蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

Abstract

逆行性標識網膜神経節細胞（RGC）がサイトを死んでからのRGC細胞体を分離することができるように、それはのRGCの生存と再生の実験でのRGCをカウントするためのゴールドスタンダードとなっている。多くの研究は、視神経損傷後のRGC生存を検索するには哺乳類動物において行われている。いくつかの代替の方法は、網膜神経節細胞層（RGCL）で細胞数をカウントすることができますがしかし、成人のゼブラフィッシュにおけるRGCの逆行性標識はまだ報告されていない。成体ゼブラフィッシュ頭蓋骨のサイ​​ズが小さく、頭蓋骨にドリル後の死亡の高いリスクを考慮すると、我々は、酸エッチングを利用して頭蓋骨を開いて、有意に生存率を改善することができる光硬化性ボンドで穴を密封する。 5日間の染料を吸収した後、ほぼすべてのRGCをラベル付けされている。このメソッドは、視神経を横断する必要がないとして、それは大人のゼブラフィッシュにおける視神経挫滅した後のRGC生存の研究にかけがえのないです。ここではご紹介この方法ステップバイステップとは、代表的な結果を提供します。

Introduction

大人のゼブラフィッシュは、視神経損傷¹の後に軸索を再生する強力な能力を持っているように、全体のRGCをカウントするための適切な方法は、RGCを生存と再生^2を評価することが不可欠である。哺乳類や金魚³の逆行性標識のRGCの方法に基づいて^{- 5、}私たちは、大人のゼブラフィッシュにおける視蓋からのRGCを標識する方法を構築した。大人のゼブラフィッシュの場合は、2の重要な技術的な問題に注意する必要があります。大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨は^、6非常に小さい。彼らは水環境に住んでいます。ここでは^、5掘削に伴う危険を最小限に抑えることがエッチング液で頭蓋骨を扱う。その後、我々は手術後、動物の生存率を改善する光硬化性ボンドで穴を密閉する。

以前は、いくつかの他の技術は、間接的な方法でのRGCの数をカウントするために採用された。網膜切片における染色HEはRGCL ⁷内のセルのすべてのタイプのラベルを付けます。全体Rでの抗体標識このような膵島-1のようなetinaも、アマクリン細胞^8にラベル^を付けることができます。視神経の切り株から逆行標識は、網膜内のすべてのRGCにラベルを付けることができますが、それは視神経への追加として傷害の原因になりますので、それはクラッシュモデルで採用することができない。蓋から逆行ラベルを利用して、我々は視神経挫滅でのRGCの生存と再生を研究している。結果は、ほとんどすべてのRGCが生存し、RGCの90％以上がクラッシュモデル⁹の最初の週で蓋を再生成することを示している。

正常にすべてのRGCを標識するために、DiIをペーストは、他のいくつかの市販の染料¹⁰との比較後に選択されました。第一に、これは特にin vivoでの組織標識のために設計されている。第二に、それは、水に拡散することができない、親油性染料である。さらに、この蛍光はそれのRGC生存研究のための優れた候補になり、長時間持続することができます。

Protocol

1。手術装置を構成

注：操作中と後の魚が生きたまま確保するために、魚の口から1滴/秒の速度で半分濃度（0.015％）の点滴麻酔液の3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（MS-222、またはトリカイン） 図1に示される手製のドリップシステムを用いて。

1. 図1（a）に示すようにボックスを作る（長28センチ、幅は10cmで、高さは5cmである）、途中で（長さが6cmで、幅9センチ、高さ4センチ）のスポンジを入れて開くその上にギャップ。
2. その後、魚の口の中に挿入される光硬化性結合（ 図1B）と針の端部に、滑らかな球状の面を作成します。針の表面が損傷される魚の口を防ぐために、滑らかであることを確認してください。
3. MS-222の半分の濃度を追加します（左室、長さが6cmで、幅は10℃ですM、高さは8cmで）と生理食塩水（右室は、長さは、図1（c）に示すように高さが貯水池に）8cmで、幅は10cmで、4センチメートルです。注意：新鮮MS-222をお勧めします。
4. 2分間の0.03％のMS-222で魚を麻酔。
5. スポンジの隙間に魚を置き、胸びれの後ろに、それぞれ総排泄毛穴^、11の横に挿入されたピンの2組、魚を修正。
6. 魚の口に接続し、MS-222、及び図1Cに示すように、T型チューブで水を飼育。
7. MS-222に接続されたチューブをオンにします。

右蓋から2。レトログラードラベルのRGC

注：以前は頭にありませんが、エタノールが残っていないことを確実に70〜75％エタノールで全ての機器を消毒する。

1. Rossing：ややsclerectomeで全体の頭蓋骨を覆う皮膚を取り除く（頭蓋骨の背ビューは、 図2Aおよび2Bに示されている
2. クリア：生理食塩水で頭蓋骨を洗ってから耳の洗濯電球でそれを乾燥させます。
3. 初期の腐食：10秒間エッチング剤で頭蓋骨を腐食。
4. クリア：完全に綿棒でエッチング液を乾いた布で拭き取ってくださいして、生理食塩水で領域を洗って乾燥させます。
5. 保護：過剰な腐食から右蓋を除く他の領域の頭蓋骨を保護するために、光硬化結合を有​​するこれらの領域をカバーし、次に携帯型光源と、青色光への曝露によってそれを硬化させる。
6. 完全な腐食：2分のための完全なエッチングに再び右蓋の中央部にエッチング液を入れる。注意：古い魚の頭蓋骨が石灰化しているため、腐食は時間がかかります。
7. クリア：完全に綿棒でエッチング液を乾いた布で拭き取ってくださいして、生理食塩水で領域を洗って、再度乾燥させます。
8. 頭蓋骨の開口部：慎重に右の蓋（ 図2Dを公開する鉗子でmalacic頭蓋骨（ 図2C）を削除
9. クリア：ゲルフォームの破片で穴から粘液や血液放散を拭いて、出血が停止するまでの生理食塩水で洗って。
10. 色素の配置：全体右蓋に色素（組織標識ペースト）入れて、ゲルフォームでそれをカバーしています。
11. 分離：同じ動物から無菌規模で穴をカバーしています。
12. スケール上の場所光硬​​化結合をし、次いで40秒間再度、青色光でそれを硬化：シール。
13. 復活：債券の表面を洗浄し、生理食塩水で動物を復活させる。
14. 看護や繁殖：5日間、28.5℃の胚培地（ZFIN）で魚を保持し、2回/日を養う。その色素の実験で5日間、蓋に滞在しなかった魚が含まれていません。注：胚培地（EM）ソリューションは、魚の生存に不可欠であり、温度がDiIを標識するための重要な要素です。

3。Wholemounting網膜とイメージング

1. 誰が網膜の前に2時間、暗視野に魚を置きますlemount。
2. 氷水で魚を麻酔。
3. 角膜の余白に穴を穿刺し、金星はさみで角膜を除去することにより、アイカップを作る。
4. レンズを外した後、氷冷した1×PBSで網膜の中心をフラッシュします。
5. 何顔料がなくなるまで、氷冷1X PBSで網膜と強膜との間のギャップをフラッシュします。
6. ディスクで視神経を切った。
7. 上向きのRGC層を維持し、自作のガラススプーン（ 図3Aと図3B）で網膜を開催しています。ドロッパーはまた、網膜を転送するために使用することができる。
8. 上向きのRGC層とスライド上の氷の30％のグリセリン（ 図3C）の低下に網膜を置く。
9. グリセリンを外し、4象限（ 図3D）に網膜をカットする前に、スライドガラス上に網膜を平らに。上向きのRGC層で繰り広げ網膜に保つことは、網膜を平坦化するための参考になります。
10. T ONドリップ氷の50％のグリセリン彼は、顔料の断片を洗い流し網膜。
11. グリセリンを削除して網膜上に氷のような75％のグリセリン20μlのドロップします。
12. 1.8センチメートルX 1.8センチメートル四角いカバーガラスでサンプルをカバーしています。
13. マニキュアでカバーガラスをシール。網膜の即時画像化することをお勧めします。
14. ノンインタレース画像DP72 CCD（各画像は1360×1024ピクセルです）で20倍の対物レンズ（NA = 0.70）の下で全体の網膜。各フィールドは、3つの異なる焦点を持っています。
15. ソフトウェアの「拡張被写界深度」のツールでそれぞれの被写界深度を拡張します。
16. Photomergeの機能を備えた仮想網膜を組み立てる。
17. RGCの平均密度（ 図4A）を分析するために、網膜の各方位の680×512ピクセルの3つのフィールド（実際の面積は0.092ミリメートル^2、264ミクロン350ミクロンである）を選択します。
18. 測定値の関数で領域を得る - 画像内のポリゴンフィーチャを作成するソフトウェア。
19. 式でRGCの総数を計算する」のRGC数=運命のX領域^」9。

Representative Results

図4B-Dが示すように 、のDiI ⁺細胞の数は、RGCLにおけるDAPI ⁺細胞の三分の二である。通常の網膜では、全体の網膜（ 図4E）のモンタージュ画像は中央エリアでのRGCがで彼らのターゲットに再生成されていないようにDiI ⁺のRGCは、網膜全体にわたってますが、再生された網膜（ 図4F）に分布していることを示してい最初の週、彼らは標識することができませんでした。

図1。RGCの逆行性標識に使用手術装置。 （A）（a）の魚を修正するためにスポンジを使用してください。オペレーティングプラットフォーム（長さは高さが5cmで、幅が10cmで、28センチ）及び注入チューブは、金属針の（b）を介して接続されている。金属針のための余分な水がキャビティ（c）に格納されている。（B）接写。針の頭部は、（C）タンクはMS-222を格納するために使用される。光硬化性ボンドの（d）でラップ（電子、長さは高さが8cmで、幅が10cmで、6cmで）及び食塩水（メス、長さが4であるセンチメートル、幅はそれぞれ）の高さが8cmで、10cmである。輸液チューブ（g）は、リザーバと金属針を接続する。

図2。大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨の背面図。 rossing（a）の前に無傷の頭骨。黄色の点線は蓋をマーク。赤い点線は終脳をマーク。と緑の点線は小脳をマークします。（B）スカル摘出皮膚の後に。（C）エッチング液で腐食した後、頭蓋骨はmalacicで、凹面領域は鉗子（白*）によって指摘されている。（D）右蓋が露出している頭蓋骨を除去した後。スケールは500＆＃です956;メートル。

図3。網膜wholemountingの重要なステップ。 （A）網膜をすくうための自作ガラススプーン、一番下の画像は、全体図を示している。（B）（点線でマークされた）「スプーン」で網膜を持ちます。（C）を氷冷30％グリセリンに網膜に移送します。（ D）4分の4に網膜をカット。矢印は、切断の方向を示している。スケールバー（A）1ミリメートル; （BD）500μmである。

F igure 4。仮想網膜におけるRGCの計数サンプリング（A）網膜の概念図は、4つのフィールド（N、D、V、Tフィールド）を有し、それらの各々が有している白いボックスに表示される3つのフィールド。視神経乳頭は通常、腹側頭の向き（黒い点）に位置して注意してください。（B）のDiIのRGCを標識した（C）DAPIラベルの核。たRGCと核の（D）の合併画像 ​​。全体網膜の（E）のモンタージュ画像を視神経損傷後の再生された網膜を示す正常なゼブラフィッシュ。（F）モンタージュ画像。 RGCは、最初の週で彼らのターゲットに再生成されていないとして、網膜の中央部分が標識されていません。略語：N =鼻、D =背V =腹側、T =時間的。スケールバー：30μmの（BD）; 500ミクロン（E、F）。

Discussion

RGCの逆行性標識は、哺乳類動物でのRGCの生存を研究することは重要であるが、それはゼブラフィッシュで使用されていなかった。代替の方法は、彼が⁷と抗体染色^8染色 、ラベルされたすべてのRGCでのRGC番号、およびトランスジェニック系統をカウントするための金規定するものではありません、まだ^12、13を構築されていません。このビデオでは、大人のゼブラフィッシュの網膜のラベルのRGCを逆行させる方法をご紹介します。嗅球または他の領域¹⁴への軸索のプロジェクトの約1％でも、この方法では、網膜のほぼすべてのRGCにラベルを付けることができます。

ゼブラフィッシュは、メス切開³やドリル^5、15大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨を開いて、けがを負わないほど壊れやすいように、死を引き起こす可能性があります。エッチング液で頭蓋骨を柔らかくすることは、脳への損傷を最小限に抑えることができます。光硬化性ボンドで穴を密閉し、青色光の下でそれを固定することで、ほとんどの魚は、手術後に生き残る。これは、ラットおよび他の哺乳動物⁵と比較して、より便利で効率的である、熟練した操作条件下で手術を行うために12〜15分を要するのみ。

DiIで組織標識ペーストは親油性の染料である。のDiI結晶または濃縮された溶液のマイクロインジェクションと比較すると、これは、両方の上や表面の下に軸索を標識し、組織内への染料の浸透を向上させます。さらに、蛍光は長時間¹⁰持続することができます。一方、この色素は、受動輸送経路によって吸収するので、完全な標識化のため、少なくとも5日間、蓋に染料を残す必要がある。

ゼブラフィッシュは、視覚的な再生の優れたモデル生物である。視神経挫滅後7日目で、ほぼすべてのRGCを蓋に再生した軸索が、RGCの半分のみが視神経カットモデル⁹に再生成します。このメソッドは、RGCを研究するための理想的な方法ですS視神経に余分な怪我を避けることができ視神経挫滅、後の生存と再生。

私たちは、大人のゼブラフィッシュで正常に逆行性標識のRGCをのための完全なプロトコルを発表し、ホールマウント網膜でのRGCの数を測定しました。さらに、光硬化性ボンドを使用することにより、我々は、この方法はより効果的なゼブラフィッシュの生存率を増加させる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS222	Sigma Aldrich, USA	E10521
DiI	Invitrogen, USA	N22880
Light curing bond	Heraeus Kulzer, Germany	Durafill bond
Gluma Etch	Heraeus Kulzer, Germany	Gluma Etch 35 Gel
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co., China	Power Blue Light Curing Unit