Protocol
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierbezogenen Verfahren sind zuvor von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (DUIACUC) genehmigt worden.
1. Cancer Cell, Kultur und Einspritzung
- Pflegen fluoreszenzmarkierten metastasiertem Krebszellen (zB menschliche MDAMB231-GFP-Brustkrebszellen, Geschenk von Dr. Patricia Steeg, NCI und YFP-markierten Maus-Sarkom-Zellen, Geschenk von Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Abteilung für Radioonkologie) in geeigneten Kulturmedium (zB Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptavidin) bei 37 ° C, bis ca. 90% konfluent.
- Trypsinieren Zellen, waschen Sie sie 2-mal mit PBS, zählen, und dann spritzen sie in die Schwanzvenen von Isofluran betäubt 10 Wochen alte weibliche Nacktratten bei 5.000.000 Zellen pro Tier, mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel. Chirurgische Ebene anesthesIA wird durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenklemm verifiziert.
2. Überwachung von Metastasen Mit MicroCT
- Untersuchen Ratten einmal wöchentlich mit einem Mikro-CT / Mikro Irradiator, um das Vorhandensein von Metastasen über etwa 2 mm im Durchmesser im Durchmesser zu erfassen. Die Mikro-CT wird in Betrieb genommen, wie zuvor beschrieben 12.
- Betreff Ratten zu 3% Isofluran-Narkose vor der Bildgebung. Bestätigen tiefer Narkose durch toe Prise.
- Nach Beginn der Anästhesie, schnell Ratten übertragen, um die Abbildungsaufnahmevorrichtung in der Abbildungskammer und schließen über ein Nasenkegel auf eine Isofluran-Luft-Gemisch bei 2,5 bis 3%. Stellen Sie die Position der Ratte in der Wiege in einer Weise, die ihre Brustkorb wird in der Photonenstrahl der MicroCT Scanner positioniert, mit den externen Positionskontrollen und Lasertrennzeichen auf dem Imaging-Docking-Station. Stellen Sie sicher, die Tür zum Imaging-Kammer geschlossen ist, um die Ermittler von den Gammastrahlen abzuschirmen.
- Kontrollieren Sie die Position des Tieres wieder mitDie Farbvideokamera. Führen Sie eine niedrig auflösende CT-Bildgebung Testlauf, und verwenden Sie das resultierende Bild, um das Sichtfeld auf die xyz Abmessungen der Brusthöhle ein.
- Bild der Ratte Thorax mit einer 2 mm Al-Filter bei 40 kVp, 2,5 mA und 0,008 Voxel bei 7 FPS und senden Sie das Tier in seinen Käfig. Imaging von einem Tier sollte nicht mehr als 15 oder 20 Minuten dauern. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten.
- Bestätigen Metastasen durch das Auftreten von relativ strahlenundurchlässige Objekte, die nicht durch intrathorakale Blutgefäße erklärt werden kann (1A)
3. Fenster Kammerchirurgie
- Anästhesie, Vitalzeichen und Schwanzvenenkatheter
- Wählen Tiere mit Vorhandensein von Metastasen. Injizieren Tieres mit einer intraperitonealen dose von 50 mg / kg Pentobarbital. Bestätigen Operationsebene Anästhesie durch toe Prise bevor Sie fortfahren.
Hinweis: Anästhesie-Protokolle sollten auf den jeweiligen Versuchsaufbau angepasst werden. Pentobarbital wurde hier als ein lang wirkendes Narkosemittel gewählt, um die tiefe Narkose für langwierige Verfahren zu induzieren, und bietet die Möglichkeit, einfache Wieder Dosierung. , Ist der Verlust der Tiere eine Überdosierung ist jedoch ein allgemeines Problem mit Pentobarbital Narkose. Eine weitere Option, die autonomen Reflexe in einem größeren Ausmaß als Pentobarbital bewahrt wird Ketamin in Kombination mit Sedativa wie Xylazin oder Medetomidin, die jedoch erlaubt nur bei einem einzigen Wiederdosierungszyklus. - Rasur Tiere auf der Seite des Körpers, die den metastatischen Krankheit hat, und im Halsbereich, mit einer Schermaschine. Wischen Sie alle verbleibenden losen Haare aus der Haut. Nach lose Haare entfernt wird, gelten Tier Salbe für die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen.
HINWEIS: athymischen Nacktratten können Rest Haar, das requi habenres Entfernung vor mit chirurgischen Verfahren fortfahren. Es ist sehr wichtig, um alle Haare gründlich zu entfernen, wie es mit chirurgischen Verfahren und Bildgebung stören. - Befestigen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Metallplatte, die auf einem 37 ° C Wasserbad zirkuliert Heizkissen platziert wird. Die vorderen und hinteren Enden an der Platte mit Klebeband befestigt.
HINWEIS: Es ist sinnvoll zu steuern und aufzeichnen Vitalfunktionen, wie Herzfrequenz und arterieller Sauerstoffsättigung des Blutes mit Hilfe eines Pulsoximeter, im gesamten chirurgischen und experimentellen Verfahren.
- Wählen Tiere mit Vorhandensein von Metastasen. Injizieren Tieres mit einer intraperitonealen dose von 50 mg / kg Pentobarbital. Bestätigen Operationsebene Anästhesie durch toe Prise bevor Sie fortfahren.
- Intubation
- Um einen Katheter zur Belüftung des behandelten Tieres, zuerst eine transversale zervikalen Hautinzision, gefolgt von der mittleren Trennung der Längsmuskulatur ventral der Trachea.
- Verwenden Sie ein wiederholtes Öffnen-to-Schließvorgang mit einem scharfen Zange, einen Durchgang für das Nahtmaterial durch die dorsale Seite der Luftröhre zu schaffen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre auf T-er ventralen Seite, nicht mehr als halbkreisförmige, etwa zwischen dem zweiten und dritten Trachealring. Lassen Sie eine ausreichend lange Teil der Luftröhre auf der dorsalen Oberfläche freigelegt, um die Fixierung des Luftröhrenkatheter zu ermöglichen.
- Legen Sie eine 2,5 bis 3,0 mm "Y" Trachealkanüle in die Luftröhre, und ziehen Sie sie mit einem 4-0 Monofilamentnaht. Sicherstellen, dass die Kanüle an eine druckgeregelte Ventilator mit einer Flasche zum Ablaufkanal, der mit 6 cm Wasser gefüllt ist verbunden, um positive Lungendruck aufrechtzuerhalten. Einströmende Gas sollte 100% Sauerstoff, es sei denn experimentell anders gewünscht.
- Legen eines Katheters mit einem 25-27 G Nadel und mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt in eine der Schwanzvenen von Ratten, und befestigen mit Klebeband.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, Durchgängigkeit der Schwanzvenenkatheter während des gesamten Verfahrens durch mehrmaliges Einspritzen einer kleinen Menge heparinisierter Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Auch oro-Intubation, dh die Führung eines LuftröhrenRohr über der Mündung des betäubten Tieres und an der Kehlkopf in die Luftröhre, ist eine mögliche Alternative zur Tracheotomie Verfahren, die hier beschrieben wird. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine spezielle Ausbildung und Erfahrung, um eine Beschädigung der Luftröhre zu verhindern, und auch um die versehentliche Kanülierung der Speiseröhre zu verhindern.
- Die Anwendung der Lungenfenster
- Entfernen Sie die Haut von der Seite der Brust, wo der metastasierten Erkrankung befindet, indem Sie einen Schnitt, und dann Abtrennen der Haut mit stumpfer Präparation.
Hinweis: Die Haut kann ausgeschnitten und entfernt im Anschluss an Ablösung werden - Gehen Sie durch Sezieren der zwei Schichten überlagern Muskulatur (pectoralis, serratus und Latissimus), jedoch den Zwischenrippenmuskeln intakt. Erstellen einer Perforation in den Brustraum von ungefähr 1,5 cm im Durchmesser, durch Entfernen von Abschnitten der in der Regel zwei benachbarten Rippen. Idealerweise suchen Sie die Perforation in der Region des sechsten und siebten ribs.
- Osteotomie:
- Um Blutungen und Schäden an der Lungenoberfläche zu minimieren, fest halten die Rippe während des Schneidens mit einer Zahn chirurgische Zange geschnitten werden. Verwendung von chirurgischen Scheren, schneiden die mediale Seite des ersten Rippe unter einem Winkel von etwa 45 °, so dass die spitze Seite der verbleibenden Rippenknochen draußen zeigt.
