In vivo ¹⁹ F MR for Cell Tracking

Summary

Vi beskriver en generell protokoll for in vivo-celle sporing ved hjelp av MRI i en musemodell med ex vivo merkede celler. En typisk protokoll for celle merking, image oppkjøpet prosessering og kvantifisering er inkludert.

Abstract

In vivo ¹⁹ F MR tillater kvantitativ celle sporing uten anvendelse av ioniserende stråling. Det er en ikke-invasiv teknikk som kan anvendes på mennesker. Her beskriver vi en generell protokoll for celle merking, bildebehandling, og bildebehandling. Teknikken er anvendelig til ulike celletyper og dyremodeller, men her fokuserer vi på en typisk mus modell for sporing murine immunceller. De viktigste sakene for celle merking er beskrevet, da disse er relevante for alle modeller. På samme måte blir hovedavbildningsparametre som er oppført, men det vil variere noe avhengig av MRI-systemet og den enkelte installasjon. Til slutt tar vi med et bilde behandlingsprotokoll for kvantifisering. Variasjoner for dette, og andre deler av protokollen, er vurdert i diskusjonskapittelet. Basert på den detaljerte prosedyren er beskrevet her, vil brukeren må tilpasse protokollen for hver bestemt celletype, celle etiketten, dyremodell, og bildebehandling oppsett. Legg merke til at protocol kan også være tilrettelagt for menneskelig bruk, så lenge kliniske restriksjoner er oppfylt.

Introduction

In vivo-celle sporing er viktig for optimalisering og overvåking av cellulære terapeutika ^en. På grunn av sin ikke-invasiv art, bildebehandling gir gode muligheter for å overvåke celler in vivo. Magnetisk resonanstomografi (MRI) er uavhengig av ioniserende stråling og gjør det mulig for en overlegen bildeoppløsning og iboende bløtvev kontrast. Har allerede blitt brukt MRI-baserte celle sporing klinisk å følge dendrittiske celler i melanompasienter ^2. Vanlige klinisk MRI blir utført på ^en H kjernen, til stede i mobil vann i vev. Det er også mulig å utføre MRI på andre aktive atomkjerner, slik som ¹³ C, ¹⁹ C og ²³ Na. Imidlertid har kun ¹⁹ F MR blitt brukt med hell til in vivo celle sporing som det gir den høyeste følsomhet etter ^en H. Fraværet av MRI-detekterbart endogent ¹⁹ F i vev tillater høyt signal selektivitet forpåvisning av eksogene ¹⁹ F kontrastmidler og tillater kvantifisering av fluor konsentrasjon direkte fra bildedataene. For en detaljert diskusjon om ¹⁹ F MR, se ^3-5. Et sentralt spørsmål med ¹⁹ F MR er behovet for å utvikle og optimalisere egnede ¹⁹ F celle etiketter, selv om flere etiketter har blitt utviklet, med en trend mot multimodale agenter ^seks.

Protokollen som beskrives her er basert på studier av våre grupper ^7-9, inkludert de første artiklene som er beskrevet in vivo-kvantitativ ¹⁹ F MRI-baserte celle sporing ^10,11. Den generelle fremgangsmåte fra celle sporing ved hjelp av ^19F MRI er oppsummert i figur 1. Vi beskriver en generell protokoll for merking og avbildning av dendrittiske celler (DCS) ved hjelp av en skreddersydd perfluorkarbonene kontrastmiddel ^åtte. Den bilde protokollen er generelt gjelder forskjellige celletyper, etiketter og dyremodeller. Dencelletype og dyremodell som er beskrevet her bør kun tas som et eksempel, og dermed har vi ikke gi detaljer om cellen isolasjon og merking, men heller fokusere på bilde protokollen. Modifikasjoner vil være nødvendig for hver etikett, celletype, dyremodell, og bildeoppsettet, og disse kan finnes i litteraturen, eller kan ha behov for å bli optimalisert av forskerne. Noen vanlige modifikasjoner er inkludert i diskusjonen.

Protocol

Merk: Alle eksperimenter og prosedyrer som involverer dyr må utføres i samsvar med relevante etiske retningslinjer og i samsvar med standard dyr omsorg og humane krav.

En. Cell Merking (Standard protokoll med Coincubation)

1. Legg ¹⁹ F etikett ⁸ til umodne DC i en konsentrasjon på 4 mg/10 ^6-celler (i 2 ml medium). Virvle forsiktig for å blande.
2. Inkuber cellene med etiketten for tre dager før modning og høsting DCS.
3. Samle DCS og fjerne overflødig etiketten ved å vaske minst 3x i PBS. Telle celler.
4. Resuspender i et lite volum av PBS for injeksjon eller ytterligere testing.

Merk: Denne protokollen er relevant for disse spesifikke DCs og etiketten. Prosedyren ble optimalisert i en annen publikasjon ⁸ og inngår her er bare de skritt for å forberede en prøve til bildet, siden fokus for denne protokollen er på bildebehandling. Hence, vil protokoll for isolering, kultur og merking av en spesifikk celletype enten må bli funnet i litteraturen, eller optimaliseres av forskeren. Et sammendrag av alle andre ¹⁹ F etiketter som har blitt brukt i litteraturen er presentert andre steder ^seks.

2. Fastsettelse av ¹⁹ F / celle ved hjelp av ¹⁹ F NMR

1. Plasser et kjent antall merkede celler (vanligvis mer enn 0,5 x 10 ^{til 6,} eller et tall som gir tilstrekkelig signal) i et NMR rør.
2. Tilsett 10 ul av 5% trifluoreddiksyre (TFA). Hvis resonansfrekvensen av TFA er uegnet på grunn av overlapper med etiketten, bruke en alternativ oppløselig forbindelse, fortrinnsvis med en enkel ¹⁹ F resonans.
3. Plasser prøven i et NMR spektrometer og få ¹⁹ F spekteret. Påse at båndbredden er tilstrekkelig for både den TFA (referanse) og agenten.

Merk: TR bør være lang nok for full avslapning av referansen og prøven spinner (rundt 5 ganger T _en relaksasjonstid på den lengste T ₁ komponenten i røret, vanligvis TR ~ 5-8 sek.) Noen spektrometre krever D ₂ O for en frekvens lås signal. En standard ¹⁹ F spektrum er tilstrekkelig. Omfattende midling eller høyere celle tall vil være nødvendig dersom celleopptak av etiketten er dårlig eller hvis celle tall er lave. Spekteret bør være sentrert mellom referansen og relevante label topper, med mindre korreksjoner er gjort for å ta høyde for delvis eksitasjon.

4. Beregn de relative områder under toppene av referansen og prøven (eller de viktigste toppen av prøven), og så beregne det midlere antall av ¹⁹ Fs / celle i prøven.

Merk: Hele prosessen må gjentas og i gjennomsnitt omfattende nok til å nå statistisk signifikans. Dette kan også gjøres ved hjelp av spektroskopi direkte på MR-skanner. Hsom fører til, være oppmerksom på at denne fremgangsmåten viser bare den gjennomsnittlige ¹⁹ F lasting for et stort antall celler, ikke variabiliteten mellom cellene. Kontroll ensartethet av celleopptaket krever tilstedeværelse av en fluorescerende komponent ved ¹⁹ F middel, slik at celleopptak kan bli analysert ved hjelp av mikroskopi eller strømningscytometri.

Tre. Betraktninger for Experimental Design - Cell Injection

Med hensyn til det som er nødvendig for vellykket relativt dårlig sensitivitet på ¹⁹ F MR for cellesporing, en dyremodell, hvor cellene vil lokalisere i store mengder in vivo avbilding. Typiske sensitivitet varierer fra 1,000-100,000 cells/voxel/1 hr scan tid ^6, med en celle lasting i størrelsesorden 10 ¹¹ -10 ¹³ fluoratomer.

Antall og hyppighet av imaging økter må planlegges nøye, da dette påvirker valg av bedøvelse. Legg merke til at isofluran er ikke suitable for ¹⁹ F MR hvis ¹⁹ F resonansfrekvens isofluran er nær til den av etiketten forbindelse som anvendes. isofluran kan likevel være egnet hvis imaging økter er kort nok til å hindre betydelig oppbygging. Flere alternative bedøvelsesmidler er blitt brukt i litteraturen ^10,11; et eksempel er inkludert i avbildningsprotokollen. Bedøvelsesmidler kan trenge å være optimalisert for ulike musestammer og sykdom modeller.

4. Design av en ekstern ¹⁹ F Reference

1. Bruk av en ekstern referanseinneholdende en kjent mengde av ¹⁹ F-signalet for kvantifisering ^12.. Velge den signalintensiteten av referansen til å være omtrent tilsvarende den som er forventet fra emnet.

Merk: Generelt er det enklest dersom referanseforbindelsen er den samme som den cellen etiketten, for å passe til avspennings parametere. Hvis spektroskopiske sekvenser eller sekvenser uten romlig lokalisering blir brukt, så acompound med en annen kjemisk forskyvning kan være nødvendig.

2. Modifiser plassering, størrelse og form av referansen som nødvendig, avhengig av området av interesse (ROI). Merk: Det er som regel det enkleste å bruke rør med ensartet tverrsnitt for referansen.

5. Imaging and Mouse Forberedelse

1. Fortynn kommersielt tilgjengelig ketamin og xylazin 01:10 volum / volum med fysiologisk saltløsning til å gi stamløsninger på 10 mg / ml ketamin og 2 mg / ml xylazin.
2. Slå på varmesystemet i skanneren (typisk varm luft) for å sikre at utboringen vil være varm før musen avbildes.
3. Injiser 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin intraperitoneal å initiere anestesi. Merk: Disse dosene har blitt testet for CD1 (ICR) og NU-Foxn1 ^nu 8-ukers gamle hannmus. Andre stammer kan trenge litt forskjellige doser, som skal optimaliseres i et separat eksperiment. Denne dose vil holde musen bedøvet til enbout 45 min. Merk: anestesidybden er vanligvis tilstrekkelig dersom dyret ikke viser noen reaksjon på en fot klemme.
4. Når bedøvet, plassere dyret i et dyr vugge og immobilisere å hindre bevegelse under MR. Hvis det er nødvendig å plassere det eksterne referansen ved siden av dyret. Både referanse og ROI (forventede plassering av de injiserte celler) bør ligge i midtpartiet av spolen. Dyret skal være koblet til temperatur og pustekontroll for fysiologisk overvåking under skanning.
5. Dekke øynene til musa med sterilt øye salve for å hindre uttørking under lange bilde økter.
6. Hvis bildetiden overstiger 40 min, forberede flere katetre for injeksjon av ekstra ketamin / xylazin før dyret kan våkne opp. Posisjons to separate subkutane katetre med arbeids løsninger av ketamin og xylazin. Bruk av dette kateter for å gi mus et ytterligere 2,5 mg ketamin hvert 20 min etter at de første 40 min. Om nødvendig kan ytterligere forlenge anestesi ved injeksjon av ytterligere 0,5 mg xylazin gjennom kateteret, 100 min etter den første injeksjon. I alle tilfeller bør forsøkstiden ikke overstiger 3 timer, bortsett fra muligens i henhold til terminal anestesi.
7. Påse at musen er varmet direkte etter den første injeksjon og opprettholdt ved 37 ° C i kroppstemperatur. Med denne protokollen, <80% blod oksygene ble oppdaget i henhold atmosfære luft å puste. For å unngå bivirkninger fra den senket blodoksygenering, bruke 100% oksygen (0,3 l / min). Kroppstemperatur-og puste bør kontrolleres gjennom hele forsøket og inntil full gjenoppretting av dyret. Legg merke til at den spontane pustefrekvens i henhold ketamin / xylazin er svært høy (200-250/min). Uregelmessigheter i pustemønster, i stedet for pustehastighet, kan indikere at en høyere dose er nødvendig for å opprettholde en passende tilstand av anestesi. Musen vil vekke spontant innen 20-30 min after den siste dosen av bedøvelse.

Merk: For celle sporing, er det nødvendig å bilde det samme dyret mer enn en gang. I så fall bør imaging økter være planlagt med hensyn til den tid som er nødvendig for klarering av anestesi fra system-og dyre retningslinjer for bruk av instituttet.

6. Imaging

¹ H justeringer og bildebehandling

1. Plasser dyret inne i skanneren slik at avkastningen er i isomidtpunktet ved hjelp av en lav oppløsning, anatomisk scan med forskjellige slice orientering (en localizer).
2. Bruk vanlig shimsingen protokollen på ^en H, for eksempel en global mellomlegg på hele volumet inne i spolen.
3. Juster referansen puls gevinst (RG), dvs. sendereffekten målt i dB for en 1 msek Hermite 90 ° RF puls, med skanne gitt av leverandøren justering.

Merk: Denne justeringen vilvarierer med typen av RF spolen og er avgjørende for ¹⁹ F MR siden signalet på ¹⁹ F frekvens er vanligvis for lav for direkte justeringer. Som en følge av dette må et estimat av RG være laget av målinger på ^en H-signal. For RF transmisjon med en overflate pole, skal ^1H RG justeres til et plan parallelt med spolen gjennom en del av interesse, for en volum spole med homogen B ₁ profil, de nøyaktige innstillinger av justeringen er mindre viktig.

4. Den følgende protokollen for ¹⁹ F referansepulsforsterkningsjustering fungerer bare hvis både ^en H og ^19. F RF transmisjonen er utført med den samme (enkelt eller dobbelt-avstemt) RF-spole. For en slik avbildning oppsett, bør spolen profilen (B _en senderfelt) på ¹ H være proporsjonal med ^19F spolen profil, når en fast RG er påført, det vil si B = _{1,1 H} C * B _{1,19 F} med en rekvisittortionality konstant C.
   1. For å bekrefte at spiral profiler er proporsjonal for et bestemt oppsett, få en ^en H og en ¹⁹ F flip vinkel kartet (se neste avsnitt om B _en korreksjon) på et rør med høykonsentrert ¹⁹ F, f.eks TFA i vann (01:01 v / v) under anvendelse av identiske felt-av-vis (FOVs), på forhånd (figur 3).
   2. Ved hjelp av den samme RG, kontrollerer at begge baner er identiske med unntak av den globale faktor C.
   3. Når ^en H RG er bestemt, oppmerksom på at dette tallet ned.
5. Gjennomføre en konvensjonell ^en H MR-undersøkelse som en anatomisk referanse for ¹⁹ F bildebehandling. Tune i systemet til ¹⁹ F-frekvensen til cellen markør og utføre en ¹⁹ F MR skanne. Ideelt ¹⁹ F MR-undersøkelse vil ha samme felt-of-view og skive valg som ^en H MR, men vanligvis med lavere oppløsning. Dyret kan bli gjenopplivet så snart imaging er fullført. Bildebehandling kan deretter utføres frakoblet.
6. Bestem ¹⁹ F RG via forholdet dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Estimer ^19F middel frekvensen i en separat in vitro eksperiment.

Merk: In vivo, kan den eksakte frekvensen variere litt fra eksperiment for å eksperimentere på grunn av ulike mellomlegg forhold. For å forhindre kjemisk skift gjenstander nøyaktig frekvens bør derfor bestemmes i hvert eksperiment ved ^19F MRS, hvis mulig. En typisk scan for svært lav ¹⁹ F signal ville være globalt (puls-Acquire) spektroskopi (TR = 200 msek, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, og dermed TA, kan bli dramatisk redusert for høy ¹⁹ F-signal. Den ¹⁹ F middel frekvens blir bestemt fra spekteret etter Fourier-transformasjonen og fasekorreksjon. NEX refererer til antall eksitasjoner, er TA akkvisisjonstiden og BW erbåndbredde.

Merk: Typiske avbildningsparametere ⁹ på en 11.7T/16 cm dedikert dyr scanner er: En anatomisk ^en H bildebehandling skanning ved hjelp av en turbo spin ekko (TSE) sekvens med TR / effektiv ekko tid (TE _eff) = 2200 msec/42.8 msek, 8 ekko per eksitasjon, NEX = 2, 10 på rad, 1 mm tykke skiver, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, 128 x 128 matrise, dvs. en oppløsning på 150 x 150 x 1000 mikrometer ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz og en lineær fase kodeskjema. ¹⁹ F-bilder ble kjøpt med den samme sekvensen og matchende geometri, men på lavere in-plane oppløsning og lavere BW (NEX = 256, 48 x 48 matrise, dvs. en oppløsning på 400 x 400 x 1000 mikrometer ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B _en korreksjon
   Ved hjelp av en RF-spole med inhomogene B ₁ profilen, for eksempel en overflatepole, kan hemme kvantifisering av ¹⁹ F data siden signalet avhengerikke bare på ¹⁹ F-konsentrasjon, men også av avstanden fra spolen. Skaff et B _ett kart på ^en H kanal for å retrospektivt korrekte ¹⁹ F data. Dette krever at ^en H-og ^F-19 spiral-profiler er identiske, med unntak av proporsjonalitetsfaktoren C, og at det er tilstrekkelig ^1H bakgrunnssignalet er gitt i regioner av ¹⁹ F. Et eksempel på protokoll for korrigering av en ¹⁹ F spinnekko-sekvensen er presentert ved hjelp av en enkelt-avstemt Tx / Rx overflate pole avstembar til både ^{1H-og 19F,} og med proporsjonal B ₁ profilene ^13.
   1. Skaff et ¹ H flip vinkel kartet med to flip vinkel metode ^14. Erverve en gradient ekko scan med svært lang TR (> 3 ganger ^en HT ₁₎ med en estimert flip vinkel i underkant av 90 °. Lukk til spolen. Tilegne seg en andre gradient ekko skanning med en RG = dB _1H -6, dvs. to ganger den flipvinkelen på første skanningen.
   2. Beregn ^1H flip vinkel, α, ved voksel (x, y, z) via signalintensitet (SI) av den første og andre gradient ekko-skanninger: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. De ¹⁹ K flip vinkel er identisk (bortsett fra faktoren 1 / C) på grunn av proporsjonal B ₁ profiler. Ifølge Faradays prinsippet om gjensidighet ^15, demping av ¹⁹ F-signal intensitet fra en spin ekko sekvens (eksitasjon flip vinkel α, refokusering flip vinkel 2α) under signalmottaket er att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). Dempningen på grunn av ufullkommen magnetisering er att _Tx (x, y, z) ~ sin ³ (α (x, y, z)) ^16. Den samlede demping er skrevet som att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Merk at det er normalisert til 1 i tilfelle av perfekt 90 ° / 180 ° eksitasjon / refokusering flip vinkel. The B _en korrigert19 F-bildesignalintensitet SI _{19F, corr} er beregnet via SI _{19F, korr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / v (x, y, z).
   3. For å sammenligne signalintensitet fra forskjellige eksperimenter, plasserer et referanse rør med definert ¹⁹ F konsentrasjon i synsfeltet, og normalisere SI _{19F, korr} til den midlere signal i referanse.

Merk: Andre ^en HB ₁ / flip vinkel kartleggingsmetoder kan brukes og ulike ¹⁹ F pulssekvenser krever modifikasjoner av att _{Tx, 19F.} Enhver form for B1 korreksjon ordningen vil innføre ytterligere feil i cellen kvantifisering prosedyren. Hvis nøyaktig cellefesting er den viktigste forutsetning, kan en RF-spole med homogen B1 profilen brukes for å omgå denne del av protokollen.

7. Bildebehandling

1. Å gjøre ^en H og ¹⁹ F overlay-bilder
   1. Eksportere bildedataenefor den endelige ¹ H og ¹⁹ F magnitude bilder fra skanneren.
   2. Åpne filene i et bildebehandlingsprogram, for eksempel ImageJ (freeware, NIH).
   3. Gjennomføre bildejusteringer som nødvendig (beskjæring, lysstyrke, kontrast) holder justeringene den samme for alle bilder. De ¹⁹ F-bilder vil vanligvis trenger å bli oppskalert til en høyere oppløsning som tilsvarer riktig ^en H-bilder.
   4. Gjengi de ¹⁹ F-bilder i falske farger (velg en annen look-up table, under "image"-menyen i bilde J) og deretter legge på de tilsvarende ^en H-bilder for å lokalisere signalet.
2. ¹⁹ F Kvantifisering
   1. Velg en ¹⁹ F bilde (magnitude bilde) med de aktuelle celler og referanse synlig.
   2. I et program som for eksempel bilde J, tegne Rois de aktuelle cellene, referanse og en region utenfor faget (støy).
   3. Bruk kommandoen Analyserog deretter Mål (eller rett og slett Ctrl + M) for å beregne middelverdien pikselintensiteten innenfor disse regionene, og deres område. La S (celler) refererer til gjennomsnittet pikselintensiteten i ROI over cellene. Multipliser det med volum (= område x skive tykkelse) for å beregne det totale signalet.
   4. Beregn SNR, for eksempel ved hjelp av formelen SNR = 0,65 x S (celler) / σ, hvor σ er standardavviket pikselintensiteten i en ROI utenfor prøven som er fri for enhver kjemisk skift gjenstand (typisk i bakgrunnen luft) ^17. Dersom SNR er under 5, kan en korreksjon for signalet på grunn av støy være nødvendig, og kan utføres som beskrevet andre steder ^{11 10.}
   5. Ellers beregne den totale mengden av ¹⁹ F ansvarlig for signalet i ROI over referansen ved å multiplisere arealet av referansen i snitt av skivetykkelse (for beregning av volumet) ved konsentrasjonen på ¹⁹ F i referansesom er kjent og antas å være homogent.
   6. Multipliser at verdien av det totale signal i ROI over cellene, dividert med det totale signal over referansen for å beregne mengden av ^19F i cellene.
   7. Beregn det antall celler ved å dividere dette antallet av verdien for ¹⁹ F / celle, som ble beregnet i punkt 2.

Representative Results

Her vi viser typiske resultater for en protokoll som involverer overføring av ¹⁹ F-merkede celler homing av en drenerende lymfeknute. Figur 2 viser en ^19F NMR-spektrum av 10 ⁶ merkede celler ved hjelp av et TFA referanse. Den bilde oppsett ble utført som beskrevet i protokollen (figur 3). For in vivo avbildning, benyttet en referanse bestående av en forseglet sylinder med den samme anvendte markør for celler som er lagt inn mellom føttene til mus. Et representativt behandlet bilde er vist på figur 4.. Ved å anvende protokollen som er beskrevet i avsnitt 7.2, beregnet vi en celle nummer på ca. 1.2 x 10 ⁶ basert på det rå ^19F magnitude bilde.

Figur 1. Viktige skritt for ¹⁹ F MRI-baserte mobilsporing. in vivo data. Figur gjengitt med tillatelse ^6. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Representant ¹⁹ F NMR spektrum. Spekteret viser ¹⁹ F-signalet innhentetpå grunn av den kjente mengden referanse, i dette tilfellet TFA, og det kjente antall celler, merket "sample". Dette kan brukes til å beregne mengden av fluor per celle, noe som er nødvendig for in vivo kvantifisering fra MR-bildedata.

Figur 3. Flip vinkel kart over rør med TFA i vann ble kjøpt på ^en H og ¹⁹ F-kanal. Den proporsjonalitetsfaktor ble beregnet til å være 1,03 ± 0,08 for dette oppsettet. FA: flip vinkel.

Fig. 4. In vivo ^1H / ¹⁹ F bilde av dendrittiske celler homing til en drenerende lymfeknute. Figuren viser et representativt bilde av en mus, med ^19F signal synligi falske farger, i referanse (R), og de merkede celler. Bare beina på musa ble fotografert her. I dette eksemplet er de injiserte merkede celler migrert til de drenerende lymfeknute. Det tenkelig parametrene er oppsummert i hovedteksten. Figuren er kun ment som illustrasjon.

Discussion

Protokollen er beskrevet her beskriver den generelle fremgangsmåten for in vivo ¹⁹ F MR celle sporing. Til tross for de beskrevne ko-inkubasjon metoden, er det flere forskjellige protokoller for merking av celler med en ¹⁹ F middel. Imidlertid er co-inkubering oftest brukt, og kan bli ytterligere optimalisert for eksempel ved tilsetning av transfeksjon midler ^6. Selve cellemerking protokoll vil være avhengig av celletype. Kun hovedmerkingsfremgangsmåten er beskrevet i protokollen her. Generelt blir etiketten fremstilt og tilsatt til cellene i en valgt tid som varierer fra noen timer til noen dager. Til slutt, må cellene vaskes forsiktig for å fjerne overflødig av etiketten, spesielt hvis kvantifisering fra bildedataene vil bli utført ^tre. Dersom ^19F middel omfatter et fluorescens tag, tilstedeværelsen av markør utenfor (eller ikke er bundet til) cellene kan detekteres ved hjelp av mikroskopi. Etter merking, er det nødvendig å studere cellenlevedyktighet og funksjon i forhold til nonlabeled celler (eventuelt med trypan blå eksklusjon assay). Cellespesifikk funksjonalitet tester, slik som evnen til å aktivere T-celler i tilfellet med DC, må også utføres. Til slutt, som noen ^ikke-19 F MR etiketter har en effekt på cellemigrasjon ¹⁸ slike tester bør også tas med i ¹⁹ F etiketter, spesielt med høy celle lasting.

Protokollen for dyret modellen er også avhengig av brukerens behov. Det er imidlertid viktig å huske de strenge følsomhetsgrensene av ¹⁹ F MRI ved planlegging av eksperimenter. Publisert sensitivitet varierer fra 1,000-00,000 cells/voxel/1 hr tid ^6, med en celle lasting i størrelsesorden 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. Følsomhet og forventet etiketten konsentrasjon i regionen av interesse også påvirke bildeparametere. For eksempel kan den skivetykkelse som brukes for ¹⁹ F bildet adj usted for å tilpasse det de ^en H bilder eller for å dekke et mye tykkere område (for eksempel hele lymfeknute eller en region av interesse i en enkelt skive). Vanligvis er det ¹⁹ F avbildning utført ved lavere oppløsning for å maksimere signaldeteksjon, spesielt siden høy oppløsning er vanligvis ikke nødvendig å skille strukturer som lymfeknuter. Hvis signalet er tilstrekkelig, kan et større antall tynnere skiver bli kjøpt, og det totale signal over volumet av interesse beregnes ut fra disse. Imidlertid vil de optimale parameterne må utledes for hvert program individuelt.

Vi beskriver en injeksjon anestesi protokoll med ketamin / xylazin unngå fluorinnåndingsgasser som isofluran. Andre protokoller er blitt brukt i litteraturen ^10,11. Men i alle tilfelle vil disse protokoller må justeres for mus belastning, alder, kjønn, helse og lengden og hyppigheten av de bildedannende sesjoner.

ontent "> Flere ¹⁹ F MR-bildesekvenser har blitt brukt for celle sporing, for en gjennomgang se ^seks. Vår bilde protokollen kan lett endres til å inkludere andre bildesekvenser. Men kvantifisering metoden beskrevet her tar ikke hensyn til eventuelle delvis volum effekter, er avvik i utvalget av Rois, endringer i avslapping parametere av etiketten i vivo, eller endringer i mobil ¹⁹ F lasting. Disse problemene beskrevet andre steder ^tre. I korte trekk, har feilen blitt funnet å være innenfor akseptable grenser for langsgående celle sporing ^10. Sammenlignet med disse tidligere arbeider vi i tillegg foreslå et bildekorreksjon ordning for bruk av overflate RF spoler ved å kartlegge B1-feltet. Avhengig av den spesifikke RF polen oppsett er det viktig å være klar over begrensningene i B1 kartlegging teknikker, som har vært godt studert i sammenheng med ^en H MRI ^16.. For eksempel, for den dobbelte vinkel-metoden presentert her B1Kartet er mest nøyaktige for flip vinkel parene like under 90 ° -180 ° ¹⁴ og betydelig feil kan bli introdusert i andre regioner. Likevel, etter skikkelig validering in vitro, slik retrospektiv korreksjon kan ytterligere forbedre celle kvantifisering. Generelt anbefaler vi bekreftelse av data med mer etablerte teknikker, i hvert fall i første omgang. Dette gjøres vanligvis i kombinasjon med andre in vivo-bildeteknikker, f.eks optisk avbildning, for å ekskludere store feil. I de fleste tilfeller er histologisk evaluering nødvendig å vurdere ¹⁹ F etikett plassering nøyaktig og å tillate korrelasjon med avbildningsdata. Dette kan kreve tilsetning av et fluorescerende fargestoff til ^19F middel.

Til slutt, selv om ¹⁹ F MR ikke har blitt brukt til klinisk celle sporing, ville det være mulig å endre denne protokollen for menneskelig bruk. Hoved modifikasjoner ville være nødvendig for å gjennomføre så mye av optimization og oppsett på forhånd som mulig (for å minimere tiden motivet er i skanneren), og for å justere bildeparametre for å holde seg innenfor klinisk Specific Absorption Rate (SAR) begrensninger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec