Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

المستوحدة الليستيريا هو الممرض الجرثومي موجبة الجرام كثيرا ما تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة التطفل داخل الخلايا. التصوير أواخر L. المستوحدة مراحل العدوى في سياق شاشات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة يسمح للدراسة عالمية من مسارات الخلوية اللازمة لعدوى بكتيرية من الخلايا المضيفة الهدف.

Abstract

يمكن تصور مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الجزيئية كأدوات لتشريح شلالات الإشارات الخلوية وذلك بسبب قدرتها على التعامل بشكل رائع وتخريب وظائف الخلية التي هي المطلوبة لإصابة الأنسجة المستهدفة المضيف. بين هذه الجراثيم البكتيرية، المستوحدة الليستيريا هو الكائنات الحية الدقيقة موجبة الجرام التي تم استخدامها كنموذج للالتطفل داخل الخلايا في توصيف الاستجابات المناعية الخلوية، والتي لعبت أدوارا مفيدة في اكتشاف مسارات الجزيئية التي تتحكم في هيكل الخلية وغشاء ديناميات الاتجار. في هذه المقالة، ونحن تصف فحص مجهري قوية للكشف عن المراحل المتأخرة من العدوى الخلوية L. المستوحدة على أساس وضع العلامات الفلورية من InlC، وهو بروتين يفرز البكتيريا التي تتراكم في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، ويمكن أن يقترن هذا الفحص للمشاريع الصغيرة بالتدخل RNA شاشات عالية الإنتاجية الآلي من أجل شارacterize مسارات الإشارات الخلوية المشاركين في أعلى أو أسفل التنظيم من العدوى.

Introduction

البكتيريا موجبة الجرام المستوحدة الليستيريا هو الممرض المنقولة عن طريق الأغذية التي تغزو الخلايا المضيفة، يعطل فجوة الداخلي ويتكاثر في سيتوبلازم الخلايا المضيفة 1. L. المستوحدة سهولة التلاعب في سياق مختبر (النمو السريع، وسمية منخفضة بالنسبة للأفراد الأصحاء) المرتبطة استمرار الصفات الفوعة البكتيرية التي لوحظت في النماذج الخلوية والحيوانية (النشاط الانحلالي، زيادة عدد الكريات البيضاء) يسمح استخدام الأولي في 1960s كنموذج رئيسي ل دراسة التطفل داخل الخلايا ولإنشاء الأسس النظرية من المناعة الخلوية ضد العدوى 2. في أواخر 1980s وأوائل 1990s، وتشريح الخلايا البكتيرية دورة 3 وكذلك التوصيف الجزيئي للبكتيريا الفوعة أهم عوامل 4-7 يفضل استخدام L. المستوحدة كأداة جزيئية أساسية للتلاعب وعشيقذ من وظائف الخلية المضيفة. وجود الفوعة (L. innocua) وخبيثة (المستوحدة L.) الأنواع في جنس الليستيريا مهدت الطريق لدراسات الجينوم المقارن 8 التي، جنبا إلى جنب مع إنشاء الأخيرة لL. كاملة المستوحدة Transcriptome على 9، زادت فهمنا للتطور L. المستوحدة كما الممرض الإنسان وكنظام نموذج للعدوى يدرس 10.

