Abstract
Als retrograde etikettering retinale ganglioncellen (RGC) kan RGC somata isoleren van stervende sites, is het uitgegroeid tot de gouden standaard voor het tellen van RGC in RGC overleving en regeneratie-experimenten. Veel studies zijn uitgevoerd bij zoogdieren te RGC overleving onderzoek na oogzenuw letsel. Echter, retrograde labeling van RGC bij volwassen zebravissen nog niet gerapporteerd, hoewel sommige alternatieve methoden celaantallen kan tellen retinale ganglioncellen lagen (RGCL). Gezien de geringe omvang van de zebravis schedel volwassen en het hoge risico op overlijden na een analyse op de schedel, de schedel openen we met behulp van zuur-etsen en sluit het gat met een lichtuitharding band, die aanzienlijk kunnen verbeteren de overlevingskansen. Nadat de absorberende kleurstoffen voor 5 dagen, zijn bijna alle gelabelde RGC. Aangezien deze methode niet nodig om de optische zenuw doorsnijden, is onvervangbaar in het onderzoek van RGC overleving na oogzenuw verpletteren in volwassen zebravissen. Hier introduceren weDeze methode stap voor stap en geven representatieve resultaten.
Introduction
Als volwassen zebravissen hebben een sterk vermogen om axonen regenereren na oogzenuw letsel 1, een goede methode om te tellen de hele RGC is essentieel voor RGC overleving en regeneratie 2 evalueren. Op basis van de methode van retrograde etikettering RGC in zoogdiercellen en goudvissen 3-5, construeerden we de methode om RGC etiketteren van de tectum bij volwassen zebravis. Voor volwassen zebravissen, moeten twee kritieke technische problemen worden opgemerkt: de schedel van volwassen zebravissen is zeer klein 6; ze leven onder water. Hier behandelen we de schedel met etsmiddel die de gevaren van het boren van 5 minimaliseert. Dan, verzegelen we het gat met licht uitharden band die dierlijke overleving verbetert na de operatie.
Voorheen werden verschillende andere technieken aangenomen RGC Aantal indirecte manieren. HE kleuring in het netvlies secties labels alle soorten cellen in het RGCL 7. Antilichaam etikettering in de hele rEtina, zoals eilandje-1, kan ook een label amacrinecellen 8. Hoewel retrograde label van de oogzenuw stomp alle RGC in het netvlies kan labelen, kan het niet worden in de crush model aangenomen, want het veroorzaakt extra schade aan de oogzenuw. Profiteren van retrograde label uit de tectum, hebben we RGC overleving en regeneratie onderzocht in oogzenuw verpletteren. Resultaten tonen aan dat bijna alle RGCs overleefd meer dan 90% van RGC geregenereerd het tectum in de eerste week van de crush model 9.
Om alle RGC succes label werd Dil pasta gekozen na vergelijking met enkele andere commerciële kleurstoffen 10. Ten eerste wordt speciaal ontworpen voor in vivo weefsel labeling. Ten tweede is een lipofiele kleurstof die niet kan diffunderen in water. Bovendien kan deze fluorescentie aanhouden lang waardoor het een uitstekende kandidaat voor RGC overleving onderzoek maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construeer de Chirurgie Apparatus
OPMERKING: Om ervoor te zorgen de vissen in leven blijft tijdens en na de operatie, infuus verdoving oplossing ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat (MS-222, of tricaïne) op een half concentratie (0,015%) met een snelheid van 1 druppel / sec door de mond van de vis met een zelfgebouwde infuus getoond in figuur 1.
- Voeg een doos zoals in figuur 1A (lengte 28 cm, breedte 10 cm, hoogte 5 cm), zet een spons (lengte 6 cm, breedte 9 cm, hoogte 4 cm) in het midden open een gap op.
- Voeg een gladde bolvormige oppervlak aan het uiteinde van de naald met licht uithardende binding (Figuur 1B) die vervolgens in de vis mond worden geplaatst. Zorg ervoor dat het oppervlak van de naald is glad aan de mond van de vis kunnen worden beschadigd.
- Voeg de helft concentratie van MS-222 (linker kamer, lengte is 6 cm, breedte is 10 cm, hoogte 8 cm) en zoutoplossing (rechterkamer, lengte 4 cm, breedte 10 cm, hoogte 8 cm) om de reservoirs zoals getoond in figuur 1C. Opmerking: Fresh MS-222 wordt aanbevolen.
- Verdoven vis in 0.03% MS-222 gedurende 2 minuten.
- Leg de vis in het gat van de spons en zet de vis met twee paar pennen, geplaatst achter de borstvin en naast de cloaca porie, respectievelijk 11.
- Sluit de vis mond, MS-222 en water voor kweken met een T buistype zoals getoond in figuur 1C.
- Zet de buis aangesloten op de MS-222.
2. Retrograde Label RGC van rechts Tectum
NB: Voorafgaand aan begin, desinfecteren alle apparaten met 70-75% ethanol, zodat er geen ethanol blijft.
- Rossing: lichtjes de huid over het hele schedel met sclerectome verwijderen (dorsale uitzicht op de schedel wordt getoond in de figuren 2A en 2B
- Clearing: was de schedel met een zoutoplossing en droog deze met oor wassen lamp.
- Initiële corrosie: roesten de schedel met het etsmiddel voor 10 sec.
- Clearing: volledig weg te vegen het etsmiddel met een wattenstaafje en daarna te wassen met een zoutoplossing en droog het.
- Bescherming: om de schedel in andere gebieden, behalve het recht tectum tegen overmatige corrosie te beschermen, dekken deze gebieden met licht uitharden obligatie-en genezen dan door blootstelling aan blauw licht met draagbare lichtbron.
- Compleet corrosie: zet het etsmiddel in het centrale gebied van de juiste tectum nogmaals volledige etsen gedurende 2 minuten. Let op: Omdat schedels van oudere vis zijn verkalkt, zal corrosie langer duren.
- Clearing: volledig weg te vegen het etsmiddel met een wattenstaafje en daarna te wassen met een zoutoplossing en droog weer.
- Schedel opening: verwijder voorzichtig de malacic schedel (figuur 2C) met een tang om de juiste tectum (figuur 2D bloot
- Clearing: veeg de slijm en bloed effusing uit het gat met stukjes gelfoam en was het met zout totdat het bloeden is gestopt.
- Dye plaatsing: zet de kleurstof (weefsel-etikettering plakken) in het geheel rechts tectum en bedek het met gelfoam.
- Scheiden: bedek de opening met een steriele schaal van hetzelfde dier.
- Afdichting: plaats lichtuitharding obligatie op de weegschaal en genezen dan met blauw licht weer gedurende 40 sec.
- Revival: was het oppervlak van de obligatie en te doen herleven van het dier met een zoutoplossing.
- Kweek en veredeling: Houd de vis in 28.5 ° C embryo medium (ZFIN) voor 5 dagen en diervoeders 2 keer / dag. Neem geen vis waarvan de kleurstof niet in slaagt om te verblijven in de tectum gedurende 5 dagen in het experiment. Opmerking: Embryo medium (EM) oplossing is van vitaal belang voor vissen overleven en de temperatuur is de belangrijkste factor voor DII etikettering.
3. Wholemounting Retina en Imaging
- Leg de vis in een donker gebied gedurende 2 uur vóór het netvlies dielemount.
- Verdoven van de vis met ijswater.
- Prik een gat in de marge van het hoornvlies en maak een oogje kop door het verwijderen van het hoornvlies met venus schaar.
- Verwijder de lens en vervolgens spoel het centrum van het netvlies met ijskoude 1x PBS.
- Spoel de kloof tussen retina en sclera met ijskoude 1x PBS tot er geen pigment wordt gelaten.
- Snijd de oogzenuw op de schijf.
- Houd het RGC laag omhoog en houd het netvlies met een zelfgemaakte glas lepel (Figuren 3A en 3B). Een druppel kan ook worden gebruikt om de retina brengen.
- Zet het netvlies in een daling van ijzige 30% glycerine op een dia met de RGC laag omhoog (Figuur 3C).
- Verwijder de glycerine en dan plat de retina op het glaasje voor het snijden netvlies in vier kwadranten (Figuur 3D). Houden van het netvlies ontvouwde met RGC laag opwaartse nuttig zijn voor het afvlakken van de retina zal zijn.
- Druppelen ijzige 50% glycerine op tHij retina weg te wassen de fragmenten van pigment.
- Verwijder de glycerine en dan vallen 20 ul ijskoude 75% glycerol aan het netvlies.
- Bedek het monster met een 1,8 cm x 1,8 cm vierkante dekglaasje.
- Dicht de dekglaasje met nagellak. Directe beeldvorming van het netvlies wordt aanbevolen.
- Afbeelding op non-interlaced het hele netvlies onder een 20X object lens (NA = 0,70) met DP72 CCD (elk beeld is 1360 x 1024 pixels). Elk veld heeft drie verschillende focussen.
- Verleng de diepte van elk veld met het instrument van "uitgebreide diepte van het veld" in de software.
- Monteer een virtuele netvlies met de functie van photomerge.
- Selecteert drie gebieden van 680 x 512 pixels (werkelijke oppervlakte is 350 urn bij 264 urn, 0.092 mm 2) in elke oriëntatie van de retina gemiddelde dichtheid van RGC (figuur 4A) geanalyseerd.
- Het verkrijgen van de zone met de functie van metingen - maak een polygoon in de opname vansoftware.
- Bereken het aantal RGCs door de vergelijking "RGC number = bestemming x area" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals Figuren 4B-D tonen het aantal Dil + cellen tweederde DAPI + cellen in RGCL. In een normale retina, een montage beeld van een hele retina (Figuur 4E) blijkt dat Dil + RGC zijn verdeeld over de gehele retina maar in een geregenereerde retina (Figuur 4F), zoals RGC in het centrale gebied zijn niet geregenereerd om hun doel te de eerste week, konden ze niet worden geëtiketteerd.
Figuur 1. De operatie apparaat voor retrograde etikettering van RGC. (A) Gebruik een spons (a) om de vis te lossen. De operationele platform (lengte is 28 cm, breedte is 10 cm, hoogte 5 cm) en infuusbuis zijn verbonden via een metalen naald (b). Overtollig water wordt opgeslagen in de holte (c). (B) Een close-up van de metalen naald. Het hoofd van de naald wordt omwikkeld met licht uithardende binding (d). (C) Reservoirs worden gebruikt voor het opslaan MS-222 (e, lengte 6 cm, breedte 10 cm, hoogte 8 cm) en zoutoplossing (f, lengte 4 cm, breedte is 10 cm, hoogte 8 cm), respectievelijk. De infusie buis (g) verbindt het reservoir en de metalen naald.
Figuur 2. Dorsaal aanzicht van de schedel van volwassen zebravissen. (A) Intact schedel voordat Rossing. De gele gestippelde lijn geeft de tectum; de rode gestippelde lijn geeft de grote hersenen; en de groene stippellijn markeert het cerebellum. (B) van de schedel na de huid verwijderd. (C) Na corrosie met etsmiddel, de schedel is malacic en een holle ruimte wordt opgemerkt door een tang (wit *). (D) Rechts tectum wordt blootgesteld nadat de schedel wordt verwijderd. Schaal is 500 & #956; m.
Figuur 3. Belangrijke stappen van wholemounting netvlies. (A) Homebuilt glas lepel voor scheppen netvlies, onderste afbeelding toont het hele uitzicht. (B) Houd het netvlies met de "lepel" (gemarkeerd met stippellijn). (C) Vervoer de retina in ijskoude 30% glycerine. ( D) Snijd het netvlies in 4/4; pijl geeft de richting van het snijden. Schaalbalken (A) 1 mm; (BD) 500 urn.
F igure 4. Het bemonsteren van RGC tellen virtuele retina. (A) Schematische weergave van het netvlies heeft vier velden (N, D, V, T-gebied) en elk van hen heeftdrie velden die worden getoond in een witte doos. Let op de optische schijf is meestal gelegen in het ventrale-temporele oriëntatie (zwarte stip). (B) Dil (E) Montage beeld van de hele retina gelabeld RGC. (C) DAPI gelabeld kern. (D) Samengevoegd beeld van RGC en kern. in normale zebravis. (F) image montage toont geregenereerd netvlies na oogzenuw letsel. Het centrale deel van het netvlies wordt niet aangeduid als RGC niet geregenereerd om hun doelen in de eerste week. Afkortingen: N = nasale, D = rug-, V = ventrale, T = tijd. Schaal bars: 30 micrometer (BD); 500 urn (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrograde etikettering van RGC is belangrijk RGC overleving onderzoek in zoogdieren, maar niet is gebruikt bij zebravis. De alternatieve werkwijzen, HE kleuring 7 en antilichaamkleuring 8, niet gouden standaard voor het tellen RGC nummer en transgene lijnen met RGC gemerkte nog niet is aangelegd 12, 13. In deze video, introduceren we een methode om label RGC retrograde in het netvlies van volwassen zebravissen. Hoewel ongeveer 1% van axonen projecteren reukkwab en andere gebieden 14, kan deze werkwijze vrijwel alle RGC etikettering in de retina.
Aangezien zebravis zijn te kwetsbaar om de fysieke schade te dragen, het openen van de schedel van de volwassen zebravissen met scalpel incisie 3 of een boor 5, 15 mei dood veroorzaken. Het verzachten van de schedel met etsmiddel kan de schade aan de hersenen te minimaliseren. Door het afdichten van het gat met een lichtuitharding obligatie en de vaststelling van het onder blauw licht,meeste vissen overleven na operatie. Het duurt slechts 12-15 minuten om de operatie uit te voeren onder bedreven operatie, die is handiger en efficiënter in vergelijking met ratten en andere zoogdieren 5.
Dii weefsel-etikettering pasta is een lipofiele kleurstof. Vergeleken met Dil kristallen of microinjectie van geconcentreerde oplossingen, dit verbetert de penetratie van de kleurstof in het weefsel, etikettering axonen zowel op als onder de oppervlakte. Bovendien kan de fluorescentie blijven gedurende lange tijd 10. Anderzijds, wordt deze kleurstof geabsorbeerd door passieve transport weg, zodat het noodzakelijk is om de kleurstof in het tectum laat ten minste 5 dagen voor volledige etikettering.
De zebravis is een uitstekend model organisme van visuele regeneratie. Op 7 dagen na oogzenuw verpletteren, bijna alle RGC axon regenereren om de tectum, maar slechts de helft van RGC regenereren in de oogzenuw cut model 9. Deze methode is een ideale manier om onderzoek RGCs overleving en regeneratie na oogzenuw verpletteren, die extra schade aan de oogzenuw kon vermijden.
We hebben een volledige protocol gepresenteerd voor succes retrograde etikettering RGC in volwassen zebravissen en het meten van het RGC nummer in een wholemount netvlies. Bovendien, met behulp van een lichtuitharding band, verhogen we de overlevingskans van de zebravis, die deze methode effectiever te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