- Anschließend schneiden die lateralen Seite der Rippenknochen in einer ähnlichen Weise wieder Verlassen der spitzen Seite der Rippenknochen nach außen zeigen, um Schäden an der Lungenoberfläche zu verhindern.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die benachbarten Rippe, dann schneiden Sie die Zwischenrippenmuskeln und entfernen Sie das Stück herausgeschnitten. Während dieses Vorgangs halten Lungendruck in einer Weise, daß die mechanische Wechselwirkung zwischen der Lungenoberfläche und dem Brustkorb, minimiert. Tun Sie dies durch entsprechende Regelung Inspiration Druck auf den Ventilator.
- Einsetzen des Fensters:
- Legen Sie eine maßgeschneiderte Lungenfenster, bestehend aus einem Deckglas, das istauf einer Plexiglas Buchse (1B) befestigt ist. Befestigen des Fensters an der Buchse durch Kleben, oder durch Aufbringen einer sehr kleinen Menge an Vakuumfett. Legen Sie die Fenster so, dass Oberflächenmetastasen sind in der Nähe der Mitte des Fensters. Passen Sie bei Bedarf die eingelegte Loch, um die Mikrometastasen in die Mitte des Fensters durch eine Vergrößerung der Bohrung leicht auf der jeweiligen Seite zu bringen.
HINWEIS: Metastasen auf der Pleuraoberfläche als deutlich erkennbare weiße Punkte oder Bereiche innerhalb der ansonsten rosa-lachsfarben gesunden Teile der Lungenoberfläche, die vorwiegend entlang der Risse erscheinen identifiziert werden. Während Mikro sich an anderen Bereichen der pleuralen außen auftreten, die untersuchten Zelllinien fast immer angezeigt Oberflächenmikrometastasen im perforierten Bereich, einmal Metastasen röntgenologisch festgestellt werden kann. - Nach dem Einlegen der Buchse in die Perforation und das Erstellen direktem Kontakt mit der Pleura des lung, Naht die Kanten des Fensterrahmens an das umgebende Interkostalmuskel, unter Verwendung von 4,0 Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen leichten Anstieg der Inspiration Druck auf das Beatmungsgerät an Restluft zu helfen, zu entkommen und um eine Dichtung zu schaffen.
Anmerkung: Die Atmungsrate von Ratten kann stark variieren, abhängig von dem Zustand der Anästhesie, Status der Erregung oder Angst, die Sauerstoffkonzentration des eingeatmeten Luft (FiO 2), usw. Es ist empfehlenswert, die Atmungsrate zwischen 70 und 90 bpm einzustellen. Die Inspiration Druck sollte mit Vorsicht eingestellt werden und nicht mehr als ca. eingestellt werden. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), um Schäden an der Lungenoberfläche zu vermeiden.
- Legen Sie eine maßgeschneiderte Lungenfenster, bestehend aus einem Deckglas, das istauf einer Plexiglas Buchse (1B) befestigt ist. Befestigen des Fensters an der Buchse durch Kleben, oder durch Aufbringen einer sehr kleinen Menge an Vakuumfett. Legen Sie die Fenster so, dass Oberflächenmetastasen sind in der Nähe der Mitte des Fensters. Passen Sie bei Bedarf die eingelegte Loch, um die Mikrometastasen in die Mitte des Fensters durch eine Vergrößerung der Bohrung leicht auf der jeweiligen Seite zu bringen.
- Die Position des Tieres in einer speziell entworfenen Rückhalter dafür ausgelegt ist, Z-Richtungsbewegung (1D) auf einer Stahlplatte, die auf einem thermo (elektrische) Heizdecke positioniert zu beseitigen, unter einem Fluoreszenzmikroskop. Steuern Sie den Körper des TieresTemperatur unter Verwendung eines rektalen Thermistor. Passen die Schrauben des Tieres Rückhalter und der Inspirationsdruck an dem Beatmungsgerät eine optimale Steuerung der Querbewegung zu erzielen.
