Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Abstract

Bakteriyel hücre içi patojenler zarif işlemek ve ana hedef dokuların enfeksiyonu için gerekli olan hücre fonksiyonlarını yıkmak için kendi kapasitesi nedeniyle hücresel sinyal kaskadlar incelemek için moleküler araçlar olarak tasavvur edilebilir. Bu bakteriyel patojenler arasında, Listeria monocytogenes hücresel bağışıklık tepkilerinin karakterizasyonunda hücre içi parazitlenme için bir paradigma olarak kullanılan bir Gram pozitif mikroorganizma ve hücre iskeleti ve membran ticareti dinamiklerini kontrol moleküler yollarının bulunması etkili rol oynamıştır. Bu yazıda, L. geç hücre enfeksiyonu aşamalarının saptanması için bir tahlili tarif sağlam mikroskobik monocytogenes inlc, enfekte olmuş hücrelerin sitoplazması içinde biriken bir salgılanan protein bakteriyel floresan etiketleme göre, bu deney, Char için otomatik yüksek verimli, küçük müdahale edici RNA ekranlara bağlanabilirenfeksiyon yukarı-veya aşağı-regülasyonunda rol oynayan hücresel sinyal yolları acterize.

Introduction

Gram pozitif bakteri Listeria monocytogenes, konakçı hücreleri işgal onun içselleştirme vakuol bozar ve konakçı hücreler 1 sitoplazması içinde replike olan bir gıda kaynaklı patojendir. L. hücre ve hayvan modellerinde görülen bakteriyel hastalık özelliklerin kalıcılığı ile ilişkili laboratuar bağlamında (hızlı büyüme, sağlıklı bireyler için düşük toksisite) manipülasyon kolaylığı monocytogenes (hemolitik aktivite, lökositoz) için önemli bir model olarak 1960 yılında ilk kullanım izin hücre içi asalaklık ve enfeksiyondan 2 karşı hücresel bağışıklığın teorik temellerinin kurulması için çalışma. 1980'lerin sonu ve 1990'ların başlarında, bakteri hücre içi döngüsü 3 yanı sıra en önemli bakteriyel virulans moleküler karakterizasyonu diseksiyonu 4-7 L. kullanımını tercih faktörleri manipülasyon ve damızlık için önemli bir moleküler araç olarak monocytogeneskonakçı hücre fonksiyonlarının y. Listeria cinsinin Avirulent varlığı (L. innocua) ve öldürücü (L. monocytogenes) türleri karşılaştırmalı genomik çalışmalar 8 önünü açtığını, birlikte tam L. son kurulması ile monocytogenes L. evrim anlayışımızı artış, 9 transcriptome bir insan patojeni olarak ve enfeksiyonu için bir model sistem olarak monocytogenes 10 çalışmalar.

L. monocytogenes ev sahibi hücre reseptörleri, sırasıyla E-kadherin ve Met, 11-12 ile bakteriyel yüzey proteinleri ve InlA ınlB etkileşimi üzerine konakçı hücreler içine içselleşmesini uyarır. Başlangıç ​​aday bazlı çalışmaları ınlB-kritik bir effektör olarak InlA istilası yolunun 13 ve fosfoinositid 3-kinaz (PI 3-K) önemli bir bileşeni olarak α / kateninler β-aktin bağlantı tanımlanmasına yol açtı bağımlı işgali Cascade 14-15. Proteomik ve fonksiyonel bazlı deneyler sonradan izin roman sitoskeletal elemanları 16 ve konakçı hücre işgali için gerekli lipid ikinci haberciler 17 tanımlama. Transkripsiyonal çalışmalar 18 ve kütle spektrometresi tabanlı nicel proteomiks 19 Yakın zamanlarda sinyal şelaleden aktivasyonu ve L. sırasında bağışıklık tepkilerinin baskılara ilişkin yeni bir ışık tutmuştur monocytogenesin. Sistem biyolojisi küçük müdahale RNA genlerin (kinomes, tam genomları) büyük setleri inaktive dayalı yaklaşımlar (siRNA) susturulması son zamanlarda fagositozundan dahil, spesifik hücresel fonksiyonları bağlamında sinyal basamaklarının küresel ana analizi için yeni yollar açtı ve var patojen içselleştirilmesi 20. Genom siRNA'nın ekranlar önceden L. enfeksiyonu için gerekli hücresel kaskadlar araştırmak için yapılmıştır fagositik Drosophila monocytogenes 21-22 ancak bu tip analiz fagositik olmayan hücrelerde gerçekleştirilen edilmemiştir, in vivo enfeksiyonu için önemli hedefleri temsil eder.

