Summary
Mit einer Webcam und einer Kombination aus kostenlosen und kostengünstigen Software-Programme können Lokomotive Muster in Drosophila melanogaster analysiert werden, um Unterschiede in der Geschwindigkeit, Distanz, Zeit und der verschiedenen motorischen Aktivitäten zu erkennen.
Abstract
Video-Tracking-Systeme sind weit verbreitet, um Drosophila melanogaster Bewegung erkennen und analysieren verschiedene Anomalien im Verhalten Lokomotive. Während diese Systeme kann eine Fülle von Verhaltens Informationen zu liefern, können die Kosten und die Komplexität dieser Systeme unerschwinglich für viele Labore. Wir haben eine Low-Cost-Assay zur Messung Lokomotive Verhalten und Beschlagnahme Bewegung in D. melanogaster entwickelt. Das System verwendet eine Web-Cam Bilder, die mit einer Kombination aus preiswerten und freie Software auf die Spur der Abstand bewegt verarbeitet werden können, zu erfassen, die mittlere Geschwindigkeit der Bewegung und die Dauer der Bewegung während einer bestimmten Zeitspanne. Um den Nutzen dieses Systems zu demonstrieren, untersuchten wir eine Gruppe von D. melanogaster-Mutanten, die Bang-und Kleinschreibung (BS) Gelähmte, die 3-10 mal anfälliger für Beschlagnahme-ähnliche Aktivität (SLA) als Wildtyp-Fliegen sind. Unter Verwendung dieses neuartigen Systems, waren wir in der Lage, zu erkennen, dass die BS Mutant Knall sinnlos (BSS) weist geringere Sondierungsfortbewegung in einer neuen Umgebung als Wildtyp-Fliegen. Außerdem wurde das System verwendet, um zu identifizieren, dass das Medikament Metformin, die üblicherweise verwendet wird, um Typ-II-Diabetes, reduziert die Intensität des SLA in den BS-Mutanten.
Introduction
Aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und die robusten genetische Werkzeuge zur Verfügung, ist Drosophila melanogaster eine ausgezeichnete Modellsystem für die Untersuchung der Ursachen verschiedener Erkrankungen und die zugrunde liegende Physiologie der verschiedenen biologischen Prozessen. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, um die Auswirkungen, dass Verhaltens, genetische oder pharmakologische Manipulationen haben auf die Fortbewegung in diesen Modellorganismen 1,2 messen.
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die üblicherweise zur Messung der Flugbewegung in zwei Dimensionen 3-7 verwendet werden. Diese Systeme können die Tracking von mehreren Fliegen gleichzeitig unterstützt und kann Geschwindigkeit, Plattenpfadlängen messen und aufzeichnen den Prozentsatz der Zeit eine Fliege verbrachte bewegt. Sie wurden benutzt, um die Bewegung in einer Vielzahl von Zusammenhängen einschließlich der Auswirkungen von Drogen auf die Fortbewegung und die sexuelle Natur der Fliege dimorphic Bewegung 6-9 studieren. Der wesentliche Nachteil dieser Systeme sind die Kosten der Spur system oder die entsprechende Software und Kamera. In einigen Fällen kann dies in die Tausende von Dollar. Die Kosten sind ein besonderes Anliegen für ein Labor, die nur noch eingeschränkte Nutzung würde ein solches System, zum Beispiel, Quantifizierung Lokomotive Muster eines neu isolierten Mutante.
Eine einfachere, aber weniger robuste Methode ist es, Systeme, die Rekord-Bewegung auf, wie oft eine Fliege kreuzt einen Infrarotlichtstrahl Pfad, der in der Mitte des geschlossenen Rohr 10,11 platziert wird, verwenden. Während solche Systeme können wertvolle Informationen über die Bewegung und Schlaf-Wach-Zyklen geben, können sie über oder unter Schätzung Bewegung, weil sie nicht den tatsächlichen Pfad der Fliege zu erfassen. So wird beispielsweise Fliegen, die erhebliche Bewegung zeigen an den Enden der Röhre so niedrig Bewegung registrieren fliegt obwohl zusätzliche hochauflösende Methoden verwendet wurden, um zu versuchen, diese Einschränkungen zu umgehen 12.
Einfacher und noch billiger sind Klettergeräte, die geotaxi messens, die Aufwärtsbewegung entfernt, durch ein einzelnes Rohr oder eine Reihe von Rohren 2,13. Während solche Systeme sind billig und leicht erkennen können Geotaxis Mängel, scheitern sie an viele andere Aspekte der Bewegung, die von Interesse für die Ermittler wäre zu erfassen.
