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Summary
リステリア菌は、頻繁に、細胞内寄生の研究のための主要なモデルとして用い、グラム陽性細菌の病原体である。後半L.イメージング低分子干渉RNA画面のコンテキスト内感染段モノサイトゲネスは、標的宿主細胞の細菌感染に必要な細胞経路をグローバル研究を可能にする。
Abstract
細菌の細胞内病原体は絶妙に操作し、宿主の標的組織への感染に必要な細胞機能を破壊するそれらの能力に起因する細胞のシグナル伝達カスケードを分析するための分子ツールとして考えることができる。これらの細菌の病原体の中では、 リステリア菌は、細胞性免疫応答の特徴づけに細胞内寄生のためのパラダイムとして使用されており、その細胞骨格と膜人身売買のダイナミクスを制御する分子経路の発見に尽力役割を果たしてきましたグラム陽性微生物である。この記事では、我々はLの遅い携帯感染の段階を検出するための堅牢な顕微鏡アッセイを記述リステリア InlC、感染細胞の細胞質に蓄積し、分泌された細菌タンパク質の蛍光標識をもとにして、このアッセイは、char型にするために、自動化ハイスループット低分子干渉RNAの画面に結合することができる感染のアップまたはダウンレギュレーションに関与する細胞シグナル伝達経路をacterize。
Introduction
グラム陽性菌、リステリア·モノサイトゲネス 、宿主細胞に侵入するその内部移行液胞を破壊し、宿主細胞1の細胞質で複製する食品媒介病原体である。L.細胞および動物モデルで観察細菌の病原性形質の持続性に関連した研究室のコンテキスト（急速な成長、健康な人のための低毒性）での操作のしやすさをモノサイトゲネス （溶血作用、白血球増加は）のための主要なモデルとして、1960年の最初の使用は許可されて細胞内寄生の感染2に対する細胞性免疫の理論的基礎の確立のための研究。 1980年代後半から1990年代には、細菌の細胞内サイクル3だけでなく、最も重要な細菌の病原性の分子特性の解剖は4-7 Lの使用を好む要因操作とスタッドのための重要な分子ツールとしてのリステリア宿主細胞の機能のY。 リステリア属の非病原性の存在（ のL.イノキュア ）と病原性（ リステリア菌 ）種は、比較ゲノム研究の8のための道を開いたこと、一緒に完全なLの最近の設立にリステリアは、L.の進化の理解を増加している、9をトランスクリプトームヒトの病原体として、感染の研究の10のためのモデル系として、 リステリア 。
リステリア菌は、それらの宿主細胞受容体はそれぞれ、E-カドヘリンおよびMet、11月12日で、細菌の表面タンパク質INLAおよびinlBの相互作用によって宿主細胞にその内在化を誘導する。最初の候補ベースの研究はINLBクリティカルなエフェクターとしてINLA -侵入経路13のとホスホイノシチド3 -キナーゼ（PI 3-K）の重要な構成要素として、α/βカテニン-アクチンリンクが同定された依存侵入カスカ14〜15·デ·。プロテオミクスおよび機能に基づくアッセイは、その後、新規な細胞骨格要素16および宿主細胞の浸潤に必要な脂質セカンドメッセンジャー17の同定を可能にした。転写の研究18と質量分析に基づく定量的プロテオミクス19は最近、ホストシグナル伝達カスケードの活性化とLの間の免疫応答の抑制に関する新たな光を当てるしている感染をモノサイトゲネス 。低分子干渉RNA（siRNA）をサイレンシングによる遺伝子（kinomes、完全なゲノム）の大きなセットの不活性化に基づいて、システム生物学的アプローチは、最近、食作用を含む特定の細胞機能のコンテキストでグローバルなホストシグナル伝達カスケード、解析のための新たな道を開いていて、病原体の内在化20。ゲノム規模のsiRNAスクリーンは、以前L.の感染に必要な細胞のカスケードを調査するために行われている食細胞ショウジョウバエのリステリア 21〜22が、この種の分析は、非食細胞中で行われていない、 生体内での感染のための重要な目標を表すものです。