Biz, L. tarafından enfeksiyonun geç aşamalarında mikroskobik tespiti için bir protokol optimize epitel hücre içinde bakteri giriş yüksek verimli siRNA çalışmaları için uygundur monocytogenes. Bizim deney oldukça invazif L. yararlanır PrfA, L. majör kopyalama düzenleyicisi olarak, bir nokta mutasyon sunulur gerginlik monocytogenes 6, hastalık oluşturma faktörleri monocytogenes (PrfA * olarak adlandırılır) bu mutasyon 23 PrfA kurucu bir şekilde etkin hale getirir ve bu yüzden başka türlü kötü enfekte fagositik olmayan hücrelere bakteriyel girişi lehine, istila protein InlA ve ınlB bir artış çıkmasına yol açar. Enfeksiyon Bizim okuma salgılanan bakteriyel protein inlc sitozolik birikiminin saptanması üzerine dayanmaktadır: Bu molekülintra-sitoplazmik L. tarafından tercihen eksprese edilen bir pleiotropik efektör monocytogenes 9 ve katılır bakteri hücreden hücreye yayılan 24 değil, aynı zamanda konak immün yanıtları modüle 25, bunlar sadece. Hücre içi bakterilerin inlc salgılanmasının floresan etiketleme açıkça enfekte olmayan hücrelerin enfekte ayırt etmesine olanak veren, aynı zamanda, bir uç-nokta, daha sonra, farklı adımlarda enfeksiyon incelemek için kullanılabilir okuma temsil eder, sadece: girişi, vakuolar kaçış, sitosolik bakteriyel çoğalması ve hücre-hücre yayıldı. Bu mikroskopi tabanlı protokol Bu nedenle L. tarafından konak hücrelerin enfeksiyonu ile ilgili hücresel yolları okumak için siRNA ekranlara bağlanabilir monocytogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Hücresel hazırlanması ve Bakteriyel Kültürleri, Transfeksiyonu Araçlar ve Primer Antikorlar

  1. Bireysel L. izole etmek için taze bir agar plaka hazırlayın -80 ° C'de tutulan bir bakteri gliserol stoku (bakteriyel sıvı kültürü bir gece boyunca, doymuş glycerol/50% 50%) dan koloniler monocytogenes
    1. Bir Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) agar plaka üzerinde donmuş bir bakteri gliserol stok, çizgi bakteri taşımak için (-80 ° C'de muhafaza) bir alüminyum raf kullanma.
    2. 48 saat (ya da bireysel bakteriyel koloniler izole edilebilir ye kadar) içinde 37 ° C'de inkübe edin.
    3. (Sıvı tohum kültürleri için kullanılacaktır), 1 aydan fazla bir süre boyunca 4 ° C 'de sonra bu çalışma plakası tutun.
    4. Bizim protokol, L. kullanın serotip 1/2ã EGDe.PrfA * suşu monocytogenes, ancak Şekil 1 'de gösterildiği gibi L. P14.PrfA 4b monocytogenes serotip * gerginlik benzer sonuçlar verir.
  2. OLa ATCC CCL2 hücreleri, antibiyotik olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde büyütülür.
  3. Karıştırılmış (kontrol) ve anti-Met siRNA'lar 384 oyuklu siyah mikroskopi hücre kültürü plakaları içinde yüklenir bağımsız havuzlar.
    1. RNase-içermeyen su içinde 500 ul siRNA 160 pmol seyreltin ve bu çözeltinin oyuk başına 5 ul (nihai konsantrasyon: 1.6 pmol) ekleyin.
    2. 1 yıllık bir süre için -20 ° C 'de bu plaka tutun.
  4. 25, daha önce tarif edildiği gibi bir inlc-GST rekombinant proteini kullanılarak aşılama ile elde edilmiştir inlc bakteriyel proteine ​​karşı poliklonal tavşan antikorlarının seviyelerini yükseltmiştir.

2. SiRNA hücre transfeksiyonu Ters

  1. Enfeksiyondan önce 72 saat oda sıcaklığında her bir hazne içinde RNase içermeyen su içinde 5 ul 1.6 pmol siRNA içeren siyah 384 oyuklu mikroskopi hücre kültürü plakası getirmek.
  2. 300 3 dakika boyunca plaka santrifüjkuyuların duvarlarında biriken olabilirdi siRNA'yı aşağı getirmek için oda sıcaklığında rcf.
  3. % 0.4 Lipofectamine RNAiMAX ile takviye edilmiş DMEM oda sıcaklığı hazırlayın.
  4. (SiRNA eklemeden önce uzun süre 20 dakika daha inkübe transfeksiyon ortamı yok), her bir oyuğa DMEM / RNAiMAX transfeksiyon ortamı 25 ul ekle.
  5. Transfeksiyon solüsyonu ile siRNA karıştırmak için ileri ve geri hareket plaka, daha sonra siRNA Lipofectamine kompleksleri oluşturmak için izin vermek için, oda sıcaklığında, 1 saat boyunca levha tutun.
  6. Bir kere, 10 ml 37 ° C önceden ısıtılmış PBS ile birleşen veya alt konfluent hücre kültürü şişesinden yıkama HeLa hücreleri.
  7. 1 ml 37 ° eklenerek HeLa hücreleri ayırın C hücre kültürü şişesine tripsin önceden ısıtılmış ve 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca inkübe
  8. 10 ml 37 ° C 'de yeniden askıya hücreler% 16 FBS ile takviye edilmiş DMEM önceden ısıtılmış.
  9. Hücre sayımı ve hazırlanması DMEM içinde, ml başına 12,000 hücre, bir hücre süspansiyonu ile desteklenmiş% 16 FBS.
  10. 384-kuyulu bir levhadaki her kuyuya, hücre süspansiyonu, 50 ul ekle.
  11. Hücreleri dağıtmak ve hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerleşmek izin hızla ileri ve geri plakasını taşıyın.
  12. Parafilm ile plaka yalıtılır ve 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 içeren bir atmosferde 72 saat boyunca tutmak

3. Hücresel Enfeksiyon ve Boyama

  1. Enfeksiyondan bir gün önce, L. tek bir koloni almak BHI agar plakasından monocytogenes ve bir 15 ml tüp içinde polistiren sıvı BHI ortamı içinde, 5 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
  2. Bakteri büyümesi için izin vermek için bir shacking cihazı içerisinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  3. Enfeksiyonun gün, L., gece boyunca 1 ml yıkama bir masa üstü santrifüj 10.600 RCF 2 dakika santrifüj edilerek kültür monocytogenes.
  4. (Salgılanmış sitotoksin listeriolisin O içerir) Süpernatant atılır ve 1 ml PBS (repea pelet yeniden askıya) yıkama aşaması 3 kez t.
  5. 600 nm'de optik yoğunluk bakteriyel okuma ve bakteri sayısını (OD = 1 1E9 bakteri / ml 'ye eşdeğerdir) tahmin ediyoruz.
  6. Yeterli L. hazırlanması % 1 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde seyreltme monocytogenes: EGDe.PrfA * gibi, yüksek oranda istilacı türleri kullanılarak, biz oyuk başına 30 ul ortam içinde 5E4 bakterilerin kullanımını (enfeksiyon çokluğu 2.000 hücreleri için 25 olarak tahmin edilir) göstermektedir.
  7. Her çukurdaki hücre kültür ortamı (80 ul) çıkarın ve L. 30 ul eklenmesi ile değiştirin orta monocytogenes-ihtiva etmektedir.
  8. Enfeksiyon süreci senkronize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 RCF plaka santrifüj.
  9. Önceden ısıtılmış alüminyum blok üzerinde, 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 içeren bir atmosfer altında 1 saat boyunca inkübe edin.
  10. L. çıkarın de her bir ikinci orta monocytogenes-ihtiva eden ve% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde önceden ısıtılmış 30 ul ekle ve40 ug / ml gentamisin dışı L. öldürmek için monocytogenes.
  11. Önceden ısıtılmış metal blok üzerinde, 37 ° C'de% 5 CO2 içeren bir atmosferde 4 saat boyunca inkübe edilir.
  12. % 8 formaldehit (yerine paraformaldehid polimerlerden daha formaldehit monomerler kullanılır, ki bu çözelti, taze olarak hazırlanmalıdır) ile takviye edilmiş PBS içinde bir çözeltisi hazırlandı.
  13. Hücre kültür ortamı atarak olmadan,% 8 formaldehit (nihai konsantrasyon:% 4) ile takviye edilmiş 30 ul PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  14. Fiksatif çıkarın ve (oyuk başına 80 ul PBS nihai hacmi içinde hücreleri tutun) oyuk başına 80 ul PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
  15. Hazırlama bir 1:250 PBS içinde tavşan anti-serumu inlc seyreltme% 0.2 saponin ile takviye edilmiştir.
  16. De PBS çıkarılmasından sonra her bir birincil antikor çözeltisinin 10 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
  17. Birincil atınAntikor çözeltisi ve oyuk başına 40 ul PBS ile dört kez yıkayın.
  18. PBS içinde ikincil Alexa Fluor 546-bağlı anti-tavşan antikoru (1:250), DAPI çözeltisi (1:1,500) ve phalloidin-Dy647 (1:150) ile seyreltilir,% 0.2 saponin ile takviye edilmiştir.
  19. Her çukuruna Bu ikinci boyama çözeltisi 10 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
  20. İkinci boyama solüsyonu atın ve (her bir kuyucuğa 40 ul bir son hacim bırakın ve plaka mühür) oyuk başına 40 ul PBS ile dört kez yıkayın.
  21. Plaka hemen görüntülü olabilir ya da bir sonraki analiz için ışıksız bir 4 ° C (alüminyum folyo ile kapak) saklanabilir.

4. Görüntü Toplama ve Analizi

  1. Otomatik bir mikroskop üzerine monte edilmiş bir 10X objektif (kuyu başına tercihen 9 görüntüleri elde) kullanarak üç farklı kanal (350 nm, 546 nm ve 647 nm) görüntü elde.
  2. Inlc bilgi sinyali görüntü kullanılarak ölçülebilirsırasıyla DAPI ve phalloidin lekeleme kullanarak çekirdekleri ve hücre gövdeleri otomatik segmentasyon sağlar CellProfiler gibi analiz yazılımı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sitoplazmik inlc floresan etiketleme L. tarafından hücre enfeksiyon için sağlam okunmasını sağlar monocytogenes, Şekil 1 'de gösterildiği gibi: mikrografta merkez hücre yüksek P14.PrfA * 23 suşu ile enfekte edilir bu faz kontrast çekimi (ok uçları, Şekil 1A) gözlenebilir ve bu sinyali DAPI ile doğrulanır gibi olduğu Bireysel bakteri açık (Şekil 1B) ayırt edilebilir. (Şekil 1 C 'de DAPI lekelemesi ile üst üste binmiş), bu lekeleme inlc salgılanmış protein yoğun enfekte olmuş hücrelerin sitoplazmasında birikir ve enfekte olmuş konakçı hücre morfolojisi kesin bir algılanmasını sağlar kadar tasvir etmektedir. Floresan Phalloidin (Şekil 1D) ile aktin hücre iskeletinin boyama tam aşılanmış hücre tek tabaka morfolojisi hakkında bilgi sağlar ve daha fazla nasıl komşu olmayan enfekte hücreler (bir yıldız işareti ile işaretlenmiş hücre çekirdekleri) d göstermektediro herhangi inlc etiketleme göstermez. Bu inlc sitozolik seviyeleri sitoplazmik bakteri sayısına bağlı olduğundan, biz imünofosfor ve L. sayısına göre tespit inlc sinyali arasında bir korelasyona işaret ettik, söz değer hücre başına monocytogenes: Şekil 1 'de görüldüğü gibi, düşük bakteri sayıları ile enfekte komşu hücreler tayin edilebilir azaltılmış inlc boyama görüntüler. İlginç bir şekilde, bu inlc bilgi kolayca hücreden hücreye yayılma süreci (Şekil 1C) aktin lekeleme (Şekil 1D) ile de görüldüğü gibi, yakalanmış bakteriler tarafından meydana getirilen çıkıntılar tespit olduğunu gözlemlemek mümkündür. 488 nm kanalı kullanılmıyor çünkü notun, bakteriler doğrudan L., bizim protokolde lekeli ama değil monocytogenes spesifik bir anti-bakteriyel serum kullanılarak etiketlenebilir, aksi takdirde, GFP-ifade eden bakteriler alternatif olarak kullanılabilir.