Für viele Labors, eine kostengünstige robuste Analysesystem, das einfach zu gründen und zu betreiben wäre eine vorteilhafte Werkzeug zur Charakterisierung von Verhaltensunterschiede in D. melanogaster Stämme sein. Hier beschreiben wir einen Assay, der Set-up kann die weniger als zweihundert Dollar und ist in der Lage, Informationen über den Weg, Geschwindigkeit und Dauer der Bewegung der Fliege geben. Um die Wirksamkeit des Tests nachweisen, Daten, die zeigen, dass es verwendet werden kann, um zu identifizieren, präsentieren wir: 1) eine Bewegungs Defekt in einem Bang-und Kleinschreibung (BS)-Mutante, die anfällig für Anfälle und 2) die Fähigkeit des Medikaments Metformin, ist die wird häufig verwendet, um Typ-II-Diabetes zu behandeln, um die Intensität der Beschlagnahme-ähnliche Aktivität (SLA) i reduzierenn zwei BS Mutanten.
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Protocol
1. Erstellung von individuellen Fliegen für Locomotion Assay
- Über fliegt durch leichtes Klopfen in einzelne leere Fläschchen und Kappe die Fläschchen mit einem Wattebausch. Lassen Fliegen ungestört 20-30 min vor Beobachtung zu sitzen. Es ist wichtig, um die Fliegen in den Stunden vor der Verhaltensbeobachtung nicht betäuben wie frühere Studien haben gezeigt, Anästhesie Exposition Verhalten zu ändern im Vergleich zu 14 narkotisierten Fliegen.
- Klopfen Sie leicht die Fliege aus dem Fläschchen und legen einzelne Fliegen unter einem Durchmesser von 5 cm Petrischale Deckel (5 mm hoch) mit kleinen Schlitzen auf Luftdurchgang zu ermöglichen. Illuminate von unten und beobachten Sie die Fliegen mit einer Webcam über der Petrischale montiert.
2. Erstellung von individuellen Fliegen für Beschlagnahme Assay
- Feed-zwei Tage alten Beschlagnahme empfindlich Fliegen entweder Standard-Hefe / Maismehl / Agar-Medien-oder Standard-Medien direkt mit Drogen gemischt. Für die hier vorgestellten Daten wurden Fliegen entweder ein unterwegs zugeführtf Standardmedien oder 1 g Standardmedien mit 25 mg Metformin gemischt.
- Nachdem die Fliegen haben für zwei Tage auf die Medien oder Medien sowie Drogen zugeführt wird, übertragen Sie sie durch leichtes Klopfen in einzelne leere Flaschen und Fläschchen, die Kappe mit einem Wattebausch. Lassen Sie fliegt nach 20 Minuten ruhig stehen, bevor Beobachtung. Es ist wichtig, um die Fliegen in den Stunden vor der Verhaltensbeobachtung nicht betäuben wie frühere Studien haben gezeigt, Anästhesie Exposition Verhalten zu ändern im Vergleich zu 14 narkotisierten Fliegen.
- Vortex einzelnen Ampullen mit einer Fliege auf einem Vortexer Labor mit der höchsten Einstellung für 10 Sekunden. Legen Sie die immobilisiert Fliege auf einem leeren weißen Blatt Papier direkt unter einer Webcam über der Papier montiert.
3. Video Recording
- Nehmen Sie die Bewegung oder die SLA mit dem Software-Programm HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Dieses Programm verwendet die Webcam andie Aufnahmen auf der Basis der Benutzereinstellungen.
- Wählen Sie die Option Bilder Zeitraffer der Registerkarte Capture Wenn das Fenster öffnet, wählen Sie die Webcam als Aufnahmegerät. Bei den meisten Versuchen wurde die Videobildgröße von 640 x 480 ist ausreichend.
- Wählen Sie Intel IYUV Codec für die Komprimierung und wählen 0,1 sec / Rahmen für die Beschlagnahme-Assay oder wählen 0,1-0,5 sec / Rahmen für die Bewegung Assay. Auf der Registerkarte Erweitert, wählen Sie schaffen ein. BMP-Bild-Datei für jede Erfassung und wählen Sie einen Ordner für das Programm, um die Bilder, die es braucht (die Bildstapel) zu speichern.
- Legen Sie eine tote Fliege auf dem Blatt Papier. Klicken Sie auf das Video Feld Einstellungen und passen Sie die Einstellungen auf der Registerkarte Geräteeinstellungen so, dass es einen hellen weißen Hintergrund und eine klare Kontrast zu den dunkleren Fliege.
- Klicken Sie auf die Start-Taste, um die Aufnahme zu starten. Sobald die Aufnahmedauer beendet ist, klicken Sie auf die Stopp-Taste. Die Bildstapel sollte nun in der ausgewählten Ordner. Hinweis: Vor der Aufnahme sicher, dass die folder für die Bildstapel ausgewählt ist leer.
4. Datenanalyse mit ImageJ
- Offene NIH kostenlosen Bildbearbeitungssoftware ImageJ, die heruntergeladen werden kann http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Hinweis: Neben dem Herunterladen des Programms, muss der Multitracker-Plug-in heruntergeladen und installiert, wie bei angegeben werden http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- Importieren Sie die Bildstapel in ImageJ, indem Sie auf der Registerkarte Datei und wählen Sie dann Import → Bildsequenz.
- Wählen Sie den Ordner, der die Bildstapel enthält, markieren Sie eines der Bilder und wählen Sie geöffnet. Eine Sequenz Optionen Dialogfeld wird geöffnet. Klicken Sie auf die Namen numerisch sortieren und wählen Sie OK und die Bildstapel werden in ImageJ geladen werden.
- Schwellen alle Bilder, so dass jedes aus einem weißen Hintergrund mit der Flug wobeiumgewandelt, um einen schwarzen Punkt. Um diesen Prozess zu beginnen, konvertieren Sie das Bild in ein 8-Bit-Format, indem Sie → 8-Bit-Typ unter der Registerkarte Bild.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Bild und wählen Sie erneut einstellen → Threshold. Dies eröffnet den Threshold Dialogbox, in der die Schwelle abgeschnitten Punkt kann eingestellt werden.
- Scannen Sie durch die Bilder zu sehen, ob es zusätzliche schwarze Punkte oder wenn ein Stück fehlt ein schwarzer Punkt. Wenn dies der Fall ist, der Schwellenwert eingestellt werden, um das Problem zu lindern. Regel die Schwelle muss nicht als Standardprogramm auf einen angemessenen Wert eingestellt werden.
Hinweis: Jede Folie in der Stapel sollte nur ein schwarzer Punkt, der die Position der Fliege haben. - Wählen Sie gelten in der Schwelle Dialog und eine Umwandlung in Dialog-Maske wird geöffnet. Klicken Sie nicht auf eine der Optionen, sondern einfach auf OK, um Schwellen klicken Sie auf die Bildstapel.
- Nach den Schwellenbildstapel, wählen Sie den Multitracker-Plug-in auf der Registerkarte Plugins, ummessen die Bewegung der Fliege in Pixel. Der Objekt-Tracker Dialogfeld erscheinen.
- Klicken Sie auf alle vier Optionen im Dialogfeld gegeben, und wählen Sie OK. Der Multitracker Plug-in wird dann bringen Koordinaten an dem schwarzen Punkt in jeder Scheibe und listen diese im Fenster Ergebnisse sowie die gesamte Weglänge in Pixel. Das Fenster Pfade gibt eine grafische Anzeige des Weges die Fliege nahm.
- Kopieren Sie die x-und y-Koordinatenliste aus dem Fenster Ergebnisse und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle. Wenn eine Folie in der Stapel nicht über einen schwarzen Punkt in ihr, wird die Multitracker-Programm an dieser Folie zu stoppen. Wenn dies geschieht, ist es notwendig, zurück auf 4,2 und Re-Schwelle den Stapel Schritt, um sicherzustellen, dass die Fliege Register als schwarzer Punkt in der Folie in Frage.
- Um wandeln die Weglängen von Pixel cm, einen separaten Bild von zwei Punkten, die einen cm auseinander auf ein weißes Blatt Papier angeordnet sind.
- Folgen Sie der obenSchritte (3.1-4.4.2), um die x bestimmen, y-Koordinaten für die beiden Pixel-Punkten und verwenden diese Informationen, um die Anzahl der Pixel, die einen cm zu bestimmen. Dieser Umrechnungsfaktor wird in Schritt fünf verwendet, um Bewegungsdaten in cm zu erzeugen. Hinweis: Sobald dies erledigt ist, ist es wichtig, die für alle zukünftigen Aufnahmen feste Kamera halten. Jedes Mal, wenn die Kamera bewegt wird oder eingestellt werden, muss man diesen Schritt wiederholen, um die Pixel cm konvertieren.
- Die Pfadlänge, die von der Multitracker-Plug-in erzeugt wird überschätzt Bewegung, weil geringe Schwankungen der Körperposition und der Lichtintensität / Reflexion wird die Größe und die Mitte der schwarzen Punkt, der erzeugt wird, wenn Schwellen die Bilder beeinflussen. Dieses Geräusch muss, um eine genaue Schätzung der Fliege Bewegung bekommen entfernt werden.
5. Datenanalyse mit Excel
- Entfernen Sie das Rauschen aus den aufgezeichneten Daten durch den Import der Serie von x, y-Koordinaten durch die Multitracker pr erzeugtOgram in Fly-Analyse, einer Excel Visual Basic-Programm von den Autoren. (Das Programm ist durch Kontaktieren der Autoren verfügbar.)
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Klicken Sie mich an und wählen Sie einen Schwellenwert Abschaltung. Einen Schwellenwert von 0,5 cm / sec Wählen Sie für SLA-Analyse oder wählen Sie einen Wert zwischen 0,1 bis 0,3 cm / sec für Bewegungsanalyse. Klicken Sie auf OK und das Programm wird die Geschwindigkeit, Zeit und Strecke der Bewegung zu berechnen. Hinweis: Das Programm verwendet eine Schiebefenster-Analyse, um die Daten in aufeinanderfolgenden Bins 0,5-1,0 sec bewerten und berechnet die Geschwindigkeit während dieses Fensters. Alles, was über den benutzerdefinierten Abschaltung wie Flugbewegung behandelt.
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Representative Results
Die hier beschriebene Technik bereits verwendet wurde, um Unterschiede in der SLA in den Drosophila-Mutanten BS 1 zu analysieren. Die hier dargestellten Ergebnisse beziehen die BS-Stämme leicht schockiert (EAS), Knall sinnlos (BSS) und technischen KO (TKO). Das EAS-Locus kodiert für ein Ethanolamin-Kinase in Phosphatidylethanolamin 15 Synthese beteiligt und die tko Locus kodiert für eine mitochondriale riboprotein 16. Die BSS-Mutation ist ein Allel des Gelähmten (para) spannungsgesteuerten Natriumkanal 17. Die in dieser Studie verwendeten Allele EAS 1, BSS 1 und TKO 25t.
Eine Darstellung der Wirksamkeit des Verfahrens zu messen SLA in Fig. 1, die im Vergleich zu einem die Weglänge eines EAS Anfall empfindlichen Steuer fly zeigt sehenwurde, dass das Medikament Metformin zugeführt. Metformin ist ein Biguanid zur Behandlung von Typ-II-Diabetes. Das Medikament hemmt mitochondrialen Atmungskettenkomplex I, die über die Hochregulation von AMPK, löst eine Zunahme der Glykolyse und Glukoseaufnahme in Säugetierzellen 18. Frühere Studien haben gezeigt, dass Metformin upregulates glykolytischen Genen, vermutlich, um die Hemmung des aeroben Stoffwechselpfade 19 zu kompensieren. Abbildung 2 zeigt, dass die Zuführung der BS Mutanten EAS tko Metformin und für zwei Tage (25 mg / g Nahrung) reduziert die SLA Weglänge .
Neben der Reduzierung der Weglänge, können die durch dieses Verfahren erzeugten Daten verwendet werden, um Unterschiede in der Geschwindigkeit und SLA SLA Dauer zu analysieren. In diesem Fall zeigen die Daten, dass SLA Dauer signifikant reduziert (Fig. 3), während SLA Geschwindigkeit änderte sich nicht signifikant (Fig. 4).
Die oben beschriebene Assay kann auch verwendet werden, um die Fortbewegung über einen definierten Zeitraum zu messen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für einen Pfad von einem Wildtyp-Sonder Kanton durchlaufen (CS) zu fliegen und ein Weg durch einen bss laufen fliegen über einen Zeitraum von 15 min. Während der Bewegung der beiden entfernt wurde an den Kanten der kreisförmigen Bereich konzentriert, zeigte der CS fly viel Fortbewegung über den Aufzeichnungszeitraum 15 min. Der Test ist daher nützlich bei der Betrachtung sowohl der Betrag der Bewegung und die Bewegungsmuster der Fliegen.