我々はLで、感染の後期の顕微鏡検出のためのプロトコルを最適化しています上皮細胞内の細菌侵入のハイスループットのsiRNAの研究に適していネス 。我々のアッセイは、侵襲性の高いLのを利用していますprfAを点変異を提示するリステリア株、L.の主要な転写調節因子病原性は6因子 モノサイトゲネス ：（prfAを*という名前）は、この変異は23 prfAをが構成的に活性なレンダリング、したがって、そうでなければ不十分な感染非食細胞における細菌侵入を好む、侵入タンパク質INLAおよびinlBの発現増加につながる。感染のための私達の読み出しは、分泌された細菌タンパク質InlCの細胞質ゾル蓄積の検出に基づいている。この分子である細胞質内Lで優先的に発現される多面的エフェクターリステリア 9と参加し、細菌細胞間に24を広めるだけでなく、宿主の免疫応答25を変調するだけではなく。細胞内細菌によるInlC分泌の蛍光標識は、明らかに非感染細胞からの感染を区別することを可能にするだけでなく、その後の別工程で感染を分析するために使用することができ、エンドポイントの読み出しを表していない場合のみ：エントリー、液胞の脱出、細胞質性細菌を増殖および細胞から細胞への広がり。この顕微鏡ベースのプロトコルは、したがって、L.による宿主細胞の感染に関与する細胞経路を研究するためのsiRNAスクリーニングに結合することができるリステリア 。
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Protocol
1。携帯電話や細菌培養、トランスフェクションツールと一次抗体の調製
- 個々のLを分離するために、新鮮な寒天プレートを準備します細菌グリセロールストック（50％glycerol/50％飽和菌液一晩培養）からのリステリアコロニーは-80℃で保存
- ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上で凍結した細菌グリセロールストック、ストリーク細菌を輸送するために（-80℃で保存）、アルミラックを使用。
- 48時間（または個々の細菌コロニーを単離することができるまで）の間、37℃でプレートをインキュベートする。
- （それは液体培養を播種するために使用されます）1月の最大時間の間、4℃で、その後このワーキングプレートを保管してください。
- 我々のプロトコルでは、L.を使用図1、Lに示すようにEGDe.PrfA *株1/2A血清型リステリアが、 P14.PrfA 4B リステリア血清型は、*株は、同様の結果が得られます。
- 彼ラATCC CCL2の細胞は、抗生物質の非存在下で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で増殖させる。
- 独立したスクランブルのプール（対照）および抗MetをsiRNAは、黒色384ウェル顕微鏡細胞培養プレートにロードされる。
- RNaseフリー水500μlのsiRNAの160ピコモルを希釈し、ウェル当たり、この溶液5μl（最終濃度：1.6ピコモル）を追加します。
- 1年間の最大期間、-20℃で、このプレートを保管してください。
- 先に説明したように25 InlC-GST組換えタンパク質を用いて免疫化することによって得られたInlC細菌タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体。
2。のsiRNA細胞トランスフェクションを逆転
- 感染前の72時間は、各ウェル中で室温にRNaseフリー水5μlの1.6 pmolのsiRNAを含む黒色384ウェル顕微鏡細胞培養プレートをもたらす。
- 300で3分間プレートを遠心分離ウェルの壁に堆積されている可能性のsiRNAをダウンさせるために、室温でRCF。
- 0.4％リポフェクタミンRNAiMAXトランスを補った室温のDMEMを準備します。
- （siRNAのに追加する前に、より長い20分よりトランスフェクション培地をインキュベートしないでください）を各ウェルにDMEM / RNAiMAXトランスフェクション培地を25μLを加える。
- を形成するためのsiRNA-リポフェクタミン複合体を可能にするために室温で1時間プレートを保持次いで、トランスフェクション溶液でのsiRNAを混合するためにプレートを前後に移動させる。
- コンフルエント又は10ミリリットル37°C予め温めたPBSで1回、サブコンフルエント細胞培養フラスコからの洗浄HeLa細胞。
- 1ミリリットル37℃の細胞培養フラスコにトリプシンを予め温め、37℃で3〜5分間インキュベート添加することによってHeLa細胞をデタッチ
- 10ミリリットル、37℃で再懸濁細胞を、16％FBSを補充したDMEMを予め温めた。
- 細胞を計数し、補充したDMEM 1ml当たり12,000細胞の細胞懸濁液を調製16％FBS。
- 384ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液50μlを加える。
- 細胞を分配し、細胞を室温で10分間落ち着かせて前後に迅速にプレートを移動させる。
- パラフィルムでプレートを密封し、37℃で加湿した5％CO 2含有雰囲気中で72時間それを維持
3。携帯感染染色
- 感染の前日には、Lの単一コロニーを取るBHI寒天プレートからのリステリアとを15mlポリスチレンチューブ内の液体のBHI培地5ml中に再懸濁する。
- 細菌増殖を可能にするためにshacking装置中で37℃で一晩インキュベートする。
- 感染日、一晩L. 1mlの洗浄し卓上型遠心機で10,600 RCFで2分間遠心分離することによって文化をリステリア 。
- （分泌された細胞毒素テリオOを含む）上清を捨て、1mlのPBSに再懸濁ペレット（repea）洗浄工程を3回以上トン。
- 600 nmでの細菌の光学濃度を読んで、細菌の数を（OD = 1は1E9細菌/ mlに相当します）を推定する。
- 適切なLを用意する1％FBSを添加したDMEM中で希釈リステリア ：EGDe.PrfA *のような侵襲性の高い株を用いて、ウェル当たりの培地30μlに5E4の細菌の使用を（感染多重度が2000細胞について25と推定されている）を示唆している。
- 各ウェルの細胞培養培地（80μL）を取り外し、Lの30μLを追加することによってそれを置き換える培地リステリア含有。
- 感染プロセスを同期するために、室温で5分間、200 rcfでプレートを遠心分離する。
- 予め温めておいたアルミブロック上、37℃で加湿した5％CO 2含有雰囲気中で1時間プレートをインキュベート。
- Lを削除する各ウェルからリステリア含有培地および10％FBSを添加したDMEM予め温め30μlのを追加し、細胞外Lを殺すために40μg/ mlのゲンタマイシンリステリア 。
- あらかじめ温めておいた金属ブロック上で37℃、5％のCO 2を含む雰囲気中で4時間インキュベートする。
- PBSの溶液を調製し（ホルムアルデヒドモノマーではなく、パラホルムアルデヒドポリマーが、使用されているように、この溶液を新たに調製すべきである）8％ホルムアルデヒドを補充した。
- 細胞培養培地を廃棄せずに、8％のホルムアルデヒド（最終濃度：4％）を補充したPBSの30μlを添加し、室温で15分間インキュベートする。
- 固定液を除去して（ウェルあたりのPBSを80μlの最終体積中に細胞を維持する）ウェル当たりのPBS 80μLで細胞を3回洗浄する。
- 調製1:250のPBS中のウサギ抗InlC血清の希釈は、0.2％サポニンを補充。
- PBSを除去した後、各ウェルに一次抗体溶液10μlを添加し、室温で30分間インキュベートする。
- 原発を捨てる抗体溶液とウェルあたり40μlのPBSで4回洗浄する。
- 0.2％サポニンを補充したPBSで二アレクサフルーア546結合抗ウサギ抗体（1:250）、DAPI溶液（1:1,500）およびファロイジン-DY647（1:150）に希釈する。
- 各ウェルに、この二次染色溶液10μlを添加し、室温で30分間インキュベートする。
- 二染色液を捨て、（各ウェルに40μLの最終容量を残して、プレートをシール）ウェルあたり40μlのPBSで4回洗浄する。
- プレートは直ちに画像化することができ、またはその後の分析のために、光から保護された4°C（アルミホイルで覆う）で保存することができる。
4。画像収集と分析
- 10倍の対物レンズを使用して3の異なるチャネル（350ナノメートル、546ナノメートルと647ナノメートル）内の画像を取得する（ウェルあたり優先的に9画像を取得する）自動顕微鏡に搭載された。
- InlC信号は、画像を用いて測定することができるそれぞれ、DAPIおよびファロイジン染色を用いて、核および細胞体の自動セグメンテーションを可能にするCellProfiler等解析ソフトウェア。
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Representative Results
細胞質InlCの蛍光標識は、L.により細胞感染のための堅牢な読み出しを提供していますリステリア 、 図1に示されるように：それは位相コントラスト画像（矢印、 図1A）で観察することができ、それがどこにDAPI信号によって確認されるように、顕微鏡写真の中央のセルは非常株P14.PrfA * 23に感染している個々の細菌は、明らかに（ 図1B）を区別することができる。 （図1C中のDAPI染色を重畳）InlC染色は、この分泌されたタンパク質が密に感染した細胞のサイトゾル中に蓄積し、感染した宿主細胞形態の明確な検出を可能にする方法を示している。蛍光ファロイジン（ 図1D）とアクチン細胞骨格の染色は完全に接種された細胞の単層の形態に関する情報を提供し、さらに、どのように、隣接する非感染細胞（*印細胞核）D示しOどんなInlCラベルが表示されませ。これは、細胞質ゾルInlCレベルは、細胞質の細菌数に依存していることから、我々は免疫蛍光とLの数で検出されたInlC信号との相関関係を指摘している、ことを言及する価値があるセル当たりのリステリア ： 図1で観察されたように、低細菌数を感染させた隣接セルを定量化することができる減少InlC染色を表示する。興味深いことに、アクチン染色（ 図1D）を用いても観察されるようにInlCを容易に細胞から細胞への広がり（ 図1C）の処理に巻き込ま細菌によって形成された突起で検出されることを観察することも可能である。注目すべきは、細菌が直接我々のプロトコルで染色されず、488nmのチャネルは、L.を用いないためリステリアは、特定の抗細菌血清を用いて標識することができ、そうでなければ、GFPを発現する細菌が代わりに使用することができる。
例えば、tのような画像解析ツールを使用して彼パブリックソフトウェアCellProfiler（ブロード研究所、 www.cellprofiler.orgは ）、それは、セグメントを細胞に可能であり、特定の実験条件の感染率を推定するために使用することができる個々の感染細胞におけるInlC信号を測定する。 図2に示すように、DAPI（ 図2A）を有する核およびファロイジンによるアクチン細胞骨格（ 図2C）の標識化は、細胞分割に必要な情報を提供する：核は、個々の細胞の同定のための参照オブジェクト（ 図として使用されている2B）および細胞質はその後考慮細胞骨格信号（ 図2D）かかり、核から広がり関数を用いて同定される。最後に、InlC信号の強度は、数を推定するために識別された各オブジェクトの細胞（ 図2Eおよび2F）について定量化することができる我々は負考慮するInlC強度のしきい値を設定することにより、細胞を感染させた。感染指数は、集団中の細胞の総数で割った、感染した細胞の数として計算される。
我々のプロトコルは、L.による宿主細胞の感染中の標的分子の大きなパネルの機能を調査するためのsiRNAスクリーニングに結合することができるリステリア 。対照はトランスフェクションの効率を検証するために必要とされる：例えば、KIF11を標的とするsiRNAは、細胞死をもたらすトランスフェクションのために一般的に使用される制御であり、従って、アッセイの終了時に細胞の不在は、トランスフェクションが効率的に進行したことを示す。特にLを対処するために、浸潤プロセスリステリア 、HeLa細胞におけるMetの細胞受容体のsiRNA不活性化は、宿主細胞への細菌侵入の主要な阻害をもたらすし、接種した細胞の単層（ 図中InlC陽性細胞の非常に低いレベルにつながるスクランブルsiRNAコントロール（ 図3B）で処理した細胞と比較して図3（a））。未知の候補分子の機能は、標準として既知の細胞分子を用いて我々のアッセイで調べることができる。
図1。 L.に感染したHeLa細胞におけるInlC標識の検出リステリアは * P14.PrfA株。ヒーラCCL2細胞は我々のプロトコルで説明したように、感染して免疫蛍光のために処理され、63Xの対物レンズを用いて画像化されています。 （A）位相コントラスト画像、いくつかのP14.PrfA *細菌が矢印で示されている。 （B）DAPI染色（青色）、（A）と同様の個々の細菌は矢印で標識される。 （C）DAPI染色（青色）の重ね合わせとInlC染色（赤）は、非感染細胞の核は、アスタリスクでラベル付けされている。 （D）InlCの重ね合わせ（赤）とアクチン（緑色）信号。バー：5μmと大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。 L.に感染したHeLa細胞のセグメンテーション解析リステリアは * EGDe.PrfA株。ヒーラCCL2細胞は我々のプロトコルで説明したように、感染して免疫蛍光のために処理され、10倍の対物レンズを使用して画像化した。 （A）DAPI信号。 （B）DAPI信号（青）の重ね合わせは、（A）に表示され、アクチン信号（赤）核のセグメント化を示す図（C）に表示される（viはEW）インセットを拡大。 （C）アクチン信号。 （D）（B）同じ細胞の画像セグメント化を示す。 （E）InlC信号。 InlC染色（黄色）との重ね合わせ（F）（D）と同じ画像。バー：50μmの大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。 Metおよび対照細胞を不活性化セル間InlC標識の変動のHeLa CCL2細胞は最初に逆トランスフェクトした宿主細胞受容体のMetを標的とする4 siRNAのプールを用いて;説明したように、トランスフェクション後72時間、細胞を感染させ、免疫蛍光のために処理し10倍のオブジェクトを使用して画像化IVE。 DAPI（青）の（A）重ね合わせ、アクチン（赤）及びMet不活性化細胞における（イエロー）InlC。 （B）スクランブルsiRNA対照で処理した細胞についての（A）のように同じチャネルを。バー：50μmの大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
いくつかのパラメータがInlC信号の明確な検出を可能にする十分に大きな細胞質を表示する健康な細胞株の使用を含む、我々のInlC検出プロトコルの成功のために重要である。検定では、我々は、それらの細胞質ゾルのスペースの拡張に私たちの分析に特に適しているのHeLa CCL2細胞の使用を提案し、この記事で提示し、このようなヒーラ京都細胞のような他のHeLa細胞クローンは小さく、細胞質を表示しますが、使用することができます我々の感染プロトコルで（細胞はしばしばCCL2のHeLa細胞の場合の隣接セルと重ならないので、京都のHeLa細胞を、特によくセグメンテーション分析のために適合されている）。このような多形核細胞やマクロファージなどの非常に小さな細胞質を提示する細胞は、我々のプロトコルと組み合わせて使用することが推奨されていません。
我々がここに存在する1つの撮像プロトコルの制限は、細胞の最小量INFEする必要があるということである十分な分解力電力をシステムに提供するために、対照条件における所与の単層、CTED：少数の細胞が感染している場合、それ以外の場合には、感染率の変化を決定することが困難となり、特に潜在的な分子候補の機能を調査する際感染症を減らすことが期待。 L.のための唯一の表面受容体としてMetを発現するHeLa細胞を用いた場合、この制限は、実際の問題を表すタンパク質INLBはモノサイトゲネス 、したがって不十分最もL.によって侵略されるリステリア株 。一つの選択肢は、侵襲性細菌の数を増やすだけでなく、細菌孔形成毒素リステリオリシンOの細胞培養培地（の上位レベルの細胞損傷のリスクを増大させることができる感染の非常に高い多様性を（MOI> 100）を使用することである非常に強力な細胞傷害活性を示すLLO）。他の代替は、我々のプロトコルで提示EGDe.PrfA *株などの超侵襲株の使用である低MOI（<25）の使用を可能にし、LLO-依存性細胞傷害作用の量を減少させる; L.用いて得られた結果リステリア超侵襲性株は、続いて（下記参照）のアッセイの他の種類の他のあまり病原性細菌株を使用して検証することができる。第三の選択肢は、E-カドヘリンおよびMetの両方を発現する異なる細胞株を使用することです：それは両方に侵略することができるように栄養膜様JEG3またはBeWo株細胞、または結腸癌LoVo細胞のような細胞株の場合であるINLA-およびinlB依存エントリ経路は、これらの細胞株において、細胞感染率が高いは、L.を使用して到達することができます*このようなネスEGDe、EGDe.PrfAの親株として株をリステリア 。これは、エフェクタが困難な結果の分析をレンダリングする、他の経路に不活性化されたときしかし、両方の経路で機能の冗長一経路における補償効果につながることが、考慮されるべきである。これは、THAに言及することも重要であるT細胞は感染を増大させる事象の検出を可能にする優れたダイナミックレンジを有するシステムを提供するために、感染した過剰であってはならない：私たちの特定のプロトコルでは、我々のMOIが30％の最適な感染率をもたらす。
L.によって宿主細胞の浸潤を研究するための代替方法リステリアは、（我々の感染プロトコルの最初の部分に記載された手順と同様の）細菌感染の初期期間後に細胞培養培地へのゲンタマイシンを添加することによって細胞外の細菌の死滅に基づいている古典的なゲンタマイシン浸潤アッセイ26を含み、浸潤は、寒天プレート上で生存している細胞内細菌をプレーティングし、これらのプレート上で増殖単位（CFU）を形成するコロニーの数を数えることによって評価する。この方法は、感染の最も直接的な読み出しを使用することの利点を提示し、実際にゲンタマイシンtreatmeから保護される侵襲性細菌の正確な数であるntの宿主細胞の細胞質空間であるが、この方法は感染症のための単一の読出しを提示せず、宿主細胞は、細胞内のCFUを放出するために溶解されると、エンドポイントでの細胞の実際の状態に関する情報を取得するレコードがなくなっ実験。我々のプロトコルは、間接法、InlC分泌タンパク質の検出に基づいているが、前述したように、細胞質InlCのレベルは、細胞質ゾルL.の数と相関しているリステリア （ 図1）。さらに、我々の顕微鏡アッセイの固有の性質は、明らかに感染の終了時に、細胞の正確な状態を確立することを可能にする：我々は、したがって等グローバル細胞形態、アクチン細胞骨格分布、細胞周期相に関する情報を抽出し、高含量を行うことができる感染の分析。このタイプの分析から抽出することができる一つの重要な特徴は、人口コンテキストおよび感染に対するその影響である：確かに、Pelkmansと同僚27からの最近の研究は、特定の細胞の特定の集団のコンテキストは（例えば、膵島内の細胞のグループ内の周辺部からの位置）がウイルス感染へのエンドサイトーシスおよび感受性を含むいくつかの細胞機能に影響することを明らかにした。我々のアッセイは、したがって、この情報を抽出するための可能性を提示します。
我々の方法は、追加の利点を提供する：InlCによる細胞質細菌によるその分泌への感染の後期の読み出しであることから、宿主細胞内でInlC蓄積のレベルに影響を与えるホストのシグナル伝達経路は、潜在的に細菌侵入だけでなく、液胞、エスケープ、細胞質ゾルの増殖だけではない影響を与える可能性が最終的には細胞 - 細胞の広がり。従って、我々の方法は、グローバルな感染の主要な読み出しとして使用することができ、siRNAのスクリーニングを介して同定プライマリーヒットにより摂動された特定の感染工程を分析する二次アッセイに結合することができる。 最後に、我々の方法は、従って、手動で行われた実験と比較した場合の検索結果の変動のレベルを減少させながら、単一の実験で分析されたサンプルの数を増加させる、プレート洗浄装置を用いてアップスケーリングし、完全に自動化することができることに言及することが重要である。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
P. Cossart研究室での研究は、パスツール研究所、研究所国立·デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicale、研究所国立·デ·ラ·ルシェルシュAgronomique、ERCアドバンスト·グラント（233348）、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（グラント三重でサポートされているSignRupVac）、ルイ·Jeantet財団と財団ル·ロッシュレMousquetaires。 AKは、パスツール、パリ大学国際博士課程/研究所カルノー病気Infectieusesから奨学金の受取人である。我々は、細胞のトランスフェクションプロトコルを最適化するためのジェイソンマーサーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
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免疫学、発行79、HeLa細胞、リステリア菌、グラム陽性細菌感染、蛍光、高スループットスクリーニングアッセイ、RNA干渉、リステリア菌、感染症、顕微鏡、低分子干渉RNAErratum
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014.
Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
