Summary
Usando uma webcam e uma combinação de programas de software livre e de baixo custo, os padrões de locomotivas em Drosophila melanogaster podem ser analisadas para detectar diferenças na velocidade, distância e tempo de várias atividades motoras.
Abstract
Sistemas de monitoramento de vídeo têm sido amplamente utilizados para analisar Drosophila melanogaster movimento e detectar várias anormalidades no comportamento locomotiva. Embora esses sistemas podem fornecer uma riqueza de informações comportamentais, o custo ea complexidade desses sistemas pode ser proibitivo para muitos laboratórios. Nós desenvolvemos um teste de baixo custo para medir o comportamento locomotiva e movimento apreensão em D. melanogaster. O sistema usa uma web-cam para capturar imagens que podem ser processados usando uma combinação de software de baixo custo e livre para seguir a distância percorrida, a velocidade média de circulação ea duração do movimento durante um período de tempo especificado. Para demonstrar a utilidade deste sistema, que analisou um grupo de D. melanogaster mutantes, os paralíticos (BS) Bang-sensíveis, que são 3-10 vezes mais suscetíveis a atividade de apreensão semelhante (SLA) de moscas de tipo selvagem. Usando este novo sistema, pudemos detectar que o BS mutanat sem sentido estrondo (BSS) apresenta níveis mais baixos de locomoção exploratória em um ambiente de romance que tipo selvagem moscas. Além disso, o sistema foi utilizado para identificar que a metformina, que é vulgarmente utilizada para tratar a diabetes do tipo II, reduz a intensidade do SLA nos mutantes BS.
Introduction
Dada a sua curta vida útil e as ferramentas genéticas robustos disponíveis, Drosophila melanogaster é um sistema excelente modelo para investigar a etiologia de várias doenças ea fisiologia subjacente de vários processos biológicos. Em muitos casos, é vantajoso para medir os efeitos que as manipulações comportamentais, genéticos ou farmacológicos têm em locomoção nestes organismos modelo 1,2.
Há uma variedade de métodos que são geralmente utilizados para medir o movimento da mosca em duas dimensões 3-7. Estes sistemas podem apoiar o acompanhamento de várias moscas ao mesmo tempo e pode medir velocidade, comprimento do passo de registro e registrar a porcentagem de tempo que uma mosca passou em movimento. Eles têm sido utilizados para estudar o movimento numa variedade de contextos, incluindo os efeitos de drogas sobre a locomoção e a natureza sexual dimórfico de movimento mosca 6-9. A principal desvantagem desses sistemas é o custo dos sistemas de rastreamentotemperatura ou o software correspondente e câmera. Em alguns casos, isso pode ser executado em milhares de dólares. O custo é uma preocupação particular para um laboratório que só precisa de um uso limitado de tal sistema, por exemplo, quantificar os padrões de locomotivas de um mutante recém isolado.
Um método mais simples e menos robustos é a utilização de sistemas que o movimento ficha base em quantas vezes uma mosca atravessa um percurso de feixe de luz infravermelha, que está colocado no meio de um tubo fechado 10,11. Embora tais sistemas podem dar informações valiosas sobre ciclos de movimento e de sono-vigília, eles podem sobre ou sob estimativa movimento, porque eles não conseguem captar o caminho real da mosca. Por exemplo, moscas que apresentam movimento considerável nas extremidades do tubo vai registrar um preço tão baixo movimento voa embora os métodos de alta resolução adicionais foram usados para tentar contornar essas limitações 12.
Mais simples e mais barato ainda estão subindo dispositivos que medem geotaxis, o movimento ascendente das moscas, através de um único tubo ou uma série de tubos de 2,13. Embora esses sistemas são baratos e podem facilmente identificar defeitos geotaxis, eles não conseguem captar muitos outros aspectos de movimento que seria de interesse para os investigadores.
Para muitos laboratórios, um sistema de análise robusta de baixo custo que é simples de configurar e operar seria uma ferramenta vantajosa para a caracterização de diferenças comportamentais em D. melanogaster cepas. Aqui nós descrevemos um ensaio que pode ser set-up para menos de duzentos dólares e é capaz de dar informações sobre o caminho, velocidade e duração do movimento da mosca. Para demonstrar a eficácia do ensaio, foram apresentados dados mostrando que pode ser utilizado para identificar, 1) um defeito locomotor em um mutante Bang-sensível (BS), que é susceptível a ataques e 2) a capacidade da metformina, a qual é comumente usado para tratar a diabetes do tipo II, para reduzir a intensidade da atividade de apreensão semelhante (SLA) in dois mutantes BS.
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Protocol
1. Preparação de Individual Moscas para Locomotion Assay
- Transferência voa batendo suavemente em frascos individuais vazias e tampe os frascos com um tampão de algodão. Permitir moscas para se sentar sem perturbações 20-30 min antes da observação. É importante não anestesiar as moscas dentro das horas antes da observação comportamental em estudos anteriores descobriram que a exposição a anestesia podem alterar o comportamento em relação a moscas não anestesiados 14.
- Bata levemente a mosca do frasco e coloque moscas individuais sob a 5 cm de diâmetro tampa placa de Petri (5 mm de altura), com pequenas fendas para permitir a passagem de ar. Iluminar abaixo e observar as moscas usando uma webcam montada acima da placa de Petri.
2. Preparação de Individual Moscas para Apreensão Assay
- Alimente de dois dias de idade apreensão moscas sensíveis tanto media levedura / fubá / ágar padrão ou mídia padrão misturado diretamente com drogas. Para os dados aqui apresentados, as moscas foram alimentados com um movimentof mídia padrão ou 1 g de mídia padrão misturado com 25 mg de metformina.
- Após as moscas têm alimentado por dois dias na mídia ou mídia além de drogas, transferi-los agitando ligeiramente em frascos individuais vazias e tampe os frascos com um tampão de algodão. Permitir moscas para se sentar sem ser perturbado por 20 min antes da observação. É importante não anestesiar as moscas dentro das horas antes da observação comportamental em estudos anteriores descobriram que a exposição a anestesia podem alterar o comportamento em relação a moscas não anestesiados 14.
- Vortex frascos individuais contendo uma única mosca em uma vortexer laboratório usando a configuração mais alta por 10 segundos. Coloque a mosca imobilizada em uma folha branca de papel em branco logo abaixo de uma webcam montada acima do papel.
3. Gravação de Vídeo
- Registre o movimento ou SLA usando o programa de software HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Este programa utiliza a webcam paracapturar imagens com base nas configurações do usuário.
- Selecione a opção Time-Lapse imagens na aba captura, quando a janela abrir, selecione a webcam como o dispositivo de captura. Para a maioria dos experimentos o tamanho do quadro de vídeo de 640 x 480 é adequada.
- Selecione Intel IYUV codec para a compressão e escolher 0,1 seg / frame para o ensaio apreensão ou escolher 0,1-0,5 seg / frame para o ensaio de movimento. Na aba Avançado, selecione criar um arquivo de imagem. Bmp para cada captura e selecione uma pasta para o programa para armazenar as imagens que leva (a pilha de imagem).
- Coloque uma mosca morta na folha de papel. Clique na caixa de configurações de vídeo e ajuste as configurações na guia Configurações do dispositivo, para que haja um fundo branco brilhante e um claro contraste com a mosca mais escura.
- Clique no botão Iniciar para começar a gravação. Uma vez que o período de gravação tiver terminado, clique no botão stop. A pilha de imagens deve estar agora na pasta selecionada. Nota: Antes de gravar, verifique se a folder selecionado para a pilha de imagens está vazio.
4. Análise de Dados Utilizando ImageJ
- Imagem livre ImageJ software de processamento aberto do NIH, que pode ser baixado em http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Nota: Além de baixar o programa, o Multitracker plug-in deve ser baixado e instalado, conforme indicado no http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- Importe a pilha de imagens em ImageJ clicando na guia Arquivo e, em seguida, selecionando Import → seqüência de imagens.
- Selecione a pasta que contém a pilha de imagens, realce uma das imagens e selecione Abrir. Uma caixa de diálogo Opções de seqüência será aberta. Clique nos nomes Ordenar numericamente e em seguida, selecione OK ea pilha de imagem será carregada no ImageJ.
- Limite de todas as imagens, de modo que cada um constituído por um fundo branco com a mosca serconvertida para um ponto negro. Para iniciar este processo, converter a imagem para um formato de 8 bits, selecionando Tipo → 8 bit sob a guia Imagem.
- Clique na aba Imagem novamente e selecione Ajustar → Threshold. Isto irá abrir a caixa de diálogo Limiar em que o limiar ponto de corte pode ser ajustado.
- Digitalizar através de imagens para ver se há pontos pretos extras ou se uma fatia carece de um ponto preto. Se este for o caso, ajustar o limiar para aliviar o problema. Normalmente, o limite não precisa ser ajustado como o programa padrão para um valor adequado.
Nota: todos os slides na pilha deve ter apenas um ponto preto que representa a posição da mosca. - Selecione aplicar na caixa de diálogo Limiar e um convertido ao Máscara caixa de diálogo será aberta. Não clique em qualquer uma das opções, mas basta clicar em OK para limiar da pilha de imagem.
- Após limiarizar a pilha de imagens, selecione o Multitracker plug-in sob a aba Plug-ins, a fim demedir o movimento da mosca em pixels. A caixa de diálogo Rastreador de objeto aparecerá.
- Clique em todos os quatro opções dadas na caixa de diálogo e, em seguida, selecione OK. O plug-in Multitracker então anexar coordenadas para o ponto preto em cada fatia e listá-los na janela de resultados, bem como o comprimento total do caminho, em pixels. A janela Paths dá uma visualização gráfica do caminho a mosca pegou.
- Copie a lista x-e coordenada y da janela Resultados e colar os dados em uma planilha do Excel. Se qualquer slide na pilha não tem um ponto preto na mesma, o programa Multitracker parará em que slide. Se isso ocorrer, é necessário voltar ao passo 4.2 e re-limite a pilha para garantir que os registos voar como um ponto preto no slide em questão.
- Para converter o caminho comprimentos de pixels para cm, dê uma imagem separada de dois pontos que estão espaçados um centímetro de distância em uma parte branca de papel em branco.
- Siga o acimapassos (3.1-4.4.2), para determinar as coordenadas x, y do pixel para os dois pontos e usar esta informação para determinar o número de pixels correspondentes a um centímetro. Este fator de conversão é usado na etapa cinco para gerar dados de movimento em cm. Nota: Uma vez feito isso, é importante para manter a câmera fixa para todas as gravações futuras. Cada vez que a câmera é movida ou modificada, é preciso repetir este passo para converter os pixels para cm.
- O comprimento do percurso que é gerado pelo Multitracker plug-in sobrestima movimento porque pequenas flutuações na posição do corpo e intensidade de luz / reflexão vai afectar o tamanho e no centro do ponto negro que é gerado quando limiarizar as imagens. Este ruído deve ser removido a fim de obter uma estimativa precisa do movimento mosca.
5. Análise de Dados Usando o Excel
- Remover o ruído dos dados gravados, importando a série de coordenadas x, y gerado pelo pr MultitrackerOgram em Análise Fly, um programa do Visual Basic Excel criado pelos autores. (O programa está disponível em contato com os autores.)
- Clique no Click Me botão e selecione um valor de limite de corte. Selecione um valor limite de 0,5 cm / s para análise SLA ou selecione um valor entre 0,1-0,3 cm / s para análise do movimento. Clique em OK eo programa irá calcular a velocidade, tempo e distância do movimento. Nota: O programa usa uma análise de janela deslizante para avaliar os dados seqüenciais 0,5-1,0 caixas seg e calcula a velocidade durante essa janela. Qualquer coisa acima do limite definido pelo usuário é tratado como movimento mosca.
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Representative Results
A técnica aqui descrita foi utilizada anteriormente para analisar diferenças de SLA nas mutantes BS Drosophila 1. Os resultados aqui apresentados envolvem as cepas BS facilmente chocado (EAS), golpe sem sentido (BSS) e nocaute técnico (TKO). O locus eas codifica uma cinase de etanolamina envolvido na síntese de fosfatidil etanolamina 15 e o locus TKO codifica um riboprotein mitocondrial 16. A mutação BSS é um alelo do paralítico (para) dos canais de sódio voltagem-17. Os alelos utilizados neste estudo foram EAS 1, BSS 1 e tko 25t.
Uma ilustração da eficácia do método de medição de SLA pode ser visto na Figura 1, que representa o comprimento do percurso de um controlo eas mosca sensível à apreensão, em comparação com umque foi alimentado a metformina. A metformina é uma biguanida usado para tratar diabetes tipo II. A droga inibe mitocondrial respiratória complexa cadeia I, que, através da regulação positiva da AMPK, desencadeia um aumento na glicólise e captação de glicose em células de mamíferos 18. Estudos anteriores mostraram que a metformina upregulates genes glicolíticos, presumivelmente para compensar a inibição do metabolismo aeróbio vias 19. Figura 2 demonstra que a alimentação dos BS mutantes eas e tko metformina durante dois dias (25 mg / g de alimento) reduz o comprimento do percurso de SLA .
Além de reduzir o comprimento do trajecto, os dados gerados por este método pode ser utilizado para analisar as diferenças na velocidade de SLA e duração de SLA. Neste caso, os dados indicam que a duração SLA foi significativamente reduzida (Figura 3), enquanto a velocidade de SLA não foi alterado de forma significativa (Figura 4).
O ensaio acima descrito pode também ser utilizado para medir a locomoção ao longo de um período de tempo definido. Figura 5 mostra um exemplo de um caminho percorrido por um tipo selvagem Canton-Especial (CS) e uma mosca caminho percorrido por um BSS voar ao longo de um período de 15 min. Enquanto o movimento de ambas as moscas foi concentrado nas bordas da área circular, a mosca CS exibiram muito mais locomoção ao longo do período de registo de 15 minutos. O ensaio não é, portanto, útil na busca, tanto a quantidade de movimento e o padrão de movimento das moscas.
A distância média percorrida por moscas bss foi significativamente menor do que a de CS voa como indicado pela Figura 6. Não só as moscas BSS exibir menos movimento, eles tendem a mover-se com uma velocidade mais lenta. As alterações na velocidade de circulação das duas moscas individuais estão apresentados na Figura 7. Usando estes dados, uma velocidade média poderá ser calculada e comparada quanto a F igura 4 para SLA. Com base nas moscas representativos mostrados na Figura 7, é evidente que as moscas CS tinha crises mais frequentes de movimento rápido, enquanto que as moscas BSS mais episódios de inactividade durante o período representado na figura.
Figura 1. Caminhos representativas de SLA em mutantes eas e mutantes eas alimentado metformina. Moscas individuais ficaram chocados mecanicamente para induzir SLA. O caminho de uma mosca individual durante o SLA está representado na figura. A) Caminho de um mutante EAS. B) Caminho de um mutante metformina alimentado EAS. (Bar representa um centímetro).
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Figura 2. Moscas individuais foram chocados mecanicamente para induzir SLA. A distância a mosca movido durante o SLA foi usado como uma medida da intensidade da SLA. Em ambos os mutantes BS examinados, a metformina reduz significativamente a distância percorrida. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney U (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 3. Moscas individuais foram chocados mecanicamente para induzir SLA. O tempo gasto a mosca submetidos SLA foi usado como uma medida da intensidade da SLA. Em ambos os mutantes BS examinados, metformina reduziu significativamente a duração de SLA. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney U (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 4. Moscas individuais foram chocados mecanicamente para induzir SLA. A velocidade média da mosca durante o ataque de SLA foi usado como uma medida da intensidade da SLA. Não houve nenhuma alteração significativa na velocidade média para os dois mutantes BS testados quando alimentados metformina. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney U (n = 15).
Figura 5. Caminhos de moscas individuais na arena. Traços representam os caminhos percorridos moscas individuais na arena durante o período de 15 min de monitoramento. A) Caminho de um CS ativo voar com o movement concentrada em torno da periferia da arena circular. B) Caminho de uma mosca típico BSS. Movimento ainda foi concentrada em torno da periferia, mas não foi muito menos movimento, em comparação com as moscas CS. (Bar representa um centímetro)
Figura 6. Mosca locomoção quando expostos a um ambiente novo. Moscas individuais foram colocados numa arena de diâmetro de 5 cm (5 mm de altura) e movimento foi monitorizada durante 15 min. O comprimento do passo foram calculados para cada mosca e os comprimentos médios foram tomadas para cada genótipo. Os mutantes bss exibida uma redução significativa no comprimento do caminho em relação a moscas CS. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney U (** p <0,01, n = 10).
Figura 7. Velocidade em função do tempo durante a locomoção exploratória para um CS (A) e um BSS (B) voar. Uma mosca indivíduo foi colocado numa arena de diâmetro de 5 cm (5 mm de altura) e movimento foi monitorizada durante 15 min. Velocity foi calculado a cada 0,5 seg a média da velocidade sobre uma janela deslizante 1 seg (movimento do 0,5 s anterior ao posterior 0,5 s de intervalo.) Depois de algumas explosões iniciais de atividade da mosca bss permanece relativamente inativo durante todo o julgamento.
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Discussion
Ao examinar locomotora ou padrões de movimento em Drosophila, que é útil para ser capaz de extrair a informação sobre a distância percorrida, a velocidade do movimento e o padrão de movimento. Para extrair esta informação, equipamentos caros tem sido tradicionalmente empregada que é muitas vezes proibitivo para laboratórios menores ou laboratórios que desejam utilizar tais ensaios com moderação 4,8,9.
O ensaio aqui descrito pode ser utilizado para determinar a distância percorrida (Figuras 2 e 6), a velocidade do movimento (figuras 4 e 7) e o padrão de movimento (Figuras 1 e 5) utilizando um equipamento que custa menos do que duzentos dólares . Utilizando o programa de Visual Basic Excel temos desenvolvido, a série de coordenadas X, Y gerado pelo programa ImageJ pode ser analisada para extrair toda esta informação. Este sistema possuisido utilizado anteriormente para identificar ambos os supressores genéticos e farmacológicos de SLA nos Drosophila mutantes sensíveis BS-apreensão 1.
Enquanto o sistema pode extrair informação valiosa, que têm apenas uma mosca analisadas ao mesmo tempo. Isto pode ser uma desvantagem significativa, em comparação com as opções comerciais altamente paralelas 4. O plug-in Multitracker para ImageJ tem a capacidade de controlar vários objetos simultaneamente, mas nós ainda não experimentou esta opção. Para este ensaio locomotor, uma única mosca é colocado dentro de um recipiente de plástico prato Petri. Dependendo da posição da câmera, pode-se filmar várias placas de Petri para fazer gravações paralelas. A desvantagem é que a resolução irá diminuir à medida que a câmara web está posicionada para tirar em um campo maior. Como isso afeta a integridade da gravação não é conhecida, mas uma câmera de maior efeito seria uma opção se queria seguir gravações paralelas.
As gravações dum aqui são limitadas para 15 minutos, mas é possível para fazer gravações mais longos se emprega a versão de ImageJ 64 bits. A versão de 32 bits tem um limite de memória que restringe o tamanho dos arquivos pode-se analisar. Para gravações mais longas, é essencial usar a versão de 64-bit ImageJ.
Uma das maiores questões relativas a este método é a necessidade de remover o ruído dos dados gerados por processá-lo no software ImageJ. No entanto, isso não é exclusivo a este método como problemas de ruído semelhantes devem ser resolvidos com outras opções de gravação 3,5,6,8. Como discutido nos métodos, uma mosca estacionário pode apresentar pequenas quantidades de movimento, quando processados através ImageJ porque o programa mede o movimento do centro do objecto, que pode variar até mesmo de um objecto em movimento, devido a flutuações na luz e postura voar.
Nosso programa Visual Basic Excel utiliza uma análise de janela deslizante para definir um limite para o movimento. Este threshold podem variar, dependendo do ensaio. Para a análise das crises, a janela deslizante olha para dez pontos de gravação, que vai de 1 seg de tempo real. Se a mosca moveu 0,5 centímetros ou mais, durante este tempo, considera-se a ser activamente apreensão. Se ela for menor, isso é considerado em repouso. Ao olhar para o movimento normal, um limiar mais baixo é necessário para determinar o corte fora e isso tem de ser feito através de tentativa e erro. Um limiar de 0,1 cm / seg foi usado neste estudo. A melhor maneira de conseguir isso é para gravar uma mosca enquanto ele está parado por um breve período de tempo e, em seguida, ajustar o ponto de corte para que ele não indica nenhum movimento durante a gravação.
Em resumo, este método de baixo custo representa um ensaio de viabilidade de extracção de informação significativa sobre os vários parâmetros de locomoção mosca. É uma técnica de rastreio ideal para utilizar para identificar se um comportamento de manipulação, genética ou farmacológica tem um efeito na locomoção ou apreensão susceptibilidade.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores também desejam expressar graças a Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, e Megan Hyde por seu trabalho em sintonia fina neste ensaio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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