Gibi t gibi görüntü analiz araçlarını kullanmaO ortak yazılım CellProfiler (geniş Institute, www.cellprofiler.org ), bu bölüm hücrelere mümkündür ve belirli bir deney koşulu için bir enfeksiyon endeksi tahmin etmek için kullanılabilir bireysel enfekte olmuş hücrelerde inlc bilgi sinyalini ölçmek için. Şekil 2'de gösterildiği gibi, DAPI ile çekirdek etiketleme (Şekil 2A) ve falloidinle aktin hücre iskeleti (Şekil 2C) hücre bölümleme için gerekli bilgileri sağlar: çekirdek tek tek hücrelerin tanımlanması (Şekil referans nesneleri olarak kullanılır 2B) ve sitoplazma sonra dikkate sitoskeletal sinyali (Şekil 2D) alır çekirdeklerden yayılmış bir fonksiyonu kullanılarak tanımlanır. Son olarak, inlc sinyalin yoğunluğu sayısını tahmin etmek için, her bir tespit hücresel bir nesne (Şekil 2E ve 2F) için tayin edilebilirbiz negatif düşünün inlc yoğunluğu için bir eşik belirleyerek hücreleri enfekte. Enfeksiyon endeksi popülasyondaki toplam hücre sayısına bölünmesi ile enfekte olmuş hücrelerin sayısı olarak hesaplanmıştır.

Bizim protokol L. tarafından konak hücrelerin enfeksiyonu hedef moleküllerin büyük panellerin araştırmak üzere siRNA ekranlara bağlanabilir monocytogenes. Kontroller transfeksiyon verimliliğini doğrulamak için gerekli olan: örneğin, siRNA hedef Kif11 hücre ölümüne yol açan transfeksiyonu için yaygın olarak kullanılan bir kontrol ve bu nedenle, tahlilin sonuna hücrelerin yokluğu transfeksiyon verimli bir şekilde ilerledi bir göstergesidir. Özellikle L. gidermek için invazyon işlemi monocytogenes, HeLa hücrelerinde Met hücre reseptörünün siRNA inaktivasyonu konakçı hücrelere bakteri giriş önemli bir inhibisyona neden olur ve bir hücresel mono-katman inoküle (Şekil in inlc-pozitif hücre, çok düşük seviyelere yol açar3A) bir karıştırılmış siRNA kontrol (Şekil 3B) ile muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında. Aday bilinmeyen moleküllerin fonksiyonu standart olarak bilinen bu molekül, hücre kullanılarak eden tahlili ile araştırılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. L. ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde inlc etiketleme tespiti monocytogenes * P14.PrfA süzün., bizim protokolde tarif immünofloresans işlenmiş ve 63X objektif kullanarak görüntülü olarak HeLa CCL2 hücreleri enfekte olmuştur. (A) faz kontrastlı bir resim, çeşitli bakteri P14.PrfA * ok uçları ile gösterilir. (B) DAPI boyama (mavi), (A) 'deki ile aynı tek bakteri ok uçları ile etiketlenir. (C) DAPI boyama (mavi) Toplamsallık veInlc boyama (kırmızı), enfekte olmamış hücrelerin çekirdekleri, bir yıldız ile etiketlenir. (D) inlc (kırmızı) Toplamsallık ve aktin (yeşil) sinyalleri. Bar. 5 mikron büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. L. ile enfekte HeLa hücrelerin segmentasyon analizi monocytogenes * EGDe.PrfA süzün., bizim protokolde tarif immünofloresans işlenmiş ve 10X objektif kullanarak görüntülü olarak HeLa CCL2 hücreleri enfekte edildi. (A) DAPI sinyali. (B) DAPI sinyali (mavi) süperpozisyon (A) görüntülenir ve aktin sinyali (kırmızı) çekirdeklerin bölümleme (vi gösteren (C) görüntülenirew) inset genişlemiş. (C) Aktin sinyali. (D), hücrelerin segmentasyon gösteren (B) olarak aynı görüntüsü. (E) inlc sinyali. Inlc boyama (sarı) süperpozisyon ile (D) olarak (F) aynı görüntü. Bar. 50 mikron büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. . Met ve kontrol hücreleri için inaktive hücreleri arasındaki inlc etiketleme değişimi CCL2 HeLa hücreleri başlangıçta Met konakçı hücre reseptörü hedef dört siRNA'lar bir havuzu ile ters-transfekte edilmiştir; tarif edildiği gibi 72 saat transfeksiyondan sonra, hücreler, enfekte edilmiştir immünofloresans için işlenmiş ve 10x nesnesini kullanarak görüntülüive. DAPI (mavi) (A) 'den, aktin (kırmızı) ve Met için inaktive hücrelerinde (sarı) inlc. (B) bir karıştırılmış siRNA ile muamele edilmiş kontrol (A) ile ilgili hücrelerinde aynı kanalları. Bar. 50 mikron büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çeşitli parametre inlc sinyalinin kesin bir algılanmasına izin vermek için yeteri kadar büyük bir sitoplazma gösteren sağlıklı hücre çizgilerinin kullanımı da dahil olmak üzere inlc bilgi algılama protokolün başarısına için kritik öneme sahiptir. Deneyde biz nedeniyle sitosolik boşluğun genişletilmesi için tahlil için özellikle uygun olan HeLa CCL2 hücrelerin kullanımı önermek bu madde içinde mevcut bu tür Kyoto HeLa hücreleri gibi diğer HeLa klonlar daha küçük bir ekran ancak sitoplazma kullanılabilir Bizim enfeksiyon protokolü ile (hücreleri genellikle HeLa CCL2 hücreleri için durum komşu hücreleri ile örtüşmeyen bu yana HeLa Kyoto hücreleri özellikle de segmentasyon analizi için uyarlanmıştır). Böyle polimorfonükleer hücreler veya makrofajlar gibi çok küçük bir sitoplazma Hücreler protokolüyle birlikte kullanılması tavsiye edilmez.