Der durchschnittliche Abstand von BSS entfernt laufen war signifikant niedriger als die der CS Linie wie in Fig. 6 angedeutet. Nicht nur die bss Fliegen anzuzeigen weniger Bewegung, sie neigten, mit einer langsameren Geschwindigkeit zu bewegen. Änderungen in der Geschwindigkeit der Bewegung der beiden Einzellinie sind in Fig. 7 dargestellt. Mit Hilfe dieser Daten kann eine Durchschnittsgeschwindigkeit berechnet und als in F verglichen werden ild 4 für SLA. Basierend auf den in Abbildung 7 gezeigten repräsentativen Fliegen, ist es offensichtlich, dass die CS Fliegen hatten häufiger Anfälle von schnellen Bewegungen, während die bss Fliegen hatte mehr Anfälle von Untätigkeit während der Periode, in der Abbildung dargestellt.
Fig. 1 ist. Repräsentative Wege der SLA in eas eas Mutanten und Mutanten geführt Metformin. Einzelne Fliegen waren schockiert, mechanisch SLA induzieren. Der Weg einer einzelnen Fliege während des SLA ist in der Abbildung dargestellt. A)-Pfad eines EAS-Mutante. B) Pfad eines EAS-Mutante eingespeist Metformin. (Bar entspricht 1 cm).
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2. Individuelle Fliegen waren schockiert, mechanisch SLA induzieren. Die Distanz die Fliege bewegt während der SLA wurde als Maß für die Intensität SLA verwendet. In beiden untersuchten Mutanten BS, Metformin signifikant reduziert die Strecke bewegt. Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test analysiert (* p <0,05, *** p <0,001, n = 15).
3. Individuelle Fliegen waren schockiert, mechanisch SLA induzieren. Die Zeit verbrachte die Fliege unterziehen SLA wurde als Maß für die Intensität SLA verwendet. In beiden untersuchten Mutanten BS, Metformin signifikant reduziert die SLA Dauer. Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test analysiert (* p <0,05, *** p <0,001, n = 15).
4. Individuelle Fliegen waren schockiert, mechanisch SLA induzieren. Die mittlere Geschwindigkeit der Fliege während des Kampfes von SLA wurde als Maß für die Intensität SLA verwendet. Es gab keine signifikante Veränderung der durchschnittlichen Geschwindigkeit für die beiden getesteten wenn Metformin speist BS Mutanten. Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test (n = 15) untersucht.
5. Pfade der einzelnen Fliegen in der Arena. Spuren stellen die einzelnen Pfade Fliegen in der Arena während der 15-minütigen Überwachungszeitraum durchlaufen wird. A)-Pfad eines aktiven CS Fliegen mit dem moserung konzentriert um den Umfang des kreisförmigen Arena. B) Pfad eines typischen bss Fliege. Bewegung war immer noch um den Umfang konzentriert, aber es war viel weniger Bewegung als im Vergleich zu CS Fliegen. (Bar entspricht 1 cm)
6. Fliegen, wenn die Fortbewegung auf einer neuen Umgebung ausgesetzt. Einzel Fliegen wurden in einer 5 cm Durchmesser Arena (5 mm in der Höhe) und Bewegung gesetzt wurde 15 min überwacht. Pfadlängen wurden für jede Fliege berechnet und die durchschnittlichen Längen wurden für jeden Genotyp übernommen. Das BSS-Mutanten eine signifikante Verringerung der Weglänge im Vergleich zu CS entfernt. Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test analysiert (** p <0,01, n = 10).
Abbildung 7. Geschwindigkeit als eine Funktion der Zeit während der Fortbewegung eines Sondierungs CS (A) und ein BSS (B) zu fliegen. Eine einzelne Fliege wurde in einer 5 cm Durchmesser Arena (5 mm in der Höhe) und Bewegung gesetzt wurde 15 min überwacht. Velocity wurde alle 0,5 sec durch Mittelung der Geschwindigkeit über einen 1 Sek. Schiebefenster berechnet (Bewegung von der vorherigen 0,5 Sek. nachfolgenden 0,5 Sekunden-Intervall.) Nach ein paar anfänglichen Ausbrüche von Aktivität der bss Fliege bleibt während der Studie relativ inaktiv.
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Discussion
Bei der Prüfung des Bewegungs oder Bewegungsmuster in Drosophila, ist es nützlich, in der Lage, Informationen über die zurückgelegte Wegstrecke, die Geschwindigkeit der Bewegung und die Bewegungsmuster zu extrahieren. Um diese Informationen zu extrahieren, hat teure Ausrüstung traditionell verwendet worden, die oft unerschwinglich für kleinere Labore oder Labors, die solche Tests sparsam verwenden möchten 4,8,9 ist.
Die hier beschriebenen Assays können zur Bestimmung der zurückgelegten Wegstrecke (2 und 6), die Geschwindigkeit der Bewegung werden (Fig. 4 und 7) und das Bewegungsmuster (Fig. 1 und 5) unter Verwendung von Ausrüstung, die weniger als zweihundert Dollar kosten . Mit der Excel Visual Basic Programm, das wir entwickelt haben, die Reihe der x-, y-Koordinaten, die von der ImageJ Programms analysiert werden, um all diese Informationen zu extrahieren erzeugt. Dieses System hatbereits verwendet wurde, um sowohl genetische und pharmakologische Unterdrücker der SLA in den Anfall empfindlichen Drosophila-Mutanten BS 1 zu identifizieren.
Während das System kann wertvolle Informationen zu extrahieren, wurden nur analysiert, eine Fliege auf einmal. Dies kann ein erheblicher Nachteil im Vergleich zu den hochparallelen Handelsmöglichkeiten 4 sein. Der Multitracker Plug-in für ImageJ hat zwar die Möglichkeit, mehrere Objekte gleichzeitig zu verfolgen, aber wir haben diese Option nicht versucht. Aus diesem Bewegungs Assay wird eine einzelne Fliege unter einer Plastikpetrischalendeckel angeordnet. Abhängig von der Position der Kamera, einer mehrere Petrischalen filmen parallele Aufnahmen machen. Der Nachteil ist, dass die Auflösung verringern, wie die Web-Kamera positioniert ist, in einen größeren Bereich zu übernehmen. Wie sich dies auf die Integrität der Aufnahme ist nicht bekannt, aber eine höhere End-Kamera wäre eine Option, wenn man Aufnahmen parallel verfolgen wollten.
Die Aufnahmen dhier werden nur 15 min, aber es ist möglich, längere Aufnahmen machen, wenn man die 64-Bit-Version von ImageJ beschäftigt. Die 32-Bit-Version hat eine Speichergrenze, die die Größe der Dateien ein analysieren einschränkt. Für längere Aufnahmen ist es wichtig, die 64-Bit-Version von ImageJ zu verwenden.
Eines der größten Probleme bei dieser Methode ist die Notwendigkeit, das Rauschen aus den durch die Verarbeitung in der ImageJ Software erzeugten Daten zu entfernen. Dies ist jedoch nicht nur in diesem Verfahren ähnlich Lärmprobleme müssen mit anderen Aufnahme-Optionen 3,5,6,8 gelöst werden. Wie in den Methoden diskutiert, kann eine stationäre Fliege kleinere Mengen von Bewegung an, wenn durch ImageJ verarbeitet werden, da das Programm misst Bewegung aus der Mitte des Objekts, die auch in einem stationären Objekt aufgrund von Schwankungen der Licht variieren und fliegen Körperhaltung kann.
Unsere Visual Basic Excel-Programm verwendet einen Schiebefenster-Analyse, einen Schwellenwert für Bewegung gesetzt. Diese threshold je nach Assay variieren. Für Beschlagnahme Analyse, sieht das Schiebefenster an zehn Aufnahmepunkte, die 1 Sekunde Echtzeit überspannt. Es ist, wenn die Fliege hat in dieser Zeit 0,5 cm oder mehr bewegt werden als aktiv ergreifen. Wenn er kleiner ist, wird es als in Ruhe. Bei der Betrachtung der normalen Bewegung ist eine untere Schwelle benötigt, um den Schnitt zu bestimmen ausgeschaltet, und muss über Versuch und Irrtum erreicht werden. Ein Schwellenwert von 0,1 cm / s wurde in dieser Studie verwendet. Der beste Weg, dies zu erreichen, ist die Aufnahme einer Fliege, während sie stationär für eine kurze Zeit ist und dann die Grenz, so dass es während der Aufnahme keine Bewegung zeigt.
Zusammenfassend stellt dieses Low-Cost-Methode eine praktikable Test zum Extrahieren aussagekräftige Informationen über die verschiedenen Parameter des Fliegenfortbewegung. Es ist eine ideale Screening-Technik zu verwenden, um festzustellen, ob eine Verhaltens, genetische oder pharmakologische Manipulation hat eine Wirkung auf die Fortbewegung oder die Krampfanfälligkeit.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten auch dank Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, und Megan Hyde für ihre Arbeit bei der Feinabstimmung dieser Test auszudrücken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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