemmelse med de relevante etiske retningslinjer og i overensstemmelse med standard dyrepleje og humane krav.

1.. Cellemærkning (Standard Protocol med coinkubering)

1. Tilføj ^19F etiket ⁸ til umodne DC'er i en koncentration på 4 mg/10 ^6-celler (i 2 ml medium). Sving forsigtigt for at blande.
2. Inkuberes cellerne med etiketten til 3 dage før modning og høst af udviklingslandene.
3. Saml udviklingslandene og fjerne overskydende etiket ved vask mindst 3x i PBS. Tæl cellerne.
4. Resuspender i et lille volumen PBS til injektion eller yderligere test.

Bemærk: Denne protokol er relevant for disse specifikke udviklingslandene og etiket. Proceduren blev optimeret i en anden publikation ⁸ og medtaget her er kun de skridt til at forberede en prøve af billedet, da fokus i denne protokol er på billeddannelse. Hning, vil protokollen for isolation, kulturforskelle og mærkning af en specifik celletype enten skal findes i litteraturen eller optimeret af forskeren. Et resumé af alle øvrige ¹⁹ F etiketter, der har været anvendt i litteraturen præsenteres andetsteds ^6.

2. Bestemmelse af ^19F / celle ved hjælp af ^19F NMR

1. Anbring et kendt antal af mærkede celler (typisk mere end 0,5 x 10 ^6, eller et tal, der resulterer i tilstrækkelig signal) i et NMR-rør.
2. Der tilsættes 10 pi 5% trifluoreddikesyre (TFA). Hvis resonansfrekvensen TFA er uegnet på grund af overlapning med etiketten, benytte en alternativ opløselig forbindelse, fortrinsvis med en enkelt ^19F resonans.
3. Anbring prøven i et NMR-spektrometer og få ^19F spektrum. Sikre, at båndbredden er tilstrækkelig til både TFA (reference) og midlet.

Bemærk: TR skal være lang nok til full lempelse af referencen og prøven spins (ca. 5 gange T ₁ afslapning tid på det længste T ₁ komponent i røret, typisk TR ~ 5-8 sek). Nogle spektrometre kræver _D2O til en frekvens lås signal. En standard ¹⁹ F spektrum er tilstrækkelig. Omfattende gennemsnitsperioder eller højere celletal vil være påkrævet, hvis celle optagelse af etiketten er dårlig, eller hvis celle tal er lave. Spektret skal centreres mellem reference og de relevante label toppe, medmindre der foretages korrektioner til regnskab for delvis excitation.

4. Beregn de relative arealer under toppene af referencen og prøven (eller den vigtigste toppen af prøven), og derefter beregne det gennemsnitlige antal ¹⁹ F'er / celle i prøven.

Bemærk: Hele processen skal gentages, og i gennemsnit udstrakt nok til at nå statistisk signifikans. Dette kan også gøres ved hjælp af spektroskopi direkte på MR-scanneren. However Bemærk, at denne procedure afslører kun den gennemsnitlige ^19F belastning for et stort antal celler, ikke variabilitet mellem cellerne. Kontrol ensartethed celleoptagelse kræver tilstedeværelsen af en fluorescerende komponent på ¹⁹ F middel, således at celleoptagelse kan analyseres ved hjælp af mikroskopi eller flowcytometri.

3. Overvejelser for Experimental Design - Cell Injection

På grund af at det er nødvendigt for en vellykket den relativt dårlige følsomhed ^19F MRI til cellesporing, en dyremodel, hvor cellerne vil lokalisere i store antal in vivo-billeddannelse. Typiske følsomhedsværdier spænder fra 1,000-100,000 cells/voxel/1 hr scan tid ^6, med en celle belastning i intervallet 10 ¹¹ -10 ¹³ fluoratomer.

Antallet og hyppigheden af ​​billeddiagnostiske sessioner skal planlægges omhyggeligt, da det har betydning for valg af bedøvelsesmiddel. Bemærk, at isofluran kan ikke være suitable for ^19F MRI hvis ^19F resonansfrekvens er isofluran tæt op mærkningsforbindelsen anvendes. isofluran kan stadig være egnet, hvis de billeddannende sessioner er korte nok til at forhindre betydelig oprustning. Flere alternative anæstetika er blevet anvendt i litteraturen ^10,11, et eksempel er inkluderet i billeddannelse protokollen. Kan være nødvendigt at blive optimeret til forskellige musestammer og sygdomsmodeller anæstetika.

4.. Design af en ekstern ^19F reference

1. Brug en ekstern reference, der indeholder en kendt mængde ^19F signal til kvantificering ^12. Vælg det signal intensitet af henvisningen til at være nogenlunde sammenlignelig med den, der forventes fra motivet.

Bemærk: Generelt er det enkleste, hvis referenceforbindelsen er den samme som den celle etiket, der passer til afslapning parametre. Hvis der anvendes spektroskopiske sekvenser eller sekvenser uden rumlig lokalisering, så acompound med en anden kemisk skift kan være nødvendig.

2. Rediger placering, størrelse og form af henvisningen som nødvendigt, afhængig af regionen af ​​interesse (ROI). Bemærk: Det er generelt nemmest at bruge rør med et ensartet tværsnit for referencen.

5.. Billedbehandling og mus Forberedelse

1. Fortyndes kommercielt tilgængelige ketamin og xylazin 01:10 v / v med fysiologisk saltvand til opnåelse af stamopløsninger af 10 mg / ml ketamin og 2 mg / ml xylazin.
2. Tænd for varmeanlægget i scanneren (typisk varm luft) for at sikre boringen vil være varm, før musen er afbildet.
3. Injicer 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin intraperitoneal at indlede anæstesi. Bemærk: Disse doser er blevet testet for CD1 (ICR) og NU-Foxn1 ^nu 8 uger gamle hanmus. Andre stammer muligvis lidt forskellige doser, der skal optimeres i et separat eksperiment. Denne dosis vil holde musen bedøvet for enBout 45 min. Bemærk: Den anæstesidybden normalt er tilstrækkeligt, hvis dyret viser ingen reaktion på en fod knivspids.
4. Når bedøvet, dyret i et dyr, vugge og immobilisere at forhindre bevægelse under MRI. Hvis det er nødvendigt, skal du placere den eksterne reference ved siden af ​​dyret. Både referencen og ROI (forventet placering af injicerede celler), skal være i midten af ​​spolen. Dyret skal tilsluttes temperatur og vejrtrækning kontrol for fysiologisk overvågning under scanningen.
5. Dæk øjnene af mus med sterile øje salve for at forhindre udtørring under lange billeddiagnostiske sessioner.
6. Hvis imaging overstiger 40 min, forberede yderligere katetre til injektion af yderligere ketamin / xylazin, før dyret kan vågne op. Position to separate subkutane katetre med de arbejdende opløsninger af ketamin og xylazin. Brug dette kateter til at give mus en yderligere 2,5 mg ketamin hver 20 minutter efter de første 40 min. Hvis det er nødvendigt, yderligere at forlænge bedøvelse ved indsprøjtning af yderligere 0,5 mg xylazin gennem kateteret, 100 min efter den første injektion. I alle tilfælde bør eksperimenterende tid ikke overstige 3 timer, undtagen eventuelt under terminal anæstesi.
7. Kontroller, at musen opvarmes direkte efter den første injektion og holdes ved 37 ° C kropstemperatur. Med denne protokol, <80% blodets iltning blev opdaget under atmosfære luft vejrtrækning. For at forhindre bivirkninger fra den sænkede blodets iltning, skal du bruge 100% oxygen (0,3 L / min). Kropstemperatur og vejrtrækning, kontrolleres gennem hele eksperimentet, og indtil fuld tilbagebetaling af dyret. Bemærk, at den spontane vejrtrækning under ketamin / xylazin er meget høj (200-250/min). Uregelmæssigheder i vejrtrækning, snarere end vejrtrækning, kan indikere, at en højere dosis er nødvendig for at opretholde en passende tilstand af anæstesi. Musen vil vække spontant inden 20-30 min after den sidste dosis af bedøvelsesmiddel.

Bemærk: celle tracking, er det nødvendigt at billedet det samme dyr mere end én gang. I så fald bør de billeddannende sessioner blive planlagt under hensyntagen til den nødvendige tid til clearance af anæstesi fra systemet og brug af dyr retningslinjer for instituttet.

6.. Imaging

¹ H justeringer og billeddannelse

1. Placer dyret inde i scanneren, så ROI er i isocenter ved hjælp af en lav opløsning, anatomiske scanning med forskellige skive orienteringer (en localizer).
2. Brug den regelmæssige mellemlægseffekt protokol om ^1H, fx en global shim på hele volumen inde i spolen.
3. Juster reference puls gevinst (RG), dvs senderen målt i dB for en 1 msek Hermite 90 ° RF puls, ved hjælp af justering scanning, der af sælger.

Bemærk: Denne indstilling vilvariere med den type af RF-spolen og er afgørende for ^19F MRI da signalet på ^19F frekvens regel er for lavt til direkte justeringer. Som følge heraf må et estimat af RG ske fra målinger på ^1H-signal. For RF-transmission med en overfladespole, bør ^1H RG justeres til et plan parallelt med spolen gennem den del af interesse for en mængde spole med homogen B ₁ profil, de nøjagtige indstillinger af justeringen er mindre vigtig.

4. Følgende protokol af ^19F henvisning puls gain justering fungerer kun, hvis både ¹ H og ¹⁹ F RF transmission udføres med det samme (enkelt eller dobbelt-tunet) RF-spole. Til en sådan billeddannelse system bør spolen profil (B ₁ sende field) på ^1H være proportional med den ^19F spole profil, når en fast RG anvendes, dvs B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} med en proportionality konstant C.
   1. At bekræfte, at coil profiler er proportionale for en bestemt opsætning, erhverve en ¹ H og en ^19F flipvinkel kort (se følgende afsnit om B ₁ korrektion) på et rør med stærkt koncentreret ^19F, fx TFA i vand (1:1 v / v) under anvendelse af identiske felter-of-view (FOVs) på forhånd (figur 3).
   2. Ved hjælp af samme RG kontrollere, at begge kort er ens, bortset fra global faktor C.
   3. Når ^1H RG er bestemt, notere dette tal ned.
5. Foretag en konventionel ^1H MR-scanning som en anatomisk reference for ^19F billeddannelse. Tune systemet til ^19F hyppigheden af cellemarkøren og udføre en ^19F MR-scanning. Ideelt ^19F MR-scanning vil have samme field-of-view og skive udvælgelse som ^1H MRI, selv om der normalt med lavere opløsning. Dyret kan blive genoplivet, så snart fantasing er færdig. Billedbehandling kan derefter udføres offline.
6. Bestem ^19F RG via relationen dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Vurdere ^19F agent frekvens i et særskilt in vitro eksperiment.

Note: In vivo kan den nøjagtige frekvens variere lidt fra eksperiment til eksperiment på grund af forskellige mellemlæg forhold. For at forhindre kemisk skift artefakter den nøjagtige frekvens bør derfor fastsættes i hvert enkelt eksperiment ved ^19F MRS, hvis muligt. En typisk scanning for meget lavt ^19F signal ville være globale (puls-erhverve) spektroskopi (TR = 200 ms, NEX = 3.000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX således TA, kan reduceres drastisk for høj ^19F signal. Den ^19F agent frekvens bestemmes ud fra spektret efter Fourier transformation og korrektion fase. NEX refererer til antallet af excitationer, TA erhvervelse tid og BW erbåndbredde.

Bemærk: Typiske imaging parametre ⁹ på en 11.7T/16 cm dedikeret dyr scanner er: En anatomisk ^1H billedbehandling scanning med en turbo spin-ekko (TSE) sekvens med TR / effektiv ekko-tid (TE _EFF) = 2.200 msec/42.8 msek 8 ekkoer pr excitation, NEX = 2, 10 på hinanden følgende, 1 mm tykke skiver, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, 128 x 128 matrix, dvs en opløsning på 150 x 150 x 1.000 mM ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz og en lineær fase kodningsskema. ^19F billeder blev erhvervet med det samme sekvens og matchende geometri, men ved lavere in-plane opløsning og lavere BW (NEX = 256, 48 x 48 matrix, dvs en opløsning på 400 x 400 x 1000 um ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ korrektion
   Ved hjælp af en RF-spole med inhomogent B ₁ profil, fx en overflade spole, kan hæmme kvantificering af ¹⁹ F-data, da signalet afhængerikke kun på ^19F koncentration, men også af afstanden fra spolen. Erhverve en B ₁ kort ^1H kanal for at efterfølgende korrekte ^19F data. Dette kræver, at ¹ H og ¹⁹ F coil profiler er ens, bortset proportionalitetsfaktoren C, og at der er tilstrækkelig ^1H baggrund signal tilvejebringes i regioner i ¹⁹ F. Et eksempel protokol for korrektion af en ^19F spin-ekko sekvens præsenteres ved hjælp af en enkelt tunet Tx / Rx overfladespole tunable til både ¹ H og ¹⁹ F og med proportional B ₁ profiler ^13.
   1. Anskaf en ^1H flip kort vinkel med to flipvinkel metode ^14. Anskaf en gradient ekko scanning med meget lang TR (> 3 gange ¹ HT ₁₎ med en anslået flipvinkel på lige under 90 °. Luk til spolen. Anskaf en anden gradient ekko scanning med en RG = dB _1H -6, hvilket er dobbelt flipvinkel på den første scanning.
   2. Beregn ^1H flipvinkel, α, ved voxel (x, y, z) via signalintensiteter (SI) af den første og anden gradient ekko scanninger: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^{14.. 19} F flipvinkel er identisk (bortset fra faktoren 1 / C) på grund af proportionale B ₁ profiler. Ifølge Faradays gensidighedsprincippet ¹⁵ dæmpningen af ^19F signalintensiteten fra en spin-ekko-sekvens (excitation flipvinkel α refokusering flipvinkel 2α) under signalmodtagelse er that _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). Dæmpningen skyldes ufuldkomne eksitation that _Tx (x, y, z) ~ sin ³ (α (x, y, z)) ^16. Den samlede dæmpning skrives som ATT = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Bemærk, at det er normaliseret til 1 i tilfælde af perfekt 90 ° / 180 ° excitation / refokusering flipvinkel. B ₁ korrigeret19 F-billede signalintensiteter SI _{19F corr} beregnes via SI _{19F corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / that (x, y, z).
   3. For at kunne sammenligne signalintensiteter fra forskellige eksperimenter, placeres en reference rør med definerede ^19F koncentration i synsfeltet, og normalisere SI _{19F corr} til den gennemsnitlige signal i referencen.

Bemærk: Andet ¹ HB ₁ / flipvinkel kortlægning metoder kan anvendes og forskellige ^19F pulssekvenser kræver ændringer af att _{Tx, 19F.} Enhver form for B1 korrektion ordning vil indføre yderligere fejl i cellen kvantificering procedure. Hvis nøjagtig celle kvantificering er den vigtigste forudsætning, kan en RF spole med homogen B1 profil bruges til at omgå denne del af protokollen.

7.. Image Processing

1. Gør ^1H og ^19F overlay images
   1. Eksporter billeddatafor den endelige ^1H og ^19F størrelsesorden billeder fra scanneren.
   2. Åbn filerne i et billedbehandlingsprogram såsom ImageJ (freeware, NIH).
   3. Udføre billed de nødvendige justeringer (beskæring, lysstyrke, kontrast) idet de tilpasninger de samme for alle billeder. De ¹⁹ F billeder vil typisk behov for at blive opskaleret til en højere opløsning, der passer til de tilsvarende ¹ H billeder.
   4. Render de ¹⁹ F billeder i falske farver (vælg et andet look-up tabel, under "billede"-menuen i Image J), og derefter overlay på de tilsvarende ^1H billeder for at lokalisere signalet.
2. ^19F Kvantificering
   1. Vælg en ^19F billede (størrelsesorden billede) med de relevante celler og reference synlige.
   2. I et program som Billede J, tegne ROIs de relevante celler, henvisning og et område uden for emnet (støj).
   3. Brug kommandoen Analyserog derefter måle (eller blot Ctrl + M) til at beregne den gennemsnitlige pixelintensitet inden for disse områder, og deres område. Lad S (celler) refererer til den gennemsnitlige pixelintensitet i ROI over cellerne. Formere sig, at ved den mængde (= areal x skive tykkelse) for at beregne den samlede signal.
   4. Beregn SNR, for eksempel ved hjælp af formlen SNR = 0,65 x S (celler) / σ, hvor σ er standardafvigelsen for pixelintensitet i en ROI uden for stikprøven, som er fri for enhver kemisk skift artefakt (typisk i baggrunden luft) ^17.. Hvis SNR er under 5, kan en korrektion for signalet på grund af støj kan være nødvendig og kan udføres som beskrevet andetsteds ^{11 10.}
   5. Ellers beregne den samlede mængde af ^19F ansvarlig for signalet i ROI i referenceperioden ved at multiplicere det område af henvisningen i skive for skive tykkelse (for at beregne volumen) med koncentrationen af ^19F i referencen,som er kendt og antages at være homogen.
   6. Formere sig, at værdien af det samlede signal i ROI over cellerne, divideret med det samlede signal over referencen til at beregne mængden af ^19F i cellerne.
   7. Beregn antallet af celler ved at dividere dette tal med værdien for ¹⁹ F / celle, der blev beregnet i afsnit 2.

Representative Results

Her viser vi de typiske resultater for en protokol der indebærer overførsel af ¹⁹ F-mærkede celler målsøgende en drænende lymfeknude. Figur 2 viser en ^19F NMR-spektret af 10 ⁶ mærkede celler under anvendelse af et TFA-reference. De billeddannende opsætning blev udført som beskrevet i protokollen (Figur 3). Til in vivo-billeddannelse, anvendte vi en reference bestående af en lukket cylinder med samme etiket anvendes til cellerne anbragt mellem fødderne af musen. Et repræsentativt behandlet billede er vist i fig. 4. Ved at anvende den protokol, der er beskrevet i afsnit 7.2, vi beregnet en celle nummer på ca. 1,2 x 10 ⁶ baseret på rå ^19F størrelsesorden billede.

Figur 1. Vigtige skridt til ^19F MRI-baserede celle sporing. in vivo data. Figur gengivet med tilladelse ^6. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Repræsentant ^19F NMR-spektrum. Spektret viser ^19F opnåede signalgrund af den kendte mængde af reference i dette tilfælde TFA og kendt antal af celler, der er mærket "prøve". Dette kan anvendes til at beregne mængden af fluor per celle, som er nødvendig til in vivo kvantificering fra MR billeddata.

Figur 3. Flipvinkel kort rør med TFA i vand blev erhvervet på ^{1 time} og ¹⁹ F-kanal. Proportionalitetsfaktoren blev beregnet til at være 1,03 ± 0,08 for denne opsætning. FA: flip vinkel.

Fig. 4. In vivo ^1H / ¹⁹ F-billede af dendritiske celler målsøgende en drænende lymfeknude. Figuren viser et repræsentativt billede af en mus, med ^19F signal synlige,i falske farver, i referencen (R) og de mærkede celler. Kun benene af mus blev afbildet her. I dette eksempel, migrerede de injicerede mærkede celler til afdrypning lymfeknude. De billeddiagnostiske parametre er sammenfattet i hovedteksten. Tallet er kun en illustration.

Discussion

Protokollen beskrevet her beskriver den generelle fremgangsmåde til in ^vivo-19F MRI cellesporing. Trods den beskrevne coinkubering metode, er der flere forskellige protokoller til mærkning af celler med et ^19F middel. Imidlertid er coinkubering oftest bruges og kan optimeres yderligere fx ved tilsætning af transfektions midler ^6. Den faktiske cellemærkning protokol vil afhænge af celletypen. Kun vigtige mærkningsordninger trin er beskrevet i protokollen her. Generelt er etiketten fremstillet og tilsat til cellerne i et valgt tidsrum fra et par timer til et par dage. Endelig skal cellerne vaskes omhyggeligt for at fjerne ethvert overskud af mærke, især hvis kvantificering fra billeddata vil blive udført ^3. Hvis ^19F middel indbefatter et fluorescens-tag, tilstedeværelsen af etiketten uden for (eller ikke bundet til) celler kan påvises under anvendelse af mikroskopi. Efter mærkning, er det nødvendigt at undersøge cellelevedygtighed og funktionalitet, i forhold til ikke-mærket celler (fx ved trypanblåt-udelukkelse assay). Cellespecifikke funktionalitet tests, såsom evnen til at aktivere T-celler i tilfælde af DC'er, skal også udføres. Endelig, som nogle ^ikke-19F MR etiketter har en effekt på celle migration ¹⁸ sådanne tests bør også medtages i ¹⁹ F etiketter, især med høj celle belastning.

Protokollen for den dyremodel er også afhængig af brugerens behov. Men det er vigtigt at huske de strenge følsomhed grænser for ^19F MR, når du planlægger eksperimenter. Offentliggjorte følsomhedsværdier spænder fra 1,000-00,000 cells/voxel/1 hr tid ^6, med en celle belastning i størrelsesordenen 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. Følsomhed og forventede koncentration etiket i regionen af ​​interesse også påvirke de billeddannende parametre. For eksempel kan skivetykkelsen anvendes til ^19F billedet adj Usted til at matche, at af de ¹ h billeder eller til at dække et meget tykkere område (såsom hele lymfeknude eller område af interesse i et enkelt udsnit). Typisk ^19F billeddannelse udføres ved lavere opløsning for at maksimere signaldetektering, især da høj opløsning er normalt ikke nødvendigt at skelne strukturer såsom lymfeknuder. Hvis signalet er tilstrækkelig, kan et større antal af tyndere skiver erhverves og det samlede signal over mængden af ​​interesse beregnet fra disse. Men de optimale parametre skal, for at være afledt for hver ansøgning individuelt.

Vi beskriver en indsprøjtning anæstesi protokol med ketamin / xylazin undgå fluorholdige indånding gasser som isofluran. Andre protokoller er blevet anvendt i litteraturen ^10,11. Men i alle tilfælde vil disse protokoller skal justeres til musen stamme, alder, køn, helbred og længden og hyppigheden af ​​de billeddannende sessioner.

NDHOLDET "> Flere ^19F MR imaging-sekvenser har været brugt til celle tracking, for en gennemgang se ^6. Vores imaging protokol kan let modificeres til at omfatte andre billeddiagnostiske sekvenser. Men den her beskrevne kvantificering metoden ikke tager hensyn til eventuelle delvise volumen virkninger, er uoverensstemmelser i udvælgelsen af ROIs, ændringer i afslapning parametre mærket in vivo, eller ændringer i cellulære ^19F læsning. Disse spørgsmål beskrevet andetsteds ^3.. Kort sagt, er fundet fejlen til at være inden for acceptable grænser for langsgående cellesporing ^10.. Sammenlignet med disse tidligere værker vi desuden foreslå et billede korrektion ordning for anvendelse af overflade RF spoler ved at kortlægge B1 felt. Afhængigt af den specifikke RF spole setup er det vigtigt at være opmærksom på begrænsningerne i B1 kortlægning teknikker, som har været velundersøgte i forbindelse med ^{1H-MRI 16.} For eksempel til den dobbelte vinkel, der præsenteres her B1Kortet er mest nøjagtige for flipvinkel par lige under 90 ° -180 ° ¹⁴ og kan indføres betydelige fejl i andre regioner. Stadig efter korrekt validering in vitro, sådan retrospektiv korrektion kan yderligere forbedre celle kvantificering. Generelt anbefaler vi bestyrkelse af data med mere etablerede teknikker, i hvert fald i første omgang. Dette gøres typisk i kombination med andre in vivo imaging teknikker, fx optisk billeddannelse, at hjælpe med at udelukke store fejl. I de fleste tilfælde er nødvendigt histologisk evaluering for at vurdere ^19F etiket placering præcist og til at give sammenhæng med de billeddiagnostiske data. Dette kan kræve tilsætning af et fluorescerende farvestof til ^19F middel.

Endelig, selv om ^19F MRI er endnu ikke blevet anvendt klinisk cellesporing, ville det være muligt at modificere denne protokol til human brug. De vigtigste ændringer er nødvendige for ville være at udføre så meget af optimning og opsætning på forhånd som muligt (for at minimere den tid, motivet er i scanneren), og til at justere imaging parametre til at holde inden for klinisk Specific Absorption Rate (SAR) restriktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec