Abstract
Rotulagem células ganglionares da retina como retrógrados (RGCs) pode isolar CGR somata de morrer locais, tornou-se o padrão-ouro para a contagem de CGR em CGR sobrevivência e experimentos de regeneração. Muitos estudos têm sido realizados em animais mamíferos para pesquisar CGR sobrevivência após a lesão do nervo óptico. No entanto, a marcação retrógrada de CGR em peixe-zebra adulto ainda não foi relatada, embora alguns métodos alternativos pode contar o número de células em camadas da retina células ganglionares (RGCL). Considerando o pequeno tamanho do crânio adulto zebrafish eo alto risco de morte após a perfuração no crânio, abrimos o crânio com a ajuda de condicionamento ácido e selar o buraco com um vínculo de cura luz, o que pode melhorar significativamente a taxa de sobrevivência. Depois de absorver os corantes, durante 5 dias, quase todos os CGR são rotulados. Como este método não precisa transecto o nervo óptico, é insubstituível na pesquisa de CGR sobrevivência após esmagamento do nervo óptico em peixe-zebra adulto. Aqui, apresentamoseste método passo a passo e fornecer resultados representativos.
Introduction
Como adulto zebrafish tem uma forte capacidade de regenerar os axônios após a lesão do nervo óptico 1, um método apropriado para contar toda a CGR é essencial para avaliar CGR sobrevivência e regeneração 2. Baseado nos métodos de CGRs marcação retrógrada em mamíferos e peixes dourados 3-5, construímos o método para rotular CGRs do tectum em peixes-zebra adultos. Para o adulto zebrafish, duas preocupações técnicos críticos devem ser observados: o crânio de peixe-zebra adulto é muito pequena 6; eles vivem em um ambiente de água. Aqui, tratamos o crânio com etchant o que minimiza os riscos associados com a perfuração 5. Em seguida, selar o buraco com vínculo fotoativação que melhora a sobrevida dos animais após a cirurgia.
Anteriormente, foram adotadas diversas outras técnicas para contar o número CGR de forma indireta. Coloração HE nas secções de retina rótulos de todos os tipos de células no RGCL 7. Marcação de anticorpos em toda a retina, tais como ilhotas-1, também podem marcar células amacrine 8. Embora rótulo retrógrada do tronco do nervo óptico pode rotular todos os CGR na retina, não pode ser adotado no modelo de esmagamento porque provoca lesão extra para o nervo óptico. Aproveitando-se da etiqueta retrógrada do tectum, temos pesquisado CGR sobrevivência e regeneração no esmagamento do nervo óptico. Os resultados mostram que quase todas as CGRs sobreviveram e mais de 90% das CGR regenerado para o tectum na primeira semana de o modelo de esmagamento do 9.
Para rotular com sucesso todos os CGR, DII pasta foi escolhido após a comparação com vários outros corantes comerciais 10. Em primeiro lugar, é especialmente projetado para in vivo rotulagem tecido. Em segundo lugar, é um corante lipofílico que não se pode difundir na água. Além disso, essa fluorescência pode persistir por um longo período de tempo que o torna um excelente candidato para CGR investigação sobrevivência.
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Protocol
1. Construir o Aparelho Cirurgia
NOTA: Para assegurar o peixe permanece vivo durante e após a operação, a anestesia de gotejamento uma solução de acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (MS-222, ou tricaina) a uma metade da concentração (0,015%), com uma velocidade de 1 gota / seg através da boca do peixe utilizando um sistema de gotejamento homebuilt mostrado na Figura 1.
- Fazer uma caixa, como mostrado na Figura 1A (comprimento é de 28 cm, a largura é de 10 cm, a altura é de 5 cm), colocar uma esponja (comprimento é de 6 cm, a largura é de 9 cm, altura de 4 cm) no meio e abrir um lacuna nele.
- Fazer uma superfície lisa globular na extremidade da agulha, com ligação de cura de luz (Figura 1B), o que irá então ser inserido na boca de peixe. Certifique-se de que a superfície da agulha é suave para evitar que a boca do peixe seja danificada.
- Adicionar a metade da concentração de MS-222 (câmara esquerda, o comprimento é de 6 cm, largura é de 10 cm, a altura é de 8 cm) e solução salina (câmara direita, o comprimento de 4 cm, a largura é de 10 cm, a altura é de 8 cm) para os reservatórios como mostrado na Figura 1C. Nota: fresco de MS-222 é recomendado.
- Anestesiar peixes em 0,03% MS-222 por 2 min.
- Coloque o peixe na abertura da esponja e corrigir o peixe com dois pares de pinos, inserida atrás da barbatana peitoral e ao lado do poro cloacal, respectivamente 11.
- Ligue boca do peixe, o MS-222, e água, com a criação de um tubo de tipo T, como mostrado na Figura 1C.
- Ligar o tubo ligado a MS-222.
2. CGR rótulo retrógrados do Tectum Direito
NOTA: Antes de começar, desinfetar todos os aparelhos com etanol 70-75%, garantindo que nenhum etanol permanece.
- Rossing: ligeiramente remover a pele ao longo de todo o crânio com sclerectome (vista dorsal do crânio é mostrado nas Figuras 2A e 2B
- Compensação: lavar o crânio com soro fisiológico e, em seguida, seque-o com a orelha lâmpada de lavar.
- Corrosão inicial: corroer o crânio com o etchant por 10 seg.
- Compensação: limpar completamente afastado o etchant com um cotonete e, em seguida, lavar a área com soro fisiológico e seque-o.
- Proteção: a fim de proteger o crânio em outras áreas, exceto o tectum direito de excesso de corrosão, cobrir essas áreas com ligação de luz de cura e depois curá-lo pela exposição à luz azul com iluminante portátil.
- Corrosão completa: colocar o etchant na área central do tectum direita novamente para gravação completa para 2 min. Nota: Como crânios de peixes mais velhos são calcificada, corrosão vai demorar mais tempo.
- Compensação: limpar completamente afastado o etchant com um cotonete e, em seguida, lavar a área com soro fisiológico e seque-o novamente.
- Abertura Crânio: remova cuidadosamente o crânio de malacia (Figura 2C) com uma pinça para expor o tectum direita (Figura 2D
- Compensação: limpar o muco e sangue effusing do buraco com pedaços de Gelfoam e lavá-lo com soro fisiológico até que o sangramento parou.
- Colocação Dye: coloque o corante (a rotulagem tecido colar) em todo o tectum direita e cobri-lo com gelfoam.
- Segregando: cobrir o buraco com uma escala estéril do mesmo animal.
- Vedação: vínculo lugar fotopolimerizador para a escala e depois curá-lo com luz azul novamente por 40 seg.
- Revival: lavar a superfície do vínculo e reviver o animal com solução salina.
- Enfermagem e reprodução: Mantenha o peixe em 28,5 ° C médio embrião (ZFIN) durante 5 dias e alimentar 2 vezes / dia. Não incluem peixe cujo corante não ficar no tectum por 5 dias no experimento. Nota: A solução de médio Embrião (EM) é vital para a sobrevivência dos peixes e da temperatura é o fator chave para a rotulagem DII.
3. Wholemounting Retina e Imagem
- Coloque o peixe em um campo escuro por 2 horas antes de retina quelemount.
- Anestesiar os peixes com água gelada.
- Perfurar um buraco na margem da córnea e faça um copo olho, removendo a córnea com uma tesoura Vênus.
- Retire a lente e, em seguida, lave o centro da retina com gelado 1x PBS.
- Lave a lacuna entre retina ea esclera com gelado 1x PBS até que nenhum pigmento é esquerda.
- Corte o nervo óptico no disco.
- Mantenha a camada RGC para cima e mantenha a retina com uma colher de vidro self-made (Figuras 3A e 3B). Um conta-gotas também pode ser usado para transferir a retina.
- Coloque a retina em uma queda de gelo de 30% de glicerina em um slide com a camada RGC para cima (Figura 3C).
- Retire a glicerina e depois achatar a retina na lâmina antes de cortar retina em quatro quadrantes (Figura 3D). Mantendo a retina se desenrolou com camada RGC para cima será útil para achatamento da retina.
- Gotejamento gelada 50% de glicerina em tele retina para lavar os fragmentos de pigmento.
- Retirar a glicerina e em seguida gota 20 mL de gelo de 75% de glicerina na retina.
- Cobrir a amostra com 1,8 centímetros x 1,8 centímetros lamela quadrado.
- Selar a lamela com unha polonês. Recomenda imagem imediata da retina.
- Imagem não-entrelaçada toda a retina sob uma lente de objeto 20X (NA = 0,70) com DP72 CCD (cada imagem é 1360 x 1024 pixels). Cada campo tem três focos diferentes.
- Estender a profundidade de cada campo com a ferramenta de "profundidade de campo estendida" no software.
- Montar uma retina virtual com a função de photomerge.
- Escolha três campos de 680 x 512 pixels (área efectiva é de 350 mM em 264 mM, 0,092 mm 2) em cada uma orientação da retina para analisar a densidade média das CGR (Figura 4A).
- Obter a área com a função de medidas - criar um polígono na imagemsoftware.
- Calcule o número total de CGR pela equação "número de CGR = destino x área" 9.
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Representative Results
Como Figuras 4B-D mostra, o número de células DII + é de dois terços de células DAPI + em RGCL. Na retina normal, uma imagem de montagem de uma retina inteira (Figura 4E) mostra que DII + CGRs são distribuídos ao longo de toda a retina, mas em uma retina regenerada (Figura 4F), como CGRs na área central não regenerado para o seu alvo em Na primeira semana, eles não poderiam ser rotulados.
Figura 1. O aparelho utilizado para a cirurgia de marcação retrógrada do RGC. (A) Use uma esponja (a) para corrigir o peixe. A plataforma de funcionamento (comprimento é de 28 cm, a largura é de 10 cm, a altura é de 5 cm) e a infusão de tubo estão ligados através de uma agulha de metal (b). O excesso de água é armazenada na cavidade (c). (B) Um close-up para a agulha de metal. A cabeça da agulha é embrulhado com ligação a fotopolimerização (d). (C) Os reservatórios são utilizados para o armazenamento de MS-222 (e, o comprimento é de 6 cm, a largura é de 10 cm, a altura é de 8 cm) e solução salina (f, o comprimento é 4 cm, a largura é de 10 cm, a altura é de 8 cm), respectivamente. O tubo de infusão (g) liga o reservatório e a agulha de metal.
Figura 2. Vista dorsal do crânio de peixe-zebra adulto. (A) crânio intacto antes Rossing. A linha pontilhada amarela marca o tectum; a linha pontilhada vermelha marca o telencéfalo; ea linha tracejada verde marca o cerebelo. (B) Crânio após pele removida. (C) Depois de corrosão com etchant, o crânio é de malacia e uma área côncava é apontado por fórceps (branco *). (D) tectum Direito é exposta após o crânio é removido. A escala é de 500 & #956; m.
Figura 3. Etapas-chave da wholemounting retina. (A) colher vidro Homebuilt para escavar retina, a imagem inferior mostra toda a visão. (B) Segure a retina com a "colher" (marcado pela linha pontilhada). (C) Transportar o retina em gelada 30% de glicerina. ( D) Corte a retina em 4 trimestres; a seta indica a orientação de corte. Barras de escala (F) 1 mm; (BD) 500 mm.
F igura 4. Amostragem A contagem das CGR na retina virtual. (A) Representação esquemática da retina tem quatro domínios (N, D, V, T) de campo e cada um deles possuitrês campos que são mostrados em uma caixa branca. Observe o disco óptico é geralmente localizado na orientação ventral-temporal (ponto preto). (E) imagem Montagem de todo retina (B) DII rotulados CGR. (C) DAPI núcleo rotulados. (D) imagem Incorporada de CGR e núcleo. no peixe-zebra normal. (F) imagem Montagem mostrando retina regenerado após a lesão do nervo óptico. A área central da retina não é rotulado como CGRs não regenerado para os seus alvos na primeira semana. Abreviaturas: N = nasal, D = dorsal, V = ventral, T = temporal. Barras de escala: 30 mm (BD); 500 mm (E, F).
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Discussion
Marcação retrógrada das CGR é importante para a investigação CGRs sobrevivência em animais mamíferos, mas não tem sido usado em peixes-zebra. Os métodos alternativos, coloração HE 7 e coloração de anticorpos 8, não são padrões de ouro para a contagem número CGR e linhagens transgênicas com todos os CGRs marcadas ainda não foi construído 12, 13. Neste vídeo, apresentamos um método para retrógrado CGR rótulo na retina do peixe-zebra adulto. Apesar de cerca de 1% dos axónios projectar para bolbo olfactivo ou outras áreas 14, este método pode rotular quase todas as CGRs da retina.
Como peixe-zebra são muito frágeis para suportar o dano físico, abrindo o crânio de peixe-zebra adulto com bisturi incisão 3 ou uma broca de 5, 15 de pode causar a morte. Amolecimento do crânio com etchant pode minimizar os danos ao cérebro. Selando o buraco com um vínculo fotopolimerizador e corrigi-lo sob a luz azul,a maioria dos peixes sobreviver após a cirurgia. Leva apenas 12-15 minutos para realizar a cirurgia sob a operação eficiente, o que é mais conveniente e eficiente em comparação com ratos e outros animais mamíferos 5.
DII pasta rotulagem tecido é um corante lipofílico. Em comparação com os cristais DII ou microinjecção de soluções concentradas, isto melhora a penetração do corante dentro do tecido, rotulagem axónios dentro e abaixo da superfície. Além disso, a fluorescência pode persistir durante um período longo de tempo 10. Por outro lado, este corante é absorvido por via do transporte passivo, de modo que é necessário deixar o corante no tectum durante pelo menos 5 dias para rotulagem completa.
O peixe-zebra é um excelente modelo de organismo de regeneração visual. Aos 7 dias após o esmagamento do nervo óptico, quase todos os CGR axônio regenerar para o tectum, mas apenas a metade do CGR regenerar no modelo de corte do nervo óptico 9. Este método é uma maneira ideal para a investigação RGCs sobrevivência e regeneração após o esmagamento do nervo óptico, o que pode evitar lesões extra no nervo óptico.
Nós apresentamos um protocolo completo para CGR rotulagem sucesso retrógradas em peixe-zebra adulto e medir o número CGR em uma retina wholemount. Além disso, usando um laço de luz de cura, podemos aumentar a taxa de sobrevivência do peixe-zebra, o que torna este método mais eficaz.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
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