Buraya mevcut olarak bir görüntüleme protokolünün bir sınırlama hücre minimal miktarda INFE gerektiği gerçeğidirCTED, kontrol koşullarında, belirli bir tek tabaka içinde yeterince rezolütifFPLC güç sistemi sağlamak amacıyla: az hücrelerin enfekte edilir, aksi takdirde, bu potansiyel aday molekül işlevini araştıran, özellikle enfeksiyon oranlarındaki değişiklikleri belirlemek için zor olur olduğu enfeksiyonu azaltmak için bekleniyor. L. için sadece yüzey reseptörü olarak Met express HeLa hücreleri kullanılarak bu sınırlama gerçek bir problem teşkil etmektedir monocytogenes protein ınlB ve bu nedenle de en kötü L. tarafından işgal monocytogenes suşları. Bir alternatif invaziv bakteri sayısını artırmak değil, aynı zamanda (nedeniyle, toksin listeriolisin O oluşturan bakteri gözenek hücre kültür ortamı içinde yüksek seviyelere hücre hasarı riskini artırır hangi enfeksiyonu çok yüksek çok sayıda (MOI> 100) kullanmaktır çok güçlü bir sitotoksik aktivite gösteren LLO),. Diğer alternatif gibi bizim protokol sunulan EGDe.PrfA * suşu olarak süper-invazif suşların kullanımı, Burada düşük bir MOI (<25) kullanımına izin verir ve LLO bağımlı sitotoksik etkilerin miktarını azaltır, bir L. ile elde edilen sonuçlar monocytogenes süper-invaziv suşu sonra (aşağıya bakınız) tahlillerin diğer türleri daha az öldürücü bakteri suşları kullanılarak valide edilebilir. Üçüncü bir alternatif E-kaderin ve Met ifade eden iki farklı hücre dizisi kullanmak için: bu tür her ikisi tarafından işgal edilebilir trofoblast benzeri Jeg3 veya BEWO hücreleri, ya da kolon karsinomu LoVo hücreleri gibi hücre hatları için de geçerlidir InlA ve ınlB bağımlı giriş yolları, bu hücre çizgilerinde hücre enfeksiyon oranlarının daha yüksek L. kullanılarak ulaşılabilir Böyle EGDE, EGDe.PrfA bir ebeveyn suşu * olarak monocytogenes suşları. Bu, bir efektör zor sonuçlarının analizi işleme, diğer yolu olarak durdurulmuş olduğu, ancak, her iki yolda da fonksiyonları bu fazlalık bir yolunda tazminat etkilere yol açabilir, dikkate alınmalıdır. Bu tha söz de önemlidirT hücreleri, enfeksiyon artış olaylarının saptanmasına olanak tanıyan iyi bir dinamik aralığı ile sistemi sağlamak amacıyla enfekte fazla olmamalıdır: kendi özel protokol, bizim MOI% 30 arasında optimum bir enfeksiyon oranına yol açmaktadır.

L. tarafından konakçı hücrelerin istilası incelemek için alternatif yöntemler monocytogenes (bizim enfeksiyon protokol ilk bölümünde sunulan prosedüre benzer) bakteriyel enfeksiyonun bir başlangıç ​​döneminden sonra, hücre kültür ortamına gentamisin eklenmesiyle hücre dışı bakterilerin öldürülmesi göre ve klasik gentamisin istila deneyi 26 içerir invazyon agar plakaları üzerinde kalan hücre içi bakteri ve bu kaplama tabakalarına büyümesi koloni oluşturan birimlerin sayısı (CFU) sayımı ile puanlanmıştır. Bu yöntem, aslında gentamisin yüzey işlenme korunur invaziv bakterilerin tam sayı olduğu, enfeksiyon için en doğrudan okuma kullanmanın avantajınınt konakçı hücrelerin sitoplazmik alanı olmakla birlikte, bu yöntem, enfeksiyon için, tek bir okuma sunar ve konakçı hücreler, hücre içi serbest bırakmak için CFU lize kez, uç noktada hücreler gerçek durumuna ilişkin bilgi elde etmek için bir kayıt artık yoktur Deneyin. Bizim protokol dolaylı bir yöntem, inlc salgılanan proteinin saptanması göre, daha önce de belirtildiği gibi, sitoplazmik inlc seviyeleri sitosolik L. sayısı ile ilişkili olduğu monocytogenes (Şekil 1). Ayrıca, bizim mikroskopi tahlilin iç yapısı açıkça enfeksiyon sonunda, hücrelerin kesin durumu tesis sağlar: bu nedenle, vb genel hücre morfolojisi ile ilgili bilgileri, aktin hücre iskeleti dağıtım, hücre döngüsü faz, özü ve yüksek miktarda gerçekleştirebilir Enfeksiyon analizi. Bu tür bir analiz elde edilebilir önemli bir özelliği popülasyon kapsamı ve enfeksiyon üzerindeki etkisidir: Gerçekten de, Pelkmans ve arkadaşları 27 son zamanlardaki araştırmalar, belirli bir hücrenin, özellikle nüfusun bağlam (örneğin, bir ada hücrelerin bir grup içinde çevresinden olan pozisyon) virüs enfeksiyonuna endositoz ve duyarlılık dahil olmak üzere çeşitli hücre işlevlerini etkiler gösterdi. Bizim tahlil bu nedenle, bu bilgilerin çıkarılması için potansiyel sunar.

Önerilen yöntem, ek bir avantaj sunar: inlc nedeniyle sitoplazmik bakteriler tarafından salgılanması ile enfeksiyonun geç bir okuma olduğu için, konakçı hücrelerde inlc bilgi birikimi düzeyini etkileyen ana sinyal yolları potansiyel bakteri girişi değil, aynı zamanda vakuolar kaçış, sitosolik çoğalması ve sadece etkileyebilir sonunda hücre-hücre yayılması. Böylelikle, genel yöntem enfeksiyonu için bir birinci okuma olarak kullanılabilir ve siRNA ekranlar ile tespit birincil isabet ile altüst edilmiş olan özel enfeksiyon adımı incelemek sekonder deneyleri akuple edilebilir. Son olarak, bu yöntem, en üstteki eden ve tam olarak plaka yıkayıcı aygıtlar kullanılarak otomatik, elle yürütülen deneylere göre sonuçlar değişim düzeyini düşürmektedir, bu nedenle tek bir deneyde analiz edilen örneklerin sayısını artırmak olabilir bahsetmek önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

P. Cossart Araştırma laboratuvarında Pasteur Enstitüsü, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant Mie-tarafından desteklenmektedir SignRupVac), Louis-Jeantet Vakfı ve Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK Pasteur-Paris Üniversitesi Uluslararası Doktora Programı / Institut Carnot İlletler Infectieuses bir burs bir alıcı. Biz hücresel transfeksiyon protokolü optimize Jason Mercer teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Immunology Sayı 79 HeLa hücreleri Listeria monocytogenes Gram-pozitif bakteriyel enfeksiyonları Flüoresan High-Throughput Screening Deneyler RNA Interference Listeria monocytogenes enfeksiyon mikroskopi küçük müdahale edici RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter