Retrograd Mærkning af retina-ganglieceller i Voksen Zebrafisk med fluorescerende farvestoffer

Abstract

Som retrograd mærkning af retinale ganglieceller (rGCS) kan isolere rGCS somata fra at dø sites, er det blevet den gyldne standard for at tælle rGCS i rGCS overlevelse og regeneration eksperimenter. Mange undersøgelser er blevet udført på pattedyr at forske rGCS overlevelse efter synsnerven skade. Men er endnu ikke blevet rapporteret om retrograd mærkning af rGCS i voksen zebrafisk, selvom nogle alternative metoder kan tælle celletal i retina ganglion cellelag (RGCL). I betragtning af den lille størrelse af den voksne zebrafisk kraniet og den store risiko for død efter boring på kraniet, vi åbner kraniet ved hjælp af syre-ætsning og forsegle hullet med en lyshærdende obligation, som i væsentlig grad kunne forbedre overlevelsen. Efter at absorbere farvestoffer i 5 dage, er næsten alle rGCS mærkes. Da denne metode ikke behøver at transektere synsnerven, er uerstattelig i forskning af rGCS overlevelse efter synsnerven crush i voksen zebrafisk. Her introducerer videnne metode trin for trin og giver repræsentative resultater.

Introduction

Som voksen zebrafisk har en stærk evne til at regenerere axoner efter optisk nerveskade ^1, en ​​passende metode til at tælle hele rGCS er vigtigt at evaluere rGCS overlevelse og regeneration ^2. Baseret på metoder til retrograde mærkningsordninger rGCS i pattedyr og guldfisk ^{3 - 5,} vi bygget den metode til at mærke rGCS fra tectum i voksen zebrafisk. For voksne zebrafisk, bør to kritiske tekniske problemer bemærkes: kraniet af voksne zebrafisk er meget lille ^6; de lever i et vandmiljø. Her behandler vi kraniet med ætsemidlet som minimerer de farer forbundet med boring ^5. Så vi forsegle hullet med lyshærdende binding, der forbedrer dyrs overlevelse efter kirurgi.

Tidligere blev flere andre teknikker vedtaget at tælle rGCS nummer på indirekte måder. HE farvning i nethinden sektioner etiketter alle typer af celler i RGCL ^7. Antistof mærkning i hele retina, såsom ø-1, kan også mærke amacrine celler ^8. Selvom retrograd etiket fra synsnerven stumpen kan mærke alle rGCS i nethinden, kan det ikke blive vedtaget i crush model, fordi det medfører ekstra skade på synsnerven. Drage fordel af retrograd etiket fra tectum, har vi forsket rGCS overlevelse og regeneration i synsnerven crush. Resultaterne viser, at næsten alle rGCS overlevede og over 90% af rGCS regenereret til tectum på den første uge i knuse-modellen ^9.

For at kunne mærke alle rGCS blev Dil pasta valgt efter sammenligning med flere andre kommercielle farvestoffer ^10. For det første er det specielt designet til in vivo væv mærkning. For det andet er en lipofil farvestof, som ikke kan diffundere i vand. Derudover kan denne fluorescens vare ved i lang tid, hvilket gør det en glimrende kandidat til rGCS overlevelse forskning.

Protocol

1.. Konstruer Kirurgi Apparatus

BEMÆRK: For at sikre fiskene er i live under og efter operationen, drop anæstesi løsning ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate (MS-222, eller tricaine) ved en halv koncentration (0,015%) med en hastighed på 1 dråbe / sek gennem fiskens mund ved hjælp af en homebuilt drop, der er vist i figur 1.

1. Lav en kasse, som vist i figur 1A (længde er 28 cm, bredde 10 cm, højde er 5 cm), sætte en svamp (længde er 6 cm, bredde 9 cm, højden er 4 cm) i midten og åbne en hul på det.
2. Foretage en jævn kugleformet overflade på enden af nålen med lyshærdende binding (figur 1B), som derefter vil blive indsat i fisk munden. Sikre, at overfladen af ​​nålen er glat for at forhindre fiskens mund fra at blive beskadiget.
3. Tilsæt halvdelen koncentration af MS-222 (venstre kammer, længde er 6 cm, bredde 10 c.m, højde 8 cm) og saltvand (højre kammer, længde er 4 cm, bredde 10 cm, højde 8 cm) reservoirerne som vist i figur 1C. Bemærk: Det anbefales Frisk MS-222.
4. Bedøver fisk i 0,03% MS-222 i 2 min.
5. Læg fisken i gabet af svamp og løse fisk med to par ben, indsat bag brystfinnen og ved siden af svaberprøver pore, henholdsvis ^11.
6. Tilslut fiskens mund, MS-222 og opdræt vand med en T-typen rør som vist i figur 1C.
7. Tænd røret forbundet til MS-222.

2. Retrograd Label rGCS fra højre Tectum

BEMÆRK: Før starten desinficere alle apparater med 70-75% ethanol, der sikrer, at ingen ethanol tilbage.

1. Rossing: svagt fjerne huden over hele kraniet med sclerectome (dorsale visning af kraniet er vist i figur 2A og 2B
2. Clearing: Vask kraniet med saltvand og derefter tørre det med øre vask pære.
3. Indledende korrosion: ætse kraniet med ætsemidlet i 10 sek.
4. Clearing: helt tørre væk etchant med en vatpind, og derefter vaske området med saltvand og tør det.
5. Beskyttelse: For at beskytte kraniet på andre områder bortset fra den højre tectum fra overskydende korrosion, dækker disse områder med lys kurere obligation og derefter helbrede den ved eksponering for blåt lys med bærbar lyskilde.
6. Komplet korrosion: sætte ætsemidlet i det centrale område af den højre tectum igen til fuldstændig ætsning i 2 min. Bemærk: Da kranier ældre fisk er forkalkede, vil korrosion tage længere tid.
7. Clearing: helt tørre væk etchant med en vatpind, og derefter vaske området med saltvand og tørre det igen.
8. Skull åbning: fjern forsigtigt malacic kraniet (figur 2C) med pincet til at afsløre den rigtige tectum (figur 2D
9. Clearing: Tør slim og blod effusing fra hullet med stykker af Gelfoam og vaske det med saltvand, indtil blødningen er stoppet.
10. Dye placering: sætte farvestof (tissue-mærkning indsæt) på hele højre tectum og dække det med Gelfoam.
11. Adskillelse: dække hullet med en steril skala fra samme dyr.
12. Tætning: sted lyshærdende obligation på skalaen og derefter kurere den med blåt lys igen i 40 sek.
13. Genoplivning: vaske overfladen af ​​binding og genoplive dyret med saltvand.
14. Sygepleje og avl: Hold fisken i 28,5 ° C embryo medium (ZFIN) i 5 dage og foder 2 gange / dag. Må ikke indeholde fisk, hvis farve ikke at bo i tectum i 5 dage i eksperimentet. Bemærk: Embryo medium (EM) løsning er afgørende for fisk overlevelse og temperatur er den afgørende faktor for Dii mærkning.

3.. Wholemounting Retina Imaging

1. Læg fisken i et mørkt område i 2 timer før nethinden derlemount.
2. Bedøve fisken med isvand.
3. Punktere et hul i margenen af ​​hornhinden og lave et øje kop ved at fjerne hornhinden med venus saks.
4. Fjern objektivet, og derefter skylle centrum af nethinden med iskoldt 1x PBS.
5. Skyl kløften mellem nethinden og sclera med iskold 1x PBS, indtil der ikke pigment er tilbage.
6. Skær synsnerven på disken.
7. Hold RGC lag opad og holde nethinden med en self-made glas skeen (3A og 3B). En pipette kan også bruges til at overføre nethinden.
8. Sæt nethinden i en dråbe af iskold 30% glycerin på et dias med RGC lag opad (figur 3C).
9. Fjern glycerin og derefter flade nethinden på objektglas før opskæring nethinden i fire kvadranter (figur 3D). Holde nethinden udfoldet med RGC lag opad vil være nyttigt for udfladning nethinden.
10. Dryp isnende 50% glycerin på than nethinden til vaske væk fragmenter af pigment.
11. Fjern glycerin og så drop 20 pi iskold 75% glycerol på nethinden.
12. Dæk prøven med en 1,8 cm x 1,8 cm firkantet dækglas på.
13. Forsegl dækglasset med neglelak. Øjeblikkelig billeddannelse af nethinden anbefales.
14. Non-interlace billedet hele nethinden under en 20X objekt objektiv (NA = 0,70) med DP72 CCD (hvert billede er 1360 x 1024 pixel). Hvert felt har tre forskellige indsatsområder.
15. Udvid dybden af ​​hvert felt med værktøjet "udvidet dybdeskarphed" i softwaren.
16. Saml en virtuel nethinden med funktionen af ​​Photomerge.
17. Vælg tre felter på 680 x 512 pixel (faktiske areal er 350 um med 264 mM, 0,092 mm ²⁾ i hver retning af nethinden til at analysere gennemsnitlig tæthed af rGCS (figur 4A).
18. Anskaf område med funktionen af ​​målingerne - oprette en polygon funktion i billedetsoftware.
19. Beregn det samlede antal rGCS ved ligningen "rGCS nummer = skæbne x area" ^9.

Representative Results

Som figur 4B-D show, antallet af DII ^+-celler er to tredjedele af DAPI ^+-celler i RGCL. I en normal retina, en montage billede af hele retina (Figur 4E) viser, at DII ⁺ rGCS er fordelt over hele nethinden, men i en regenereret nethinden (fig. 4F), som rGCS i det centrale område ikke regenereres til deres mål på den første uge, kunne de ikke mærkes.

Fig. 1. Operationen apparat anvendes til retrograd mærkning af RGC. (A) Brug en svamp (a) fastsætte fisken. Driftsresultatet platform (længde er 28 cm, bredde 10 cm, højde 5 cm) og infusion rør er forbundet via en metal nål (b). Overskydende vand lagres i hulrummet (c). (B) En tæt op til metalnål. Nålen hoved er omviklet med lyshærdende obligation (d). (C) Reservoirer bruges til opbevaring MS-222 (e, længde er 6 cm, bredde 10 cm, højde er 8 cm) og saltvand (f, længde er 4 cm, bredde 10 cm, højde er 8 cm), hhv. Infusionsrøret (g) forbinder reservoiret og metalnålen.

Figur 2.. Dorsal visning af kraniet af voksne zebrafisk. (A) Intakt kranium før Rossing. Den gule stiplede linje markerer tectum; den røde stiplede linie markerer telencephalon; og den grønne stiplede linje markerer lillehjernen. (B) Skull efter hud fjernes. (C) Efter korrosion med ætsningsmiddel, kraniet er malacic og en konkav område er påpeget af pincet (hvid *). (D) Højre tectum udsættes efter kraniet fjernes. Scale er 500 & #956; m..

Figur 3.. Vigtige trin wholemounting nethinden. (A) Homebuilt glas skeen for øse nethinden, nederste billede viser det hele mening. (B) Hold nethinden med "spoon" (markeret med stiplet linie). (C) Transport nethinden i iskold 30% glycerin. ( D) Skær nethinden i 4 kvartaler Pilen angiver retningen af ​​skæring. Skalapanelerne (A) 1 mm; (BD) 500 um.

F igur 4.. Prøveudtagningen af rGCS tælle i virtuelle nethinde. (A) Skematisk visning af nethinden har fire felter (N, D, V, T felt) og hver af dem hartre felter som bliver vist i en hvid boks. Læg mærke til synsnervepapillen er normalt placeret på den ventrale-temporale orientering (sort prik). (B) Dil mærkede rGCS. (C) DAPI mærket kerne. (D) Fusioneret billede af rGCS og kerne. (E) Montage billede af hele nethinden i normal zebrafisk. (F) Montage billede, der viser regenereret nethinden efter synsnerven skade. Det centrale område af nethinden ikke mærkes som rGCS ikke regenereres til deres mål på den første uge. Forkortelser: N = nasal, D = ryg-, V = ventral, T = timelige. Skalapanelerne: 30 um (BD); 500 um (E, F).

Discussion

Retrograd mærkning af rGCS er vigtigt at forske rGCS overlevelse i pattedyr, men det har ikke været anvendt i zebrafisk. De alternative metoder, HE farvning ⁷ og antistoffarvning ^8, er ikke guld standarder for optælling rGCS nummer, og transgene linjer med alle rGCS mærket endnu ikke er blevet bygget ^{12, 13.} I denne video introducerer vi en metode til at retrograd label rGCS i nethinden af ​​voksne zebrafisk. Selvom omkring 1% af axoner rage lugtekolben eller andre områder ^14, kan denne metode mærke næsten alle rGCS i nethinden.

Da zebrafisk er for skrøbelige til at bære den fysiske skade, åbne kraniet af voksne zebrafisk med skalpel snit ³ eller en boremaskine ^{5 15.} kan medføre døden. Blødgøring kraniet med ætsningsmiddel kan minimere skader på hjernen. Ved at forsegle hullet med en lys hærdende obligation og fastsættelse det under blåt lys,fleste fisk overleve efter kirurgi. Det tager kun 12-15 minutter til at udføre operationen under dygtige operation, som er mere bekvem og effektiv i forhold til rotter og andre pattedyr ^5.

Dii væv-mærkning pasta er en lipofil farvestof. Sammenlignet med DII krystaller eller mikroinjektion af koncentrerede opløsninger, dette forbedrer indtrængningen af ​​farvestoffet ind i vævet, mærkning axoner både på og under overfladen. Derudover kan fluorescensen vare i en lang periode ^10. På den anden side er dette farvestof absorberet ved passiv transportvej, så det er nødvendigt at efterlade farvestoffet i tectum i mindst 5 dage for fuldstændig mærkning.

Zebrafisken er en fremragende model organisme af visuel regenerering. 7 dage efter synsnerven knuse næsten alle rGCS axon regenerere til tectum, men kun halvdelen af rGCS regenerere i synsnerven cut model ^9. Denne metode er en ideel måde at forske RGCs overlevelse og regeneration efter synsnerven knuse, som kunne undgå ekstra skade på synsnerven.

Vi har fremlagt en fuldstændig protokol for succes retrograd mærkningsordninger rGCS i voksen zebrafisk og måle rGCS nummer i en whole-mount nethinden. Derudover, ved anvendelse af en lyshærdende binding, vi øge overlevelsesraten for zebrafisk, hvilket gør denne fremgangsmåde mere effektiv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS222	Sigma Aldrich, USA	E10521
DiI	Invitrogen, USA	N22880
Light curing bond	Heraeus Kulzer, Germany	Durafill bond
Gluma Etch	Heraeus Kulzer, Germany	Gluma Etch 35 Gel
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co., China	Power Blue Light Curing Unit