Hinweis: Natürliche Atmung in Säugetieren umfasst alle drei Richtungen der Lungenbewegung und Brust-Erweiterung: bilaterale, dorsoventralen und kraniokaudale. Um den natürlichen Atembewegung so weit wie möglich zu erhalten, ist es wichtig, in Z-Richtung Kompression auf das notwendige Maß zu minimieren. Weil die Z-Dimensionszwang hat das Potential, um Artefakte, die den Blutfluss und andere Parameter beeinträchtigt, ist es ratsam, die Bedingungen während der Serie von wiederholten Messungen im gleichen Tier konstant zu halten.
- Entfernen Sie die Haut von der Seite der Brust, wo der metastasierten Erkrankung befindet, indem Sie einen Schnitt, und dann Abtrennen der Haut mit stumpfer Präparation.
4. Bildgebung und Messung von Mikrozirkulationsblutfluss
- Sammeln roter Blutkörperchen durch Herzpunktion und beschriften mit Dil (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = Tetramethyl-Indocarbocyanin Perchlorat), wie zuvor beschrieben <sup> 10.
- Injizieren 300 ul markierte rote Blutzellen in die Schwanzvene der Ratte vor der Fensterkammer Operation durchgeführt wird, um erste Durchgang Adhäsionseffekte das Glasfenster zu vermeiden. Beseitigen Sie alle Luftblasen in der Spritze oder eines Katheters, wie Einführung von Luft in die Vene werden weitere Injektionen zu hemmen.
- Bildblutung mit einem Mikroskop-CCD-Kamera bei -40ºC Chip Kühltemperatur und ungefähr 100facher Gesamtauflösung (dh mit einem 10x Mikroskopobjektiv und 10X vorgeKameraAugen). Verwenden Sie Standard-Rhodamin / TRITC Filtersätze (Anregung 450 bis 490 nm, Emission> 515 nm). Notieren Sie sich die tatsächliche Bildrate und Pixelauflösung der resultierenden Bildsequenzen. Nehmen Sie mindestens 200 (im Idealfall rund 300) Bilder pro Stapel, erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.
- Aufzufüllen Fluidverlust in dem Tier durch Injektion von etwa 1 ml Salzlösung ip jeden hr.
HINWEIS: Experimentelle Einstellungen, eine Intervention beinhalten, wie zBein Medikament, das die Blutströmungsgeschwindigkeit in einem Lungen Krebsmetastase ändert, erfordert die wiederholte Messungen der Blutströmungsgeschwindigkeit in der Lungenmetastasenkrebs. Für diesen erweiterten Experimenten, ist es wichtig, um das Tier mit ausreichend Flüssigkeit aufzufüllen. - Euthanize die Tiere durch Infusion von 3 ml 3N KCl in die Schwanzvene
- Werten Sie die Bildstapeln mit Hilfe eines veröffentlichten öffentlich zugängliche Matlab-basierten Computer-Algorithmus, schaffen Strömungsgeschwindigkeit Graustufen- und Farb codierte Karten für alle Blutfluss Spuren 10,11. Anschließend werten die resultierenden Graustufenbilder unter Verwendung gewerblicher oder öffentlich zugängliche Bildanalyse-Software, wie zum Beispiel Bild J nach Schwellen off-Werte, die keine Bewegung der Blutzellen anzugeben, dh keine aktiven Gefäßsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Gefäßsystem in soliden Tumoren ist bekannt, dass von den normalen Blutversorgung signifikant und zeigt höhere Grade der Tortuosität und höhere intervaskulären Distanzen 13. Dementsprechend Blutfließspuren in der experimentellen Lungen Brustkrebs und Metastasen Sarkom unregelmäßige Formen und große intervaskulären Lücken (2A, unteren zwei Platten) im Vergleich zu der normalen pulmonalen Mikrozirkulation (2A, oberes Feld). In einer vorherigen Studie wurde die Fähigkeit des Lungenfenstermethode nachgewiesen automatisierte Messungen von Änderungen in der Geschwindigkeit des Blutflusses in normaler Lunge 10 auszuführen. Um zu untersuchen, ob die Lungenfenstermethode kann auch eine Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit in Lungenmetastasen zu messen, die Arzneimittelkombination des Sympathomimetikum Ephedrin und Endothelin-Blocker Ambrisentan vor kurzem festgestellt worden ist, um die mikrovaskuläre Durchblutung bei gesunden Lunge erhöhen,Hier wurde (Daten im Berichts anderswo) angewendet. In dieser Untersuchung wird die Fähigkeit des Verfahrens gezeigt, daß eine Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Maus-Sarkom, durch Dosierung mit einer Kombination aus Ephedrin verursacht (20 mg / kg) und der Endothelinrezeptorantagonist Ambrisentan (0,5 mg / erfassen kg, beide Medikamente intraperitoneal, 2B). Jeder Datenpunkt stellt die zusammengefassten einzelnen Durchschnittswerte aus drei Messungen mit jeweils fünf Minuten, gemittelt über die in fünf Tieren gewonnenen Daten. Die erste Injektion signifikant (p <0,01) erhöhten Blutströmungsgeschwindigkeit im Tumorbereich von 0,61 ± 0,12 mm / s auf 0,74 ± 0,19, wohingegen die zweite Injektion aufrechterhalten die erhöhte Strömungsgeschwindigkeit auf 0,74 ± 0,19 mm / sec (). Die zweite Injektion nicht auslösen jede weitere Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit. N = 5, alle Statistiken: ANOVA mit wiederholten Messungen.
Abb. 1: Vorgehensweise, um eine Lungenmetastasen tragenden Ratte für Live-Mikroskopie vorzubereiten (A) MicroCT Bild eines Rattenlagerlungenmetastasen (Pfeil) (B) Lungenfensterrahmen (C) Ratten mit Brustwand Perforation und Lungenfenster.. angebracht. (D) Rückhaltemittel, um in Z-Richtung Brust Bewegung zu begrenzen. (E) Ratte mit Fensterkammer und zur Eindämmung Gerät unter dem Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Panel C und E zeigen behaarte Sprague Dawley Ratten, nicht athymischen Nacktratten.
Abbildung 2: Quantifizierung von Erhöhungen des Blutflusses von Lungenmetastasen. (A) Blutstromrichtung und die Geschwindigkeit in einem normalenLunge und eine Krebsmetastasen von MDAMB-231-und-Maus-Sarkom. Die Spalte auf der linken Seite enthält Schnappschüsse von Bildserien von Fluoreszenzaufnahmen. Alveolen kann als Teil des Hintergrundfluoreszenzmuster in normaler Lunge (oben) identifiziert werden. Metastasen durch die Fluoreszenz durch endogene fluoreszierende Proteine der injizierten Tumorzellen (gestrichelte Linie) verursacht sein. Spalten rechts:. Farbcodierten Karten der Blutflussrichtung (Farbindikator Rad markiert die Richtung, in die Zellen fließen) und Strömungsgeschwindigkeit in mm / Sekunde (B) Veränderungen der Mikrozirkulation Blutfluss nach wiederholter Injektion kombiniert Ephedrin und Ambrisentan (20 und 0,1 mg / kg pro Injektion). Nach der ersten Injektion wurde eine signifikante Erhöhung der Gesamtströmungsgeschwindigkeit (repeated measures ANOVA, p <0,01) beobachtet, jedoch nicht nach der zweiten (N = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es wird ein Modell vorgestellt, das möglich ist, Bild Veränderungen in der Mikrozirkulation Blutfluss und andere dynamische Prozesse in Lungenmetastasen von Ratten, mit Intravitalmikroskopie und Computerblutfluss-Analyse ist. Während andere Methoden gibt, um die Mikroskopie an exponierten Lunge in offenen Brustkorb von Nagetieren durchzuführen, ist auch dieses Modell die erste Bildlungenmetastasen durch eine Brustwand Perforation in einem geschlossenen Brust-Einstellung. Mit dieser Methode wird die Machbarkeit gezeigt, pharmakologisch induzierte Veränderungen der Mikrozirkulation Blutfluss von Lungenmetastasen zu messen.
Zwei grundlegende Methoden existieren, um Bild die Lunge Lebens Nagetiere, die durch spontane Blutfluss durchströmt werden, in direktem Kontakt mit der Lungenoberfläche: offene Brust Modelle zu beseitigen das Problem der ständig in Bewegung der Lunge aufgrund der Atem- und Herztätigkeit, indem eine Ansaugfenster an der Oberfläche der Lunge, während es den Rest des kardiopulmonalen Komplex zu expund und Vertragserklärung innerhalb von einem offenen Brusthöhle 7,14. Diese Methode bietet eine hervorragende experimentelle Zugang, die offene Brust Bedingungen und Ansaugfenster vorstellen Artefakte im Vergleich zu den Bedingungen einer intakten Lungen 8. Alternativ geschlossener Brust Verfahren, die den Brustkorb zu verlassen weitgehend intakt tragen das Versprechen der Beibehaltung der ursprünglichen Bedingungen im intakten Brusthöhle, wie die gegenseitige Beeinflussung der Herz- und Lungenbewegung auf die Durchblutung des anderen dynamisch. Diese Modelle beinhalten typischerweise einen Rahmen mit einem Fenster, an der Brustwand 15 oder eine transparente Membran, die in direktem Kontakt mit der Lungenoberfläche gebracht wird, um das Trocknen des Gewebes 9 verhindern vernäht wird. Die Schwierigkeit der Verhandlungen über die Herz-Lungen-Bewegung aufzunehmen und zu ermöglichen Mikroskopie ist eine große technische Herausforderung des geschlossenen Brust Verfahren und wahrscheinlich für die niedrigen Gesamt Ausbreitung dieser Technik verantwortlich. In unserem Fall ist die Kombination voneine feste Fensterhalterahmen und eine Z-Richtungs-Haltevorrichtung ist wirksam erwiesen, um eine seitliche Bewegung der Lunge ausreichend zu eliminieren, um automatisierte Messungen des Blutflusses von den Lungenkreislauf in einem geschlossenen Kasten Fenster 10 zu ermöglichen.
Ein übliches Verfahren, um die Blutflußgeschwindigkeit aus Intravitalmikroskopie Bildstapel zu messen, ist die Verwendung von räumlichen Anpassung von Blutströmungsmustern in aufeinanderfolgenden Bildern einer bestimmten Gefäßsegment 14. Um den Zeitaufwand bei der Analyse der einzelnen Blutgefäße zu verringern, wurde ein Blutflussbildgebungsalgorithmus eingeführt, die Blutflußgeschwindigkeit Karten der gesamte optische Feld 11 erzeugt. Neben dem Zeitvorteil, erlaubt dieses Verfahren auch die gleichzeitige räumliche Analyse des Blutflusses in dem gesamten optischen Bereich, unabhängig von vaskulären Morphologie oder Verzweigungspunkte. Dies ist besonders wichtig bei der Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung, in der mehrere Blutgefäße Contribute zur Versorgungsstatus eines bestimmten Tumorbereich 13,16,17. Tatsächlich kann die bekannte Tortuosität Tumorvaskulatur und das Vorhandensein von großen intervaskulären Lücken klar in beiden metastatischen Krebsarten, die untersucht wurden, (2A) ersichtlich. Die Lungen Fenster Methode wurde auch auf seine Fähigkeit zur Veränderung des Blutströmungsgeschwindigkeit in der Metastase zu melden, durch das Messen der Wirkung einer pharmakologischen Behandlung, die vor kurzem festgestellt worden ist, um den Blutströmungsgeschwindigkeit in den Lungenkreislauf zu erhöhen getestet: die blutdrucksenkenden Medikamenten Ephedrin erhöht die Herzleistung, während der Endothelin-Rezeptor-Blocker Ambrisentan reduziert die präkapillaren arteriolar Ton, der sich ergibt, wenn das Arzneimittel in Kombination angegeben, in erhöhten Blutströmungsgeschwindigkeit in Lungenkapillaren. Während diese Daten werden derzeit geprüft anderswo, die Fähigkeit der Kombination aus einem blutdruckregulierenden Medikamenten und ein Endothelin-Rezeptor-Antagonist periphere Muskel zu erhöhenPerfusion wurde unabhängig 18 veröffentlicht. Während unter normalen Bedingungen kann eine dosisabhängige Zunahme der Blutflussgeschwindigkeit nach beiden Injektionen beobachtet werden, kann die Tatsache, dass die zweite Injektion nicht zu einer weiteren Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit im Sarkom Metastasen führen aus der Tatsache ergeben, dass die maximale Tumorgefäße Gefäßerweiterung bereits nach der ersten Mischinjektion Ephedrin und Ambrisentan erreicht.
Die folgenden Einschränkungen gelten für die hier vorgestellte Technik: Dieses Protokoll ist von etwa 180 bis 300 g oder mehr für Ratten (und theoretisch, ähnlich großen Säugetiere). Kleiner Säugetiere wie Mäuse spezielle Modifikation erfordern, um die zerbrechlicher Anatomie und Physiologie des Brustkorbs unterzubringen. Die maximale räumliche Auflösung, die mit der vorgestellten Technik erreicht werden kann, ist theoretisch nur durch die numerische Apertur des Objektivs und der Dicke der Deckglas, das verwendet wird (begrenzt ~ 0.08 bis 0,1 & mgr; m in Standard Marken), um 100X Ziele, mit dem Einsatz von Öl-Immersion. In der Praxis jedoch kann der Restbewegung der Lunge die Verwendung von hochauflösenden Objektiven über 20X begrenzen. Wenn alle selbständige Bewegung der Lungen beseitigt wird, wird die zeitliche Auflösung der Technik nur durch die Bildrate der Kamera, und die Signalstärke des Fluoreszenzmarkers, der die Belichtungszeit bestimmt, begrenzt ist, auf ungefähr 100 Rahmen pro Sekunde. Die folgenden zusätzlichen Einschränkungen gelten für die vorgestellte Technik: auf der einen Seite, kann der aktuelle mikroskopischen und Rechen Einstellung nur die Analyse der Oberfläche eines bestimmten Metastasierung. Die Verwendung von Tiefe eindringenden Mikroskopie, wie fortgeschrittene Konfokalmikroskopie Abbildungsstrategien können in der Zukunft Messung der Blutströmungsgeschwindigkeit in 3 Dimensionen zu ermöglichen. Auch die vorgestellte Technik kann nicht, in seiner jetzigen Form, verwendet werden, um Läsionen weiter innerhalb des Lungenparenchyms zu visualisieren. Drittens ist die Insertion eines glass Fenster in direktem Kontakt mit der aktiven Blutgefäßen hat einige Potential, die mikrovaskuläre Strömung selbst über räumliche Komprimierung von Blutgefäßen oder von aufprall locoregional Temperatur stören. Viertens: die Verwendung eines externen Ventilators und Überdruck in der Lunge auch Potential, Lungen mikrozirkulatorischen Blutfluss zu ändern. Ferner werden nur begrenzte Bereiche des Brustkorbs sind für die beschriebenen, relativ unkomplizierte Operationsverfahren praktisch erreichbar. Andere Bereiche der Lungenoberfläche, wie medial-ventralen oder dorsalen Zugang würde kompliziertere chirurgische Techniken, zusammen mit tiefen Störungen der Biomechanik des Brustkorbs erforderlich. Wegen des Fehlens von Alternativen zur Bildgebung zu Mikrozirkulationsblutfluss zu studieren Mikroskopie kann die wichtigsten Entwicklungen in der nahen Zukunft, um diese Hürden zu überwinden und zu studieren Malignomen mit hoher zeitlicher-Ortsauflösung in allen Teilen der Nager Lunge zu erwarten.
Zusammenfassend ist ein Verfahren presENTED Muster zu, und Veränderungen von mikrovaskulären Blutströmungsgeschwindigkeit in der Oberflächenmetastasen der Rattenlunge messen. Kombinieren eines akuten geschlossener Brust chirurgisches Modell mit einem automatisierten Verfahren zum Messen der Blutströmungsgeschwindigkeit in der gesamten mikroskopischen optischen Feldes bietet diese Technik relativ Erhaltung der physiologischen Umgebung der Lunge, in der Lage ist, Veränderungen in der Gesamtmikrozirkulationsblutflussgeschwindigkeit und -richtung ist und relativ einfach zu bedienen. Es ist zu erwarten, dass diese Technik von großem Nutzen für alle Gruppen, die die Mikrozirkulation der Lungenmetastasen und andere dynamische Prozesse in dieser Indikation in Tiermodellen zu untersuchen sein werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