المستوحدة L. يدفع تدخيل حيز الخلايا المضيفة على تفاعل البروتينات السطحية البكتيرية InlA وInlB مع مستقبلات الخلايا المضيفة E-كادهيرين والتقى على التوالي 11-12. أدت الدراسات القائمة على المرشح الأولي لتحديد الرابط catenins-الأكتين α / β باعتبارها عنصرا هاما من مسار InlA الغزو و13 من فسفوإينوزيتيد 3 كيناز (PI 3-K) باعتباره المستجيب تنتقد InlB- تعتمد الغزو كاسكادي 14-15. يسمح فحوصات البروتين ومقرها ظيفية في وقت لاحق تحديد عناصر هيكل الخلية رواية 16 ورسله الثانية من المادة الدهنية 17 المطلوبة لغزو الخلية المضيفة. وتسلط الدراسات النسخي 18 و المستندة إلى مطياف الكتلة الكمي البروتيوميات 19 مؤخرا ضوءا جديدا بشأن تفعيل المضيف يشير شلالات وقمع الاستجابات المناعية خلال L. المستوحدة العدوى. نهج بيولوجيا النظم القائمة على تعطيل مجموعات كبيرة من الجينات (kinomes، الجينوم الكامل) عن طريق الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) إسكات قد فتحت مؤخرا آفاقا جديدة لتحليل المضيف العالمية يشير شلالات في سياق الوظائف الخلوية محددة، بما في ذلك البلعمة و الممرض استيعاب 20. شاشات سيرنا على نطاق الجينوم وقد أجريت سابقا للتحقيق شلالات الخلوية اللازمة لإصابة L. المستوحدة في أكلة ذبابة الفاكهة 21-22، ولكن لم يتم تنفيذ هذا النوع من التحليل في الخلايا غير البلعمية، والتي تمثل أهدافا حاسمة للعدوى في الجسم الحي.

لدينا بروتوكول الأمثل للكشف المجهري من المراحل المتأخرة من العدوى عن طريق L. المستوحدة التي تناسب دراسات الإنتاجية العالية سيرنا من دخول البكتيريا داخل الخلايا الظهارية. لدينا فحص يستفيد من L. الغازية للغاية المستوحدة السلالة التي يمثل طفرة نقطة في PrfA، المنظم الرئيسي للالنسخي L. المستوحدة عوامل الفوعة 6: هذه الطفرة (اسمه PrfA *) يجعل PrfA نشطة جوهري 23 ويؤدي إلى زيادة تعبير من البروتينات الغزو InlA وInlB، وبالتالي تفضيل دخول البكتيريا في الخلايا غير المصابة إلا أكلة سيئة. ويستند لدينا قراءات للعدوى على الكشف عن تراكم عصاري خلوي من البروتين يفرز البكتيرية InlC: هذا هو جزيءوالمستجيب عديد المظاهر التي يعبر عنها بشكل تفضيلي من قبل داخل هيولي L. المستوحدة 9 والتي تشارك ليس فقط في الخلية الخلية الى البكتيرية تنتشر 24 ولكن الذي ينظم أيضا المضيف الاستجابات المناعية 25. وضع العلامات الفلورية إفراز InlC من البكتيريا داخل الخلايا يسمح ليس فقط لتميز بوضوح المصابة من الخلايا غير المصابة، ولكن أيضا يمثل قراءات نقطة النهاية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لتشريح العدوى في خطواتها مختلفة: الدخول، والهروب فجوي، عصاري خلوي البكتيرية انتشار وانتشار الخلية الى خلية. يمكن أن يقترن هذا البروتوكول القائم على الفحص المجهري لشاشات سيرنا بالتالي لدراسة مسارات الخلوية تشارك في إصابة الخلايا المضيفة التي كتبها L. المستوحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافات إعداد الخلوية والبكتيرية، أدوات ترنسفكأيشن والأجسام المضادة الأولية

  1. إعداد لوحة آغار جديدة لعزل الفرد L. المستوحدة المستعمرات من الأسهم الجلسرين البكتيرية (50٪ glycerol/50٪ المشبعة البكتيرية الثقافة بين عشية وضحاها السائل) يحتفظ بها في -80 درجة مئوية.
    1. باستخدام الألومنيوم رف (الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية) لنقل الأسهم المجمدة الجلسرين البكتيرية، والبكتيريا متتالية على القلب ضخ الدماغ (بهي) لوحة أجار.
    2. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال 48 ساعة (أو حتى المستعمرات البكتيرية الفردية يمكن أن تكون معزولة).
    3. الحفاظ على هذا العمل بعد ذلك لوحة في 4 درجات مئوية خلال فترة أقصاها شهر 1 (سيتم استخدامه على البذور الثقافات السائل).
    4. في بروتوكول لدينا، ونحن نستخدم L. المستوحدة المصلي 1/2â EGDe.PrfA * السلالة، ولكن كما هو موضح في الشكل 1، وL. المستوحدة المصلي 4B P14.PrfA * سلالة يعطي نتائج مماثلة.
  2. هوتزرع الخلايا CCL2 لا ATCC في Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في غياب المضادات الحيوية.
  3. حمامات مستقلة عن تدافعت (السيطرة) ويتم تحميل مكافحة الأرصاد الرناوات siRNAs باللون الأسود 384 جيدا لوحات زراعة الخلايا المجهري.
    1. تمييع 160 بمول من سيرنا في 500 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه وإضافة 5 ميكرولتر من هذا الحل لكل بئر (تركيز النهائي: 1.6 بمول).
    2. إبقاء هذه اللوحة في -20 درجة مئوية لمدة أقصاها سنة 1.
  4. الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل ضد البروتين البكتيري InlC قد تم الحصول عليها عن طريق التحصين باستخدام البروتين المؤتلف InlC-GST كما هو موضح سابقا 25.

2. عكس سيرنا ترنسفكأيشن الخلية

  1. 72 ساعة قبل الإصابة تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة السوداء 384 جيدا لوحة الثقافة التي تحتوي على الخلايا المجهري 1.6 بمول سيرنا في 5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه في كل بئر.
  2. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 3 دقائق في 300إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة لاسقاط سيرنا التي كان يمكن المودعة في جدران الآبار.
  3. إعداد درجة حرارة الغرفة DMEM تستكمل مع 0.4٪ Lipofectamine RNAiMAX.
  4. إضافة 25 ميكرولتر من ترنسفكأيشن المتوسطة DMEM / RNAiMAX إلى كل بئر (لا احتضان المتوسطة ترنسفكأيشن أطول من 20 دقيقة قبل إضافته إلى سيرنا).
  5. نقل لوحة ذهابا وإيابا لمزج سيرنا مع الحل ترنسفكأيشن، ثم الحفاظ على لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجمعات سيرنا Lipofectamine لتشكيل.
  6. غسل الخلايا هيلا من قارورة-متموجة أو خلية ثقافة فرعية متكدسة مرة واحدة مع 10 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت.
  7. فصل خلايا هيلا بإضافة 1 مل 37 درجة مئوية prewarmed التربسين إلى قارورة زراعة الخلايا واحتضان لمدة 3 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل 37 درجة مئوية prewarmed DMEM تستكمل مع FBS 16٪.
  9. عد الخلايا وإعداد تعليق خلية من خلايا 12،000 لكل مل في DMEM تستكمل مع16٪ FBS.
  10. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر في لوحة 384 جيدا.
  11. نقل لوحة بسرعة ذهابا وإيابا لتوزيع الخلايا والسماح خلايا يستقر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. ختم لوحة مع parafilm والحفاظ عليه لمدة 72 ساعة في ترطيب 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.

3. العدوى الخلوية وتلطيخ

  1. قبل يوم من العدوى، واتخاذ مستعمرة واحدة من L. المستوحدة من لوحة بهي أجار و resuspend في 5 مل من السائل بهي المتوسطة في أنبوب البوليسترين 15 مل.
  2. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جهاز التسكع للسماح لنمو البكتيريا.
  3. يوم من العدوى، وغسل 1 مل من L. بين عشية وضحاها المستوحدة الثقافة بواسطة الطرد المركزي 2 دقيقة في إطار التعاون الإقليمي على 10،600 جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة.
  4. تجاهل طاف (الذي يحتوي على ذيفان خلوي يفرز listeriolysin O) وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (repeaر الخطوة الغسيل 3 مرات أكثر).
  5. قراءة الكثافة الضوئية البكتيرية في 600 نانومتر وتقدير عدد البكتيريا (OD = 1 ما يعادل 1E9 البكتيريا / مل).
  6. إعداد L. كافية المستوحدة التخفيف في DMEM تستكمل مع 1٪ FBS: باستخدام سلالات الغازية للغاية مثل EGDe.PrfA *، نقترح استخدام البكتيريا 5E4 في 30 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر (ويقدر تعدد العدوى إلى 25 ل 2،000 الخلايا).
  7. إزالة مستنبت خلية في كل بئر (80 ميكرولتر) واستبداله بإضافة 30 ميكرولتر من L. المستوحدة المحتوية على المتوسط.
  8. أجهزة الطرد المركزي لوحة في إطار التعاون الإقليمي 200 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لمزامنة عملية العدوى.
  9. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في ترطيب 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في كتلة الألومنيوم prewarmed.
  10. إزالة L. المستوحدة التي تحتوي على المتوسطة من كل بئر وإضافة 30 ميكرولتر من DMEM prewarmed تستكمل مع FBS 10٪ و40 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل خارج الخلية L. المستوحدة.
  11. احتضان لمدة 4 ساعات في 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية على كتلة معدنية prewarmed.
  12. تحضير محلول PBS تستكمل مع 8٪ الفورمالديهايد (ينبغي إعداد هذا الحل الطازجة بحيث مونومرات الفورمالديهايد، بدلا من البوليمرات امتصاص العرق، وتستخدم).
  13. دون التخلص من مستنبت الخلايا، إضافة 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 8٪ الفورمالديهايد (تركيز النهائي: 4٪)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  14. إزالة تثبيتي، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (إبقاء الخلايا في الحجم النهائي من 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر).
  15. إعداد 1:250 التخفيف من أرنب المضادة للInlC مصل في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.2٪ سابونين.
  16. إضافة 10 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر بعد إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  17. تجاهل الابتدائيحل الأجسام المضادة وغسل أربع مرات مع 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
  18. تمييع الثانوية اليكسا فلور 546 الضد يقترن-المضادة للأرنب (1:250)، والحل دابي (1:1،500) وphalloidin-Dy647 (1:150) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.2٪ سابونين.
  19. إضافة 10 ميكرولتر من هذا الحل تلطيخ الثانوية إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  20. تجاهل الحل تلطيخ الثانوية وغسل أربع مرات مع 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (ترك الحجم النهائي من 40 ميكرولتر في كل بئر وختم لوحة).
  21. لوحة يمكن تصويرها على الفور أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء (مع تغطية احباط الألومنيوم) لتحليلها لاحقا.

4. الحصول على الصور والتحليل

  1. الحصول على صور في ثلاث قنوات مختلفة (350 نانومتر، 546 نانومتر و 647 نانومتر) باستخدام الهدف 10X شنت على المجهر الآلي (اكتساب تفضيلي 9 صور لكل بئر).
  2. ويمكن قياس إشارة InlC باستخدام صورةبرامج التحليل مثل CellProfiler التي تسمح تجزئة الآلي من النوى وأجسام الخلايا باستخدام دابي وتلطيخ phalloidin، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وضع العلامات الفلورية من حشوية InlC يوفر قراءات قوية للعدوى الخلية L. المستوحدة، كما هو موضح في الشكل رقم 1: الخلية المركزية في صورة مجهرية مصاب كبير من قبل سلالة P14.PrfA * 23 كما يمكن ملاحظتها في مرحلة تباين الصورة (النصال، 1A الشكل) ويتم تأكيد ذلك من خلال إشارة دابي حيث البكتيريا الفردية يمكن تمييزها بوضوح (الشكل 1B). تلطيخ InlC (متراكبة إلى تلطيخ دابي في الشكل 1C) يصور كيف أن هذا البروتين يفرز يتراكم بكثافة في العصارة الخلوية للخلايا المصابة ويسمح الكشف لا لبس فيه من مصاب التشكل الخلية المضيفة. تلطيخ من الهيكل الخلوي الأكتين مع phalloidin الفلورسنت (الشكل 1D) يوفر معلومات بشأن التشكل من أحادي الطبقة الخلوية تلقيح كاملة ويوضح كذلك كيف المجاورة غير المصابة الخلايا (نواة الخلية التي تحمل علامة النجمة) دس لا يتم عرض أي وضع العلامات InlC. ومن الجدير بالذكر أنه منذ مستويات عصاري خلوي InlC تعتمد على عدد من البكتيريا حشوية، لاحظنا وجود ارتباط بين إشارة InlC الكشف عنها بواسطة المناعي وعدد L. المستوحدة لكل خلية: كما لوحظ في الشكل 1، والخلايا المجاورة بالعدوى البكتيرية مع الأرقام المنخفضة عرض تلطيخ InlC خفضت التي يمكن قياسها كميا. ومن المثير للاهتمام، فمن الممكن أيضا أن نلاحظ أن InlC يتم الكشف بسهولة في نتوءات تشكلت من قبل البكتيريا وقعوا في عملية انتشار الخلايا الى خلية (الشكل 1C) كما لوحظ أيضا مع تلطيخ الأكتين (1D الشكل). من المذكرة، ليست ملطخة البكتيريا مباشرة في بروتوكول لدينا ولكن لأنه لا يتم استخدام القناة 488 نانومتر، L. المستوحدة يمكن أن توصف باستخدام المصل المضاد للبكتيريا معينة، وإلا، يمكن بدلا من ذلك البكتيريا، معربا عن GFP استخدامها.

باستخدام أدوات تحليل التصوير مثل رانه البرنامج العام CellProfiler (معهد واسع، www.cellprofiler.org )، فمن الممكن أن الخلايا قطاع وقياس إشارة InlC في الخلايا المصابة الفردية، والتي يمكن استخدامها لتقدير مؤشر العدوى لحالة تجريبية محددة. كما هو مبين في الشكل 2، ووضع العلامات من نوى مع دابي (الشكل 2A) والهيكل الخلوي الأكتين مع phalloidin (الشكل 2C) توفير المعلومات اللازمة للتجزئة الخلوية: يتم استخدام النوى ككائنات مرجعية لتحديد الخلايا الفردية (الشكل 2B) ويتم التعرف على السيتوبلازم بعد ذلك باستخدام دالة انتشار من نوى أن يأخذ بعين الاعتبار إشارة هيكل الخلية (الشكل 2D). وأخيرا، فإن شدة إشارة InlC يمكن قياسها كميا لكل كائن الخلوية التي تم تحديدها (أرقام 2E و2F) لتقدير عدد منالخلايا المصابة من خلال تحديد الحد الأدنى لشدة InlC التي نعتبرها سلبية. يتم حساب مؤشر العدوى حيث وصل عدد الخلايا المصابة مقسوما على العدد الكلي للخلايا في عدد السكان.

يمكن أن يقترن بروتوكول لدينا لشاشات سيرنا للتحقيق وظيفة من لوحات كبيرة من الجزيئات المستهدفة في إصابة الخلايا المضيفة التي كتبها L. المستوحدة. ومن الضروري وضع ضوابط للتحقق من صحة كفاءة ترنسفكأيشن: على سبيل المثال، سيرنا استهداف Kif11 هو التحكم المستخدمة عادة لترنسفكأيشن الذي يؤدي إلى موت الخلايا، وبالتالي فإن عدم وجود خلايا في نهاية الفحص هو إشارة إلى أن ترنسفكأيشن شرع بكفاءة. للتصدي تحديدا L. المستوحدة عملية الغزو، سيرنا تثبيط مستقبلات الخلوية اجتمع في خلايا هيلا يؤدي إلى تثبيط كبير لدخول البكتيريا إلى الخلايا المضيفة ويؤدي إلى مستويات منخفضة جدا من الخلايا InlC إيجابية في أحادي الطبقة الخلوية تلقيح (الشكل3A) بالمقارنة مع الخلايا المعالجة مع جهاز تحكم سيرنا المخفوق (الشكل 3B). يمكن التحقيق وظيفة مرشح جزيئات غير معروفة لدينا مع فحص باستخدام هذا الجزيء الخلية المعروفة باسم القياسية.

الشكل 1
الشكل 1. الكشف عن وضع العلامات InlC في خلايا هيلا المصابين L. المستوحدة سلالة P14.PrfA *. قد اصيبوا بالعدوى خلايا هيلا CCL2 كما هو موضح في بروتوكول لدينا، وتجهيزها للالمناعي وتصويرها باستخدام الهدف 63X. (أ) صورة المرحلة المقابل، أشارت عدة P14.PrfA * البكتيريا عن طريق النصال. (B) تلطيخ دابي (الأزرق)، وصفت نفس البكتيريا الفردية كما هو الحال في (A) من قبل النصال. (C) تراكب من تلطيخ دابي (الأزرق) وInlC تلطيخ (الحمراء)، وصفت نوى الخلايا غير المصابة بعلامة النجمة. (D) تراكب من InlC (الحمراء) وأكتين (الأخضر) الإشارات. شريط: 5 ميكرون انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. تحليل تجزئة من خلايا هيلا المصابين L. المستوحدة سلالة EGDe.PrfA *. أصيب خلايا هيلا CCL2 كما هو موضح في بروتوكول لدينا، وتجهيزها للالمناعي وتصويرها باستخدام الهدف 10X. (A) إشارة دابي. (B) تراكب إشارة دابي (الأزرق) في عرض (A) وإشارة أكتين (الحمراء) في عرض (C) تبين تجزئة النوى (السادسمصريات الموسع أقحم). (C) إشارة أكتين. (D) نفس الصورة مثل (B) تبين تجزئة الخلايا. (E) InlC الإشارة. (F) نفس الصورة مثل (D) مع تراكب تلطيخ InlC (الصفراء). شريط: 50 ميكرون انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. . الاختلاف من وضع العلامات InlC بين الخلايا المعطل للميت وخلايا السيطرة خلايا هيلا CCL2 كانت البداية عكس transfected مع مجموعة من أربعة الرناوات siRNAs تستهدف مستقبلات الخلية المضيفة يتحقق؛ 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، أصيب الخلايا كما هو موضح، وتجهيزها للالمناعي و تصوير باستخدام كائن 10Xإيف. (A) تراكب من دابي (الأزرق)، الأكتين (الحمراء) وInlC (الصفراء) في الخلايا المعطل لالأرصاد الجوية. (ب) نفس القنوات في (A) بشأن الخلايا تعامل مع عنصر تحكم سيرنا المخفوق. شريط: 50 ميكرون انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العديد من المعلمات حاسمة لنجاح لدينا بروتوكول InlC الكشف، بما في ذلك استخدام خطوط الخلايا السليمة عرض على السيتوبلازم كبيرة بما فيه الكفاية للسماح الكشف لا لبس فيه للإشارة InlC. في مقايسة نقدم في هذه المقالة نقترح استخدام خلايا هيلا CCL2، والتي هي مناسبة بشكل خاص لفحص لدينا بسبب تمديد حيزها عصاري خلوي؛ استنساخ هيلا أخرى مثل خلايا هيلا كيوتو عرض السيتوبلازم أصغر ولكن يمكن استخدامها مع بروتوكول العدوى لدينا (خلايا هيلا كيوتو بشكل خاص مهيأة للتحليل تجزئة منذ الخلايا لا تتداخل مع الخلايا المجاورة، كما هو الحال بالنسبة للخلايا هيلا CCL2 في كثير من الأحيان). لا ينصح الخلايا تقديم السيتوبلازم صغيرة جدا مثل خلايا النوى أو الضامة، لاستخدامها في تركيبة مع بروتوكول لدينا.

وجود قيود على بروتوكول التصوير بوصفها واحدة نقدم هنا هو حقيقة أن كمية ضئيلة من الخلايا ينبغي infeالمديرية، في أحادي الطبقة بالنظر في ظروف السيطرة، من أجل توفير النظام مع ما يكفي من القوة إسترخائي: خلاف ذلك، إذا يصاب عدد قليل من الخلايا، ويصبح من الصعب تحديد التغيرات في معدلات الإصابة، وخاصة عند التحقيق في وظيفة من المرشحين المحتملين الجزيئية التي هي المتوقع للحد من العدوى. يمثل هذا القيد مشكلة حقيقية عند استخدام خلايا هيلا والتي تعبر يتحقق كما مستقبلات السطح فقط لL. ولذلك المستوحدة البروتين InlB وغزت سيئة من قبل معظم L. المستوحدة السلالات. بديل واحد هو استخدام تعدد عالية جدا من العدوى (وزارة الداخلية> 100) التي قد تزيد من عدد البكتيريا الغازية ولكن يزيد من خطر تلف الخلايا بسبب مستويات أعلى في مستنبت الخلية البكتيرية من المسام تشكيل السم listeriolysin O (أيضا LLO)، الذي يعرض النشاط السامة للخلايا قوية جدا. البديل الآخر هو استخدام سلالات فائقة الغازية مثل سلالة EGDe.PrfA * قدمت في بروتوكول لدينا، الذي يسمح للاستخدام وزارة الداخلية منخفضة (<25) ويقلل من كمية تعتمد على الآثار السامة للخلايا LLO؛ النتائج التي تم الحصول عليها مع L. المستوحدة سلالة فائقة الغازية يمكن التحقق من صحة وقت لاحق باستخدام سلالات بكتيرية أخرى أقل ضراوة في أنواع أخرى من المقايسات (انظر أدناه). البديل الثالث هو استخدام خط مختلفة من الخلايا التي تعبر عن كل من كادهيرين E والأرصاد: هو الحال بالنسبة للخطوط الخلايا مثل الخلايا Jeg3 أو BEWO مثل الأرومة الغاذية، أو سرطان القولون خلايا لوفو، والتي يمكن أن غزت من قبل كل من ومسارات دخول InlB التي تعتمد InlA و؛ في هذه خطوط الخلايا، ويمكن الوصول إلى معدلات أعلى للإصابة الخلية باستخدام L. المستوحدة سلالات مثل EGDE، سلالة الأبوية من EGDe.PrfA *. وينبغي أن يؤخذ في الاعتبار، مع ذلك، أن التكرار من الوظائف في كل مسارات يمكن أن يؤدي إلى آثار التعويض في مسار واحد عندما يتم المعطل على المستجيب في مسار آخر، مما يجعل من الصعب تحليل النتائج. من المهم أيضا أن نذكر ثالا ينبغي أن يكون أكثر من خلايا تي المصابة من أجل توفير النظام مع مجموعة ديناميكية جيدة مما يسمح للكشف عن الأحداث التي تزيد من الإصابة: في بروتوكول لدينا على وجه الخصوص، وزارة الداخلية لدينا يؤدي إلى معدل الإصابة الأمثل لل30٪.

طرق بديلة لدراسة غزو الخلايا المضيفة التي كتبها L. وتشمل المستوحدة الكلاسيكية جنتاميسين غزو مقايسة 26 الذي يقوم على قتل البكتيريا خارج الخلية من خلال إضافة جنتاميسين إلى مستنبت الخلية بعد فترة أولية من عدوى بكتيرية (على غرار الإجراء الوارد في الجزء الأول من البروتوكول العدوى لدينا) و وسجل غزو من قبل البكتيريا داخل الخلايا تصفيح على قيد الحياة على لوحات أجار وحساب عدد وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) التي تنمو على هذه اللوحات. يقدم هذا الأسلوب ميزة استخدام قراءات الأكثر مباشرة للعدوى، وهو العدد الدقيق من البكتيريا الغازية التي محمية فعلا من المعالجة السطح جنتاميسينالإقليم الشمالي في الفضاء هيولي الخلايا المضيفة، ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب قراءات واحد للعدوى وبمجرد هي lysed الخلايا المضيفة للافراج CFUs داخل الخلايا، لم يعد هناك سجل للحصول على معلومات بشأن الوضع الفعلي للخلايا عند نقطة نهاية التجربة. ويستند بروتوكول لدينا على الطريقة غير المباشرة، والكشف عن البروتين يفرز InlC، ولكن كما ذكر سابقا، فإن مستويات حشوية InlC ربط مع عدد من عصاري خلوي L. المستوحدة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، فإن الطبيعة الجوهرية للفحص المجهري لدينا يسمح لإنشاء بوضوح الوضع الدقيق للخلايا في نهاية العدوى: نحن بالتالي يمكن استخراج المعلومات المتعلقة مورفولوجيا الخلوية العالمية، وتوزيع الهيكل الخلوي الأكتين، مرحلة دورة الخلية، وغيرها، وتؤدي نسبة عالية تحليل العدوى. واحدة سمة هامة التي يمكن استخلاصها من هذا النوع من التحليل هو السياق السكان وتأثيرها على الإصابة: في الواقع، أظهرت الأعمال الأخيرة من Pelkmans وزملاء العمل 27 أن السياق معينة من السكان من خلية معينة (على سبيل المثال، موقفها من محيط داخل مجموعة من الخلايا في جزيرة) يؤثر على العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك الإلتقام والقابلية للعدوى الفيروس. لذا يقدم لنا فحص إمكانية لاستخراج هذه المعلومات.

ويعرض طريقة لدينا ميزة إضافية: منذ InlC هو قراءات في وقت متأخر من العدوى بسبب إفراز من قبل البكتيريا حشوية، يمكن المضيف مسارات الإشارات التي تؤثر على مستويات تراكم InlC في الخلايا المضيفة تؤثر على دخول البكتيريا وليس فقط ولكن أيضا هروب فجوي، وانتشار عصاري خلوي و في نهاية المطاف إلى انتشار خلايا الخلية. وبالتالي، لدينا وسيلة يمكن أن تستخدم قراءات الأولية للعدوى العالمية ويمكن أن يقترن لفحوصات الثانوية لتشريح الخطوة العدوى المحددة التي تم مضطرب من جراء ضرب الأولية التي تم تحديدها من خلال شاشات سيرنا. أخيرا، من المهم أن نذكر أن لدينا وسيلة يمكن نشرا كاملا والآلي باستخدام أجهزة وحة غسالة، وزيادة بالتالي عدد العينات التي تم تحليلها في تجربة واحدة في حين خفض مستوى تباين النتائج بالمقارنة مع التجارب التي نفذت يدويا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

ويدعم البحوث في المختبر P. Cossart من قبل معهد باستور، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث MEDICALE، والمعهد الوطني للبحوث الزراعية لا، ERC المتقدم المنحة (233348)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (المنحة النثريات- SignRupVac)، ومؤسسة لويس Jeantet ومؤسسة روش لو ليه Mousquetaires. AK هو حاصل على منحة دراسية من جامعة باستور باريس الدولي الدكتوراه البرنامج / معهد كارنو علل Infectieuses. نشكر جيسون ميرسر لتحسين بروتوكول ترنسفكأيشن الخلوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

علم المناعة، العدد 79، خلايا هيلا، المستوحدة الليستيريا، إيجابية الجرام الالتهابات البكتيرية، الإسفار، والفرز الفائق الإنتاجية فحوصات، تدخل الحمض النووي الريبي، المستوحدة الليستيريا، العدوى، المجهري، صغيرة الحمض النووي الريبي التدخل

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter