Protocol
ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوانية المتعلقة الموصوفة في هذا البروتوكول وقد تمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك (DUIACUC).
1. سرطان خلية ثقافة وحقن
- زراعة خلايا السرطان النقيلي fluorescently المسمى (على سبيل المثال MDAMB231-GFP خلايا سرطان الثدي البشرية، هدية من الدكتور باتريشيا Steeg، NCI، وخلايا فأر ساركوما YFP المسمى، هدية من الدكتور ديفيد كيرش، المركز الطبي لجامعة ديوك، قسم علاج الأورام بالإشعاع) في مستنبت المناسب (على سبيل المثال Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / streptavidin) عند 37 درجة مئوية حتى ما يقرب من 90٪ متموجة.
- يعرض للتريبسين الخلايا، غسلها 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، عد، ثم ضخها في عروق الذيل من 10 أسابيع من العمر الفئران عارية الإناث تخدير الأيزوفلورين عند 5 مليون خلية لكل حيوان، وذلك باستخدام حقنة بإبرة G 27. anesthes مستوى الجراحيةيتم التحقق منها الجيش العراقي بسبب عدم وجود رد فعل حتى أخمص القدمين قرصة.
2. رصد الانبثاث عن طريق MicroCT
- دراسة الفئران مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الصغير CT / الدقيقة Irradiator، للكشف عن وجود نقائل فوق ما يقرب من 2 مليمتر في القطر في القطر. وكلفت-CT الجزئي كما هو موضح سابقا (12).
- الفئران الخاضعة لل3٪ الأيزوفلورين التخدير قبل التصوير. تأكيد التخدير العميق عن طريق قرصة أخمص قدميه.
- بعد بداية التخدير، وبسرعة نقل الفئران إلى مهد التصوير في غرفة التصوير والاتصال عن طريق الأنف مخروط إلى خليط الأيزوفلورين الهواء في 2.5-3٪. ضبط الموقف من الفئران في المهد في الطريقة التي يتم وضع الصدر في شعاع الفوتون من الماسح الضوئي MicroCT، باستخدام عناصر التحكم موقف الخارجية ومحدد ليزر على مهد التصوير. تأكد من إغلاق الباب إلى غرفة التصوير، لحماية المحقق من أشعة غاما.
- السيطرة على الموقف من الحيوان مرة أخرى باستخدامالكاميرا لون الفيديو. إجراء منخفضة الدقة اختبار التصوير CT المدى، واستخدام الصورة الناتجة لضبط مجال الرؤية للأبعاد XYZ من التجويف الصدري.
- صورة الصدر الفئران باستخدام 2 مم آل مرشح في 40 KVP، 2.5 مللي أمبير، وفوكسل 0.008 في 7 FPS ويعود الحيوان إلى قفصه. التصوير من حيوان واحد ينبغي أن لا يزيد عن 15 أو 20 دقيقة. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- تأكيد الانبثاث بظهور أجسام معتمة نسبيا التي لا يمكن تفسيرها من خلال الأوعية الدموية داخل الصدر (الشكل 1A)
جراحة 3. غرفة النافذة
- التخدير، والعلامات الحيوية والذيل قثطرة الوريد
- اختيار الحيوانات مع وجود المرض المنتشر. حقن الحيوان مع د داخل الصفاقبيئة نظام التشغيل من 50 ملغ / كغ بنتوباربيتال. تأكيد التخدير على مستوى الجراحي بواسطة إصبع قرصة قبل المتابعة.
يجب أن تكون مطابقة بروتوكولات التخدير إلى الإعداد التجريبية منها: مذكرة. وقد تم اختيار بنتوباربيتال هنا كما مخدر طويل المفعول، وذلك للحث على التخدير العميق لإجراءات مطولة، في حين تقدم خيار السطحية إعادة الجرعات. ومع ذلك، وفقدان الحيوانات لالجرعة الزائدة هي مشكلة مشتركة مع التخدير بنتوباربيتال. وثمة خيار آخر أن يحافظ على ردود الفعل اللاإرادي إلى درجة أكبر من بنتوباربيتال هو الكيتامين في تركيبة مع المهدئات مثل زيلازين أو medetomidine، ولكن الذي يسمح فقط للملء مع جرعة إعادة دورة واحدة. - يحلق الحيوانات على جانب من الجسم الذي لديه المرض المنتشر، وفي منطقة الرقبة، وذلك باستخدام المقص. تمحو كل ما تبقى من الشعر فضفاضة من الجلد. بعد إزالة الشعر فضفاضة، وتطبيق مرهم البيطرية للعيون، لمنعهم من الجفاف.
ملاحظة: قد يكون الفئران عارية Athymic الشعر المتبقية التي REQUIإزالة الدقة قبل الشروع في العمليات الجراحية. من المهم جدا لإزالة كل الشعر جيدا، لأنها قد تتداخل مع العمليات الجراحية والتصوير. - إصلاح الحيوان في موقف ضعيف على لوحة معدنية التي يتم وضعها على وسادة التدفئة 37 ° C المياه تعميم. يتم إصلاح الأطراف الأمامية والخلفية على لوحة مع الشريط.
ملاحظة: ومن المفيد لمراقبة وتسجيل العلامات الحيوية، مثل معدل ضربات القلب والشرايين الأوكسجين في الدم باستخدام مقياس التأكسج النبض، في جميع أنحاء العمليات الجراحية والتجريبية.
- اختيار الحيوانات مع وجود المرض المنتشر. حقن الحيوان مع د داخل الصفاقبيئة نظام التشغيل من 50 ملغ / كغ بنتوباربيتال. تأكيد التخدير على مستوى الجراحي بواسطة إصبع قرصة قبل المتابعة.
- التنبيب الرغامي
- من أجل وضع قسطرة للتهوية من الحيوان، أولا جعل مستعرضة عنق الرحم شق الجلد، يليه فصل متوسط من بطني عضلات طولية إلى القصبة الهوائية.
- الاستخدام المتكرر العمل الافتتاحية إلى إغلاق مع ملقط حادة لإنشاء ممر للخياطة من خلال الجانب الظهري من القصبة الهوائية.
- إجراء شق صغير في القصبة الهوائية على رانه الجانب البطني، وليس أكثر من نصف دائرية، ما يقرب من بين القصبة الهوائية حلقة الثانية والثالثة. ترك جزء طويل بما فيه الكفاية من القصبة الهوائية تعرض على السطح الظهري، لتمكين تثبيت القسطرة القصبة الهوائية.
- إدراج 2،5-3،0 مم "Y" القصبة الهوائية قنية في القصبة الهوائية، وتشديد مع خياطة 4-0 حيدة. ضمان توصيل قنية لضغط تدوير التنفس الصناعي مع زجاجة متصلة القناة انتهاء مليء 6 سم من الماء، للحفاظ على الضغط الرئوي الإيجابي. وينبغي أن يكون الغاز المتدفق 100٪ الأكسجين، ما لم المطلوب تجريبيا على خلاف ذلك.
- ادخال قسطرة مع G إبرة 25-27، ومليئة المالحة heparinized إلى واحدة من الأوردة ذيل فأر، وإصلاح في مكان مع الشريط.
ملاحظة: تأكد من المباح للقسطرة الوريد الذيل في جميع أنحاء الإجراء من قبل مرارا وتكرارا حقن كمية صغيرة من المياه المالحة heparinized في الوريد الذيل. أيضا، التنبيب أورو-القصبة الهوائية، أي توجيه من القصبة الهوائيةأنبوب عن طريق الفم للتخدير الحيوان والماضي الحنجرة إلى القصبة الهوائية، هو بديل محتمل لإجراء القصبة الهوائية الموضح هنا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب من التدريب والخبرة خاص، لتجنب الأضرار التي لحقت القصبة الهوائية، وأيضا للحيلولة دون القسطرة عرضي من المريء.
- تطبيق نافذة الرئوي
- إزالة الجلد من الجانب من الصدر حيث يقع المرض المنتشر، من خلال خلق شق، ومن ثم فصل الجلد باستخدام تشريح حادة.
ملاحظة: الجلد يمكن رفعه وإزالة لاحقا إلى مفرزة - المضي قدما في طريق تشريح طبقتين من تتراكب الجهاز العضلي (الصدرية، المنشارية، والظهرية العريضة)، ولكن ترك العضلات الوربية سليمة. إنشاء ثقب في تجويف الصدر من حوالي 1.5 سم في القطر، عن طريق إزالة أجزاء من عادة اثنين من أضلاعه المجاورة. من الناحية المثالية، حدد موقع ثقب في المنطقة من ص السادس والسابعالقولون العصبي.
- العظم:
- لتقليل النزيف والضرر على سطح الرئة، وعقد بإحكام الضلع لا بد من تخفيض مع ملقط الجراحية مسننة خلال عدة قطاعات. باستخدام مقص جراحي، وقطع الجانب الإنسي من الضلع الأول، في زاوية ما يقرب من 45 درجة، وترك الجانب أشار من عظم الضلع المتبقي لافتا الخارج.
- وفي وقت لاحق، وقطع الجانب الوحشي من عظم الضلع بطريقة مماثلة، وترك مرة أخرى الجانب أشار العظم الصدري إلى الخارج، لمنع الأضرار التي لحقت سطح الرئة.
- كرر الإجراء الضلع المجاور، ثم قطع العضلات الوربية وإزالة قطعة رفعه. خلال هذا الإجراء، والحفاظ على ضغط الرئة بطريقة التفاعل الميكانيكية بين سطح الرئة والقفص الصدري إلى أدنى حد ممكن. القيام بذلك عن طريق تنظيم ضغط بشكل مناسب إلهام على جهاز التنفس الصناعي.
- الإدراج من النافذة:
- اضافة الى وجود نافذة الرئة العرف، ويتكون من ساترة هذا هوتعلق على مقبس زجاجي (الشكل 1B). نعلق الإطار إلى المقبس من قبل الإلتصاق، أو عن طريق تطبيق كمية صغيرة جدا من الشحوم فراغ. إدراج النافذة بطريقة الانبثاث سطح تقع على مقربة من وسط النافذة. إذا لزم الأمر، وضبط فتحة إدخال لجلب نقيلة مجهرية إلى وسط النافذة من خلال توسيع الثقب قليلا إلى الجانب المعني.
ملاحظة: المرض المنتشر على سطح الجنبي يمكن حصرها في النقاط البيضاء التعرف عليها بوضوح أو مناطق داخل أجزاء خلاف الوردي لسمك السلمون الملونة صحية من سطح الرئة التي تظهر في الغالب على طول الشقوق. في حين يمكن أن يحدث micrometastases على مناطق أخرى من الخارج الجنبي، وخطوط الخلايا التحقيق عرض دائما تقريبا تطفو على السطح micrometastases في منطقة مثقبة، مرة واحدة المرض المنتشر يمكن أن يتم الكشف عن شعاعيا. - بعد إدخال المقبس في ثقب، وخلق اتصال مباشر مع الجنبة الحشوية لللأونج، خياطة حواف إطار نافذة لعضلة الوربية المحيطة، وذلك باستخدام 4.0 خياطة حيدة (الشكل 1C). استخدام زيادة طفيفة الضغط إلهام على جهاز التنفس الصناعي للمساعدة في الهواء المتبقية للهروب وخلق الختم.
ملاحظة: معدل التنفس من الفئران يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا، تبعا لحالة من التخدير، وحالة من الإثارة أو القلق، وتركيز الأكسجين من الهواء من وحي (قوة المراقبة الدولية 2)، وما إلى ذلك من المفضل لضبط معدل التنفس ما بين 70 و 90 نبضة في الدقيقة. ينبغي تعديل الضغط إلهام بحذر وعدم وضعها لأكثر من تقريبا. 8 سم H 2 O (0.6 ملم زئبقي)، لتجنب الأضرار التي لحقت سطح الرئة.
- اضافة الى وجود نافذة الرئة العرف، ويتكون من ساترة هذا هوتعلق على مقبس زجاجي (الشكل 1B). نعلق الإطار إلى المقبس من قبل الإلتصاق، أو عن طريق تطبيق كمية صغيرة جدا من الشحوم فراغ. إدراج النافذة بطريقة الانبثاث سطح تقع على مقربة من وسط النافذة. إذا لزم الأمر، وضبط فتحة إدخال لجلب نقيلة مجهرية إلى وسط النافذة من خلال توسيع الثقب قليلا إلى الجانب المعني.
- وضع الحيوان في رادع مصمم خصيصا التي تم تصميمها للقضاء-Z اتجاهي الحركة (الشكل 1D) على لوحة الصلب الذي يتوضع على الحرارية (الكهربائية) التدفئة بطانية، تحت المجهر مضان. السيطرة على جسم الحيواندرجة الحرارة باستخدام الثرمستور المستقيم. ضبط مسامير من رادع الحيوان، والضغط إلهام على جهاز التنفس الصناعي لتحقيق التحكم الأمثل من الحركة الجانبية.
ملاحظة: التنفس الطبيعي في الثدييات يشمل جميع الاتجاهات الثلاثة للحركة الرئة والإرشاد الصدر: الثنائي، ظهراني بطني، والقحف-الذيلية. من أجل الحفاظ على حركة التنفس الطبيعية قدر الإمكان، من المهم للحد-Z الاتجاه ضغط بالقدر اللازم. لأن Z-الأبعاد ضبط النفس لديه القدرة على تقديم الاعمال الفنية التي قد تؤثر على تدفق الدم وغيرها من المعالم، فمن المستحسن أن تبقي شروط ثابتة خلال سلسلة من القياسات المتكررة في نفس الحيوان.
- إزالة الجلد من الجانب من الصدر حيث يقع المرض المنتشر، من خلال خلق شق، ومن ثم فصل الجلد باستخدام تشريح حادة.
4. التصوير والقياس من الأوعية الدقيقة تدفق الدم
- جمع خلايا الدم الحمراء عبر ثقب في القلب وتسمية لهم الجاذبة (1،1 = -dioctadecyl-3،3،3 بيركلورات = 3 = -tetramethyl-indocarbocyanine)، كما هو موضح سابقا <سوب> 10.
- ضخ 300 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء وصفت في الوريد ذيل فأر قبل الجراحة تتم غرفة النافذة، لتجنب الآثار الأولى تمريرة التصاق لزجاج النافذة. القضاء على أي فقاعات الهواء في حقنة أو القسطرة، كما إدخال الهواء إلى الوريد سوف تمنع أي حقن أخرى.
- صورة تدفق الدم مع كاميرا CCD المجهر في -40 ° C رقاقة درجة حرارة التبريد، وحوالي 100X قرار الكلي (أي مع الهدف المجهر 10X، 10X وقبل الكاميرا بصري). استخدام معيار مجموعات تصفية رودامين / TRITC (450-490 نانومتر الإثارة، والانبعاثات> 515 نانومتر). تسجيل معدل الإطار وبكسل القرار الفعلي للتسلسل الصورة الناتجة. سجل 200 على الأقل (من الناحية المثالية حوالي 300) الصور في كومة، لضمان التحليل الناجح لسرعة التدفق.
- تجديد فقدان السوائل في الحيوان عن طريق ضخ ما يقرب من 1 مل من المياه المالحة الملكية الفكرية في كل ساعة.
ملاحظة: إعدادات التجريبية التي تنطوي على التدخل، على سبيل المثالدواء بتعديل سرعة تدفق الدم في الانبثاث السرطان الرئوي، يتطلب قياسات متكررة من سرعة تدفق الدم في السرطان النقيلي الرئوي. لهذه التجارب الموسعة، من المهم لتجديد الحيوان مع السائل كافية. - الموت ببطء الحيوانات عن طريق التسريب من 3 مل من 3N بوكل في الوريد الذيل
- تقييم مداخن صورة باستخدام، وهي متاحة علنا خوارزمية الكمبيوتر نشرت استنادا ماتلاب من شأنها أن تخلق تدفق الرمادي السرعة واللون المشفرة خرائط لجميع تدفق الدم يتتبع 10،11. تقييم في وقت لاحق الصور الرمادية الناتجة باستخدام برنامج تحليل الصور تجاري أو متاحة للجمهور، مثل صورة J، بعد العتبة من القيم التي تشير إلى أي حركة خلايا الدم، أي لا الأوعية الدموية نشطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن المعروف أن الأوعية الدموية في الأورام الصلبة لتختلف كثيرا عن إمدادات الدم الطبيعي، والتي تبين درجة أكبر من تعرج، والمسافات INTERVASCULAR أعلى 13. وفقا لذلك، والمسارات تدفق الدم في الرئة التجريبية سرطان الثدي وساركوما الانبثاث لها الأشكال غير النظامية والثغرات INTERVASCULAR كبيرة (الشكل 2A، وانخفاض فريقين) بالمقارنة مع دوران الأوعية الدقيقة الرئوي العادي (الشكل 2A، لوحة العليا). في دراسة سابقة، وقد تجلى قدرة طريقة نافذة الرئوي لأداء القياسات الآلي للتغيرات في سرعة تدفق الدم في الرئتين العادية 10. من أجل التحقيق في ما إذا كان أسلوب نافذة الرئوي ويمكن أيضا قياس زيادة في سرعة تدفق الدم في الانبثاث الرئة، والدواء المركب من الايفيدرين المخدرات الودي وendothelin مانع ambrisentan أنه قد تم مؤخرا وجدت لزيادة الدورة الدموية في الاوعية الدموية الدقيقة الرئتين صحية،تم تطبيق هنا (بيانات قيد الاستعراض في مكان آخر). في هذه الدراسة، يظهر قدرة طريقة للكشف عن زيادة في سرعة تدفق الدم في الانبثاث الرئوية من ساركوما الماوس، والناجمة عن الجرعات مع مزيج من الايفيدرين (20 ملغ / كلغ) وambrisentan endothelin مستقبلات (0.5 ملغ / كغم، سواء المخدرات داخل الصفاق، الشكل 2B). كل نقطة تمثل البيانات المتوسطات الفردية المجمعة من ثلاثة قياسات مع فترات خمس دقائق، وبلغ متوسط على البيانات التي حصل عليها في خمسة الحيوانات. الحقنة الأولى معنويا (P <0.01) زادت سرعة تدفق الدم في منطقة الورم من 0.61 ± 0.12 ملم / ثانية إلى 0.74 ± 0.19، في حين حافظت الحقنة الثانية سرعة تدفق مرتفعة في 0.74 ± 0.19 ملم / ثانية (). لم الحقنة الثانية لا يثير أي زيادة أخرى في سرعة تدفق الدم. N = 5، جميع الإحصاءات: تدابير المتكررة ANOVA.
الشكل 1: الإجراءات لإعداد الفئران الرئة الانبثاث الحاملة للتصوير المجهري المباشر (A) صورة MicroCT من الانبثاث تحمل الفئران الرئة (السهم) (B) الرئوي إطار نافذة (C) الجرذ مع انثقاب جدار الصدر ونافذة الرئوي. المرفق. (D) جهاز الزجرية للحد من حركة الصدر-Z الاتجاه. (E) الجرذ مع غرفة النافذة وجهاز تقييد تحت المجهر مضان. ملاحظة: لوحة C و E تظهر شعر تحمل الفئران سبراغ داولي، وليس athymic الفئران عارية.
الشكل 2: الكمي لزيادة في تدفق الدم الانبثاث الرئوية. (A) الاتجاه تدفق الدم وسرعة في وضعها الطبيعيالرئة، وسرطان ورم خبيث من MDAMB-231 والفأر ساركوما. العمود على الجانب الأيسر يحتوي على طلقات مبكرة من سلسلة صورة الميكروسكوب مضان. ويمكن تحديد Alveolae كجزء من نمط مضان الخلفية في الرئتين العادية (لوحة العليا). يمكن أن يكون موجودا الانبثاث من قبل مضان التي تسببها البروتينات الاستشعاع الذاتية من الخلايا السرطانية حقن (خط متقطع). أعمدة إلى اليمين: ترميز اللون الخرائط اتجاه تدفق الدم (العلامات عجلة مؤشر اللون الاتجاه نحو من تحتها خلايا) وسرعة تدفق، وتقاس في ملم / ثانية (ب) التغيرات في تدفق الدم الأوعية الدقيقة بعد الحقن المتكررة من الايفيدرين جنبا إلى جنب و ambrisentan (20 و 0.1 ملغ / كغ في الحقن). ولوحظ وجود زيادة كبيرة في سرعة تدفق الشاملة (التدابير المتكررة ANOVA، ف <0.01) بعد الحقنة الأولى، ولكن ليس بعد الثانية (N = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد النموذج الذي هو ممكن للتغيرات الصورة في الأوعية الدقيقة تدفق الدم والعمليات الحيوية الأخرى في الانبثاث الرئة من الفئران، وذلك باستخدام intravital المجهري والتحليل الحسابي تدفق الدم. بينما توجد طرق أخرى لأداء المجهري على الرئتين تتعرض في ribcages مفتوحة من القوارض، وهذا النموذج هو أيضا أول من صورة الانبثاث الرئوية من خلال ثقب جدار الصدر في مكان مغلق الصدر. باستخدام هذه الطريقة، يتم عرض جدوى لقياس التغيرات التي يسببها دواء في الأوعية الدقيقة تدفق الدم الانبثاث الرئوية.
توجد طريقتين أساسيتين لصورة الرئتين من القوارض الحية التي و perfused بواسطة تدفق الدم العفوي، مع اتصال مباشر إلى سطح الرئة: نماذج الصدر مفتوحة القضاء على مشكلة حركة مستمرة من الرئة بسبب النشاط التنفسي والقلب من خلال تطبيق نافذة شفط على سطح الرئة، بينما يسمح للبقية مجمع القلب لإكسبووالعقد في غضون مفتوح 7،14 تجويف الصدر. بينما يوفر هذا أسلوب الوصول تجريبي ممتاز، والظروف الصدر مفتوحة ونافذة شفط إدخال القطع الأثرية بالمقارنة مع ظروف الرئة سليمة 8. بدلا من ذلك، إجراءات مغلقة الصدر أن ترك القفص الصدري إلى حد كبير سليمة تحمل الوعد الحفاظ على ظروف الأصلي في تجويف الصدر سليمة، مثل التأثير المتبادل للحركة القلب والرئة على تدفق الدم كل منهما الديناميكي. تشمل هذه النماذج عادة الإطار مع الإطار الذي يتم خياطة لجدار الصدر 15، أو غشاء شفاف أن يتم إحضارها في اتصال مباشر مع سطح الرئة لمنع جفاف الأنسجة 9. صعوبة التفاوض على حركة القلب والرئة لاستيعاب وتمكين التصوير المجهري هو التحدي التقني الرئيسي للإجراءات مغلقة الصدر، وربما مسؤولة عن انتشار الإجمالي منخفضة من هذه التقنية. في حالتنا، فإن الجمع بينوقد ثبت ل-عقد إطار الإطار الصلب وجهاز الزجرية-Z الاتجاه فعال للقضاء بما فيه الكفاية الحركة الجانبية من الرئة للسماح قياسات تدفق الدم الآلي من الدورة الدموية الرئوية في نافذة مغلقة الصدر 10.
وهناك طريقة شائعة لقياس سرعة تدفق الدم من حيوي داخلي مداخن صورة المجهري هو استخدام مطابقة المكاني للأنماط تدفق الدم في صور متتالية من شريحة الأوعية الدموية تعطى 14. من أجل تقليل الوقت والجهد المرتبطة تحليل الأوعية الدموية واحدة، وقد تم إدخال خوارزمية التصوير تدفق الدم الذي ينتج تدفق الدم خرائط سرعة مجال بصري كامل 11. إلى جانب ميزة الوقت، وهذا الأسلوب يسمح أيضا التحليل المكاني في وقت واحد تدفق الدم في مجال بصري كله، بغض النظر عن التشكل الأوعية الدموية أو نقاط المتفرعة. هذا مهم بشكل خاص عند دراسة المكروية الورم، حيث contri الأوعية الدموية متعددةبوت بوضع توريد منطقة الورم نظرا 13،16،17. والواقع أن تعرج معروف من ورم الأوعية الدموية ووجود ثغرات INTERVASCULAR كبيرة يمكن رؤيتها بوضوح في كل أنواع السرطان النقيلي التي تم التحقيق فيها، (الشكل 2A). كما تم اختبار طريقة نافذة الرئوي لقدرته على التبليغ عن أي تغييرات في سرعة تدفق الدم في الآفة النقيلي، من خلال قياس تأثير العلاج الدوائي أنه قد تم مؤخرا وجدت لزيادة سرعة تدفق الدم في الدورة الدموية الرئوية: والايفيدرين المخدرات ارتفاع ضغط الدم يزيد النتاج القلبي، في حين أن ambrisentan endothelin مستقبلات مانع يقلل من تصلب لهجة ما قبل الشعرية، مما يؤدي، عندما تعطى الأدوية في الجمع، في زيادة سرعة تدفق الدم في الشعيرات الدموية الرئوية. في حين أن هذه البيانات هي حاليا قيد الاستعراض في أماكن أخرى، وقدرة مزيج من المخدرات ارتفاع ضغط الدم وخصم endothelin مستقبلات لزيادة العضلات الطرفيةوقد نشرت نضح بشكل مستقل (18). في حين ظل ظروف طبيعية، والتي تعتمد على زيادة جرعة من سرعة تدفق الدم ويمكن ملاحظة بعد كل من الحقن، وحقيقة أن الحقنة الثانية لا يؤدي إلى زيادة أخرى من سرعة تدفق في الانبثاث ساركوما قد تنجم عن حقيقة أن الأوعية الورم القصوى توسع الأوعية وقد تم بالفعل التوصل إليه بعد الحقن المشترك الأول من الايفيدرين وambrisentan.
تنطبق القيود التالية على أسلوب المقدمة هنا: هذا البروتوكول ينطبق على الفئران (ونظريا، الثدييات مماثلة الحجم) من حوالي 180-300 غرام أو أكثر. والثدييات الصغيرة مثل الفئران تتطلب تعديل خاص لاستيعاب علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء أكثر هشاشة من القفص الصدري. القرار المكاني الأقصى الذي يمكن أن يتحقق مع تقنية عرض ونظريا محدود فقط من الفتحة العددية للهدف وسمك الشريحة الغطاء الذي يستخدم (~ 0.08-،1 ميكرون في العلامات التجارية قياسي)، لأهداف 100X، مع استخدام الغمر النفط. في الممارسة العملية ومع ذلك، فإن حركة المتبقية من الرئة قد تحد من استخدام أهداف عالية الدقة وراء 20X. إذا تم القضاء على كل حركة الحكم الذاتي في الرئة، فإن القرار الزمني للتقنية محدودة فقط من معدل الإطار من الكاميرا، وقوة إشارة التسمية الفلورسنت، والذي يحدد وقت التعرض، إلى ما يقرب من 100 لقطة في الثانية. تنطبق القيود الإضافية التالية لأسلوب عرض: من جهة، ويسمح الإعداد المجهري والحسابي الحالي فقط تحليل سطح ورم خبيث معين. يجوز للاستخدام اختراق عمق المجهري، مثل استراتيجيات متقدمة التصوير متحد البؤر المجهري، في المستقبل تمكين قياس سرعة تدفق الدم في 3 أبعاد. أيضا، تقنية عرض لا يمكن، في شكله الحالي، أن تستخدم لتصور الآفات مزيد من داخل لحمة الرئة. الثالث، والإدراج من GLASS نافذة على اتصال مباشر مع الأوعية الدموية نشطة لديه بعض القدرة على التشويش على تدفق الاوعية الدموية الدقيقة في حد ذاته، عبر ضغط المكاني الأوعية الدموية، أو عن طريق التأثير على درجة حرارة الموضعي. رابعا، استخدام جهاز التنفس الخارجي والضغط الإيجابي في الرئة لديها أيضا القدرة على تغيير تدفق الدم الأوعية الدقيقة الرئوي. وعلاوة على ذلك، ومناطق محدودة فقط من القفص الصدري يمكن الوصول إليها عمليا ل، العمليات الجراحية غير معقدة نسبيا وصفها. أن مناطق أخرى من سطح الرئة، مثل الوصول سطي بطني أو ظهري تتطلب التقنيات الجراحية أكثر تفصيلا، جنبا إلى جنب مع الاضطرابات العميقة للالميكانيكا الحيوية من القفص الصدري. ونظرا لعدم وجود بدائل لالمجهري التصوير لدراسة تدفق الدم الأوعية الدقيقة، يمكن أن يتوقع في المستقبل القريب للتغلب على هذه العقبات ودراسة الأورام الخبيثة في القرار الزماني-المكاني عالية في جميع أنحاء الرئة القوارض التطورات الرئيسية.
وخلاصة القول، وهو الأسلوب هو بريهented لقياس أنماط، والتغيرات في، الاوعية الدموية الدقيقة سرعة تدفق الدم في الانبثاث سطح الرئة الفئران. الجمع بين الحادة المغلقة الصدر نموذج الجراحي مع أسلوب مؤتمت لقياس سرعة تدفق الدم في الحقل المجهري الضوئي بأكمله، هذه التقنية تتيح الحفاظ النسبي على البيئة الفسيولوجية في الرئة، قادرة على اكتشاف التغيرات في مجمل سرعة تدفق الدم الأوعية الدقيقة والتوجيه ، وسهلة نسبيا للاستخدام. يمكن أن يتوقع أن هذه التقنية ستكون ذات فائدة كبيرة لجميع الفئات التي تدرس دوران الأوعية الدقيقة النقائل الرئوية والعمليات الحيوية الأخرى في هذا الإعداد المرض في نماذج القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
