Protocol
NOTA: Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este protocolo han sido previamente aprobado por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Duke (DUIACUC).
Cultivo Celular y Inyección 1. Cáncer
- Cultivar las células cancerígenas metastásicas marcados con fluorescencia (por ejemplo, células de cáncer de mama MDAMB231-GFP humanos, regalo del doctor Patricia Steeg, NCI, y las células del sarcoma de ratón marcado con YFP, regalo del doctor David Kirsch, Duke University Medical Center, Departamento de Oncología Radioterápica) en medio de cultivo adecuado (por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptavidina) a 37 ° C hasta aproximadamente 90% de confluencia.
- Tripsinizar las células, lavar 2 veces con PBS, contar, y luego inyectarlos en las venas de la cola de 10 semanas de edad ratas hembra desnudos anestesiados con isoflurano a los 5 millones de células por animal, usando una jeringa con una aguja 27 G. Anesthes nivel quirúrgicosia es verificada por la falta de reacción ante pizca dedo del pie.
2. El seguimiento de las metástasis Usando MicroCT
- Examinar las ratas una vez a la semana utilizando un micro-CT / micro-irradiador, para detectar la presencia de metástasis por encima de aproximadamente 2 mm de diámetro de diámetro. El micro-CT es comisionado como se describió anteriormente 12.
- Ratas sujetas a 3% anestesia con isoflurano antes de la imagen. Confirmar profunda anestesia por pellizco dedo del pie.
- Después de inicio de la anestesia, las ratas transferir rápidamente a la base de formación de imágenes en la cámara de formación de imágenes y conectarse a través de una nariz de cono a una mezcla de isoflurano al aire a 2,5-3%. Ajustar la posición de la rata en la cuna de una manera que el tórax se coloca en el haz de fotones del escáner MicroCT, usando los controles de posición externos y delimitador de láser en la base de formación de imágenes. Asegúrese de que la puerta de la cámara de formación de imágenes está cerrada, para proteger el investigador de los rayos gamma.
- Controlar la posición del animal usando de nuevola cámara de vídeo en color. Realizar una baja resolución prueba de imagen de TC, y utilizar la imagen resultante para ajustar el campo de visión a las dimensiones xyz de la cavidad torácica.
- Imagen del tórax rata utilizando un filtro Al 2 mm a 40 kVp, 2,5 mA, y 0.008 voxel a las 7 FPS y devolver el animal a su jaula. Obtención de imágenes de un animal debe tener no más de 15 o 20 min. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
- Confirme metástasis por la aparición de objetos relativamente de radio-opaco que no puede ser explicado por los vasos sanguíneos intratorácicos (Figura 1)
Cirugía 3. Cámara Ventana
- Anestesia, signos vitales y cateterización de la vena de la cola
- Seleccione animales con presencia de enfermedad metastásica. Inyectar animal con un d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia nivel quirúrgico por pizca dedo del pie antes de proceder.
Nota: Los protocolos de anestesia deben ser adaptadas a la respectiva configuración experimental. Pentobarbital fue elegido aquí como un anestésico de acción prolongada, con el fin de inducir la anestesia profunda para largos procedimientos, al tiempo que ofrece la opción de re-facile de dosificación. Sin embargo, la pérdida de animales para la sobredosificación es un problema común con anestesia con pentobarbital. Otra opción que conserva reflejos autonómicos en un grado mayor que pentobarbital es la ketamina en combinación con sedantes tales como xilazina o medetomidina, que sin embargo permite sólo para un único ciclo de re-dosificación. - Afeitado animales en el lado del cuerpo que tiene la enfermedad metastásica, y en la zona del cuello, usando una maquinilla. Limpie todo el pelo suelto que queda de la piel. Después se elimina el pelo suelto, aplique ungüento veterinario para los ojos, para evitar que se sequen.
NOTA: ratas desnudas Athymic pueden tener el pelo residual que REQUIeliminación res antes de proceder con los procedimientos quirúrgicos. Es muy importante eliminar todo el pelo a fondo, ya que puede interferir con los procedimientos quirúrgicos y de formación de imágenes. - Fijar el animal en posición supina sobre una placa de metal que se coloca en una almohadilla de calefacción 37 ° C el agua recirculada. Las extremidades delanteras y traseras son fijos en el plato con cinta.
NOTA: Es útil para controlar y registrar los signos vitales, tales como la frecuencia cardíaca y la oxigenación de la sangre arterial mediante el uso de un oxímetro de pulso, a través de procedimientos quirúrgicos y experimentales.
- Seleccione animales con presencia de enfermedad metastásica. Inyectar animal con un d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia nivel quirúrgico por pizca dedo del pie antes de proceder.
- La intubación traqueal
- Para colocar un catéter para la ventilación del animal, primero hacer una incisión transversal de la piel cervical, seguido por la separación mediana de la musculatura longitudinal ventral a la tráquea.
- Utilice acción repetida-apertura al cierre con un afilados fórceps para crear un paso para la sutura a través de la cara dorsal de la tráquea.
- Hacer una pequeña incisión en la tráquea en tél lado ventral, no más de semi-circular, aproximadamente entre el segundo y el tercer anillo traqueal. Deja un parte suficientemente larga de la tráquea expuesta en la superficie dorsal, para permitir la fijación del catéter traqueal.
- Inserte un 2,5 a 3,0 mm "Y" cánula traqueal en la tráquea, y apriete con una sutura monofilamento 4-0. Asegúrese de que la cánula está conectado a un ventilador ciclado de presión con una botella conectada al conducto de caducidad que se llena de 6 cm de agua, para mantener la presión pulmonar positivo. Corriente de llenado de gas debe ser de 100% de oxígeno, a menos experimentalmente deseado lo contrario.
- Insertar un catéter con una aguja G 25-27, y llena con solución salina heparinizada en una de las venas de la cola de la rata, y fijar en su lugar con cinta adhesiva.
NOTA: Asegúrese de que la permeabilidad del catéter vena de la cola durante todo el procedimiento mediante inyecciones repetidas de una pequeña cantidad de solución salina heparinizada en la vena de la cola. Además, la intubación oro-traqueal, es decir, la orientación de un traquealtubo a través de la boca del animal anestesiado y más allá de la laringe dentro de la tráquea, es una posible alternativa al procedimiento de traqueotomía que se describe aquí. Sin embargo, este método requiere entrenamiento y experiencia especial, para evitar daños a la tráquea, y también para evitar la canulación accidental del esófago.
- Aplicación de ventana pulmonar
- Quitar la piel desde el lado del pecho donde se encuentra la enfermedad metastásica, mediante la creación de una incisión y, a continuación, separando la piel mediante disección roma.
Nota: La piel puede ser extirpado y se retira posterior al desprendimiento - Proceder mediante la disección de las dos capas de la superposición de la musculatura (pectoral, serrato, y dorsal ancho), pero dejando los músculos intercostales intacto. Crear una perforación en la cavidad del pecho de aproximadamente 1,5 cm de diámetro, mediante la eliminación de porciones de típicamente dos costillas adyacentes. Lo ideal es ubicar la perforación de la región de la sexta y séptima ribs.
- Osteotomía:
- Para minimizar el sangrado y el daño a la superficie del pulmón, sujeta fuertemente la costilla que se corta con un fórceps quirúrgico dentadas durante el corte. Usando tijeras quirúrgicas, corte el lado medial de la primera costilla, en un ángulo de aproximadamente 45 °, dejando el lado puntiagudo del hueso de la costilla restante apuntando hacia el exterior.
- Posteriormente, cortar el lado lateral de la costilla de una manera similar, dejando de nuevo el lado puntiagudo del hueso de la costilla apunta hacia afuera, para evitar daños en la superficie del pulmón.
- Repita el procedimiento para la costilla adyacente, a continuación, cortar los músculos intercostales y retire la pieza extirpada. Durante este procedimiento, mantener la presión pulmonar de una manera que la interacción mecánica entre la superficie del pulmón y la caja torácica se reduce al mínimo. Para ello, la regulación apropiada de presión inspiración en el ventilador.
- La inserción de la ventana:
- Inserte una ventana de pulmón por encargo, que consta de un cubreobjetos que esunido a una toma de Plexiglas (Figura 1B). Coloque la ventana a la toma por encolado, o mediante la aplicación de una cantidad muy pequeña de grasa de vacío. Inserte la ventana de manera que las metástasis de superficie se encuentran cerca del centro de la ventana. Si es necesario, ajustar el agujero insertado para llevar la micrometástasis en el centro de la ventana mediante la ampliación del agujero ligeramente hacia el lado respectivo.
NOTA: La enfermedad metastásica en la superficie pleural se puede identificar como puntos blancos claramente reconocibles o áreas dentro de las partes sanas de color rosa de lo contrario-a-salmón de la superficie pulmonar que aparecen predominantemente a lo largo de las fisuras. Mientras micrometástasis pueden ocurrir en otras áreas del exterior pleural, las líneas celulares investigadas casi siempre muestran la superficie micrometástasis en el área perforada, una vez que la enfermedad metastásica puede ser detectada radiológicamente. - Después de insertar el enchufe en la perforación, y la creación de un contacto directo con la pleura visceral de la lung, la sutura de los bordes del marco de la ventana en el músculo intercostal circundante, utilizando 4,0 sutura de monofilamento (Figura 1C). Utilice un ligero aumento de la presión de inspiración en el ventilador para ayudar a aire residual escapar y para crear un sello.
Nota: La tasa de respiración de ratas puede variar mucho, dependiendo del estado de la anestesia, el estado de excitación o la ansiedad, la concentración de oxígeno en el aire inspirado (FiO 2), etc. Es recomendable ajustar la tasa de respiración de 70 a 90 latidos por minuto. La presión de inspiración se debe ajustar con precaución y no se puede ajustar a más de aprox. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), para evitar daños en la superficie del pulmón.
- Inserte una ventana de pulmón por encargo, que consta de un cubreobjetos que esunido a una toma de Plexiglas (Figura 1B). Coloque la ventana a la toma por encolado, o mediante la aplicación de una cantidad muy pequeña de grasa de vacío. Inserte la ventana de manera que las metástasis de superficie se encuentran cerca del centro de la ventana. Si es necesario, ajustar el agujero insertado para llevar la micrometástasis en el centro de la ventana mediante la ampliación del agujero ligeramente hacia el lado respectivo.
- Coloque el animal en un limitador de diseño personalizado que está diseñado para eliminar la dirección Z movimiento (Figura 1D) en una placa de acero que se coloca en un termostática (eléctrica) manta de calefacción, bajo un microscopio de fluorescencia. Controlar el cuerpo del animalla temperatura usando un termistor rectal. Ajuste los tornillos de la inmovilización de los animales, y la presión de inspiración en el ventilador para lograr un control óptimo de movimiento lateral.
Nota: la respiración natural en mamíferos involucra a los tres sentidos de circulación pulmonar y la extensión del pecho:, dorso-ventral, y cráneo-caudal bilateral. Con el fin de preservar el movimiento de la respiración natural tanto como sea posible, es importante para reducir al mínimo la compresión de la dirección Z en la medida necesaria. Debido a la restricción-Z dimensiones tiene el potencial de introducir artefactos que puedan afectar el flujo de sangre y otros parámetros, es aconsejable mantener condiciones constantes durante la serie de mediciones repetidas en el mismo animal.
- Quitar la piel desde el lado del pecho donde se encuentra la enfermedad metastásica, mediante la creación de una incisión y, a continuación, separando la piel mediante disección roma.
4. Imaging y medición de flujo sanguíneo en la microcirculación
- Recoger las células rojas de la sangre a través de punción cardíaca y etiquetarlos con DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocianina), como se describió anteriormente <sup> 10.
- Inyectar 300 l de glóbulos rojos marcados en la vena de la cola de la rata antes de realizar la cirugía de la cámara de ventana, para evitar efectos de adhesión pase primero a la ventana de cristal. Eliminar cualquier burbuja de aire en la jeringa o un catéter, como la introducción de aire en la vena inhibirá cualquier inyecciones adicionales.
- Image flujo de sangre con una cámara CCD microscopio a -40 ° C chip de temperatura de enfriamiento, y aproximadamente 100X resolución global (es decir, con un objetivo de microscopio 10X, 10X y pre-cámara ocular). Utilice conjuntos de filtros Rodamina / TRITC estándar (450-490 nm de excitación, emisión> 515 nm). Registre la resolución real de las secuencias de imágenes resultantes velocidad de fotogramas y pixel. Consigue al menos 200 (idealmente alrededor de 300) imágenes por pila, para garantizar el éxito del análisis de la velocidad del flujo.
- Reponer la pérdida de líquidos en el animal mediante la inyección de aproximadamente 1 ml de solución salina IP cada hr.
NOTA: Los valores experimentales que implican una intervención, por ejemplo,un fármaco que modifica la velocidad del flujo sanguíneo en una metástasis del cáncer pulmonar, requiere mediciones repetidas de la velocidad del flujo de sangre en el cáncer metastásico pulmonar. Para estos experimentos prolongados, es importante para reponer el animal con suficiente líquido. - La eutanasia a los animales por infusión de 3 ml de 3N KCl en la vena de la cola
- Evaluar las pilas de imágenes utilizando un publicada, disponible públicamente algoritmo informático basado en Matlab que va a crear el flujo de escala de grises de velocidad y mapas de color codificado para todo el flujo de sangre rastros 10,11. Posteriormente evaluar las imágenes en escala de grises resultantes por el uso de software de análisis de imagen comercial o de acceso público, tales como la imagen J, después de thresholding de valores que indican ningún movimiento de las células de la sangre, es decir, sin vasculatura activo.
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Representative Results
La vasculatura en tumores sólidos se sabe que difieren significativamente de suministro normal de sangre, mostrando un mayor grado de tortuosidad y mayores distancias intervasculares 13. En consecuencia, las pistas del flujo sanguíneo en metástasis de cáncer de mama y el sarcoma pulmonar experimental tienen formas irregulares y grandes lagunas intervasculares (Figura 2A, dos paneles inferiores) cuando se compara con la microcirculación pulmonar normal (Figura 2A, panel superior). En un estudio anterior, la capacidad del método de la ventana pulmonar se demostró para realizar mediciones automatizadas de los cambios en la velocidad del flujo sanguíneo en los pulmones normales 10. Con el fin de investigar si el método de la ventana pulmonar también puede medir un aumento en la velocidad del flujo sanguíneo en las metástasis pulmonares, la combinación de fármacos de la efedrina simpaticomimético fármaco y el ambrisentan bloqueador de endotelina que se ha encontrado recientemente para aumentar la circulación microvascular en los pulmones sanos,se aplicó aquí (datos que se examinan en otra parte). En este estudio, se muestra la capacidad del método para detectar un aumento en la velocidad del flujo sanguíneo en las metástasis pulmonares de sarcoma de ratón, causada por la dosificación con la combinación de efedrina (20 mg / kg) y el ambrisentan antagonista del receptor de endotelina (0,5 mg / kg, ambos fármacos por vía intraperitoneal, la Figura 2B). Cada punto de datos representa los promedios individuales agrupados de tres mediciones con intervalos de cinco minutos, como media de los datos adquiridos en cinco animales. La primera inyección significativamente (p <0,01) aumentó la velocidad del flujo de sangre en el área del tumor de 0,61 ± 0,12 mm / seg a 0,74 ± 0,19, mientras que la segunda inyección mantiene la velocidad de flujo elevada a 0,74 ± 0,19 mm / seg (). La segunda inyección no provocó ningún aumento adicional en la velocidad del flujo de sangre. N = 5, todas las estadísticas: ANOVA de medidas repetidas.
Figura 1:. Procedimiento para preparar una rata metástasis pulmonares de soporte para formación de imágenes de microscopía en vivo (A) Imagen MicroCT de un cojinete de metástasis pulmonares de rata (flecha) (B) marco de la ventana pulmonar (C) Rata con perforación de la pared del pecho y de la ventana pulmonar.. unidos. (D) del dispositivo de restricción para limitar el movimiento del pecho de la dirección Z. (E) de la rata con cámara de la ventana y el dispositivo de restricción en el microscopio de fluorescencia. Nota: El panel C y E espectáculo pelo teniendo ratas Sprague Dawley, no sin timo ratas desnudas.
Figura 2: Cuantificación de los aumentos en el flujo sanguíneo de las metástasis pulmonares. (A) la dirección del flujo de la sangre y la velocidad en una normal depulmón, y una metástasis del cáncer de MDAMB-231 y el sarcoma de ratón. La columna de la izquierda contiene instantáneas de imagen de serie de micrografías de fluorescencia. Alvéolos puede ser identificada como parte del patrón de fluorescencia de fondo en los pulmones normales (panel superior). Las metástasis pudieron ser localizados por la fluorescencia causada por proteínas fluorescentes endógenos de las células cancerosas inyectadas (línea discontinua). Columnas a la derecha:. Mapas de colores codificados de la dirección del flujo de la sangre (la rueda de color indicador marca la dirección hacia la que fluyen las células) y la velocidad del flujo, medidos en mm / segundo (B) Los cambios en el flujo sanguíneo en la microcirculación después de la inyección repetida de efedrina combinado y ambrisentan (20 y 0,1 mg / kg por inyección). Se observó un aumento significativo en la velocidad de flujo total (ANOVA de medidas repetidas, p <0,01) después de la primera inyección, pero no después de la segunda (N = 5).
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Discussion
Se presenta un modelo que es factible cambios de imagen en el flujo sanguíneo en la microcirculación y otros procesos dinámicos en las metástasis pulmonares de ratas, usando microscopía intravital y análisis de flujo de sangre computacional. Si bien existen otros métodos para llevar a cabo la microscopía en pulmones expuestos en ribcages abiertos de los roedores, este modelo también es la primera imagen de metástasis pulmonares a través de una perforación de la pared del pecho en un entorno de pecho cerrado. Usando este método, la viabilidad se muestra para medir los cambios inducidos farmacológicamente en la microcirculación el flujo de sangre de las metástasis pulmonares.
Existen dos métodos básicos para la imagen de los pulmones de los roedores vivos que se perfundidos por el flujo de sangre espontánea, de contacto directo con la superficie del pulmón: modelos tórax abierto eliminar el problema del movimiento constante del pulmón debido a la actividad respiratoria y cardíaca mediante la aplicación de una ventana de succión a la superficie del pulmón, permitiendo al mismo tiempo el resto del complejo cardiopulmonar a EXPy y el contrato dentro de un 7,14 cavidad torácica abierta. Aunque este método proporciona un excelente acceso experimental, las condiciones en el pecho y la ventana abierta de aspiración introducen artefactos en comparación con las condiciones de un pulmón intacto 8. Alternativamente, los procedimientos de tórax cerrado que salen de la caja torácica en gran parte intacto llevan la promesa de preservar las condiciones originales en la cavidad torácica intacta, tales como la influencia mutua de movimiento cardiaca y pulmonar en el flujo de sangre de cada uno dinámico. Estos modelos implican típicamente un marco con una ventana que se sutura a la pared del pecho 15, o una membrana transparente que se pone en contacto directo con la superficie del pulmón para prevenir el secado del tejido 9. La dificultad de la negociación del movimiento cardiopulmonar para dar cabida y permitir imágenes de microscopía es un importante desafío técnico de procedimientos torácicos cerrados, y probablemente responsable de la baja propagación global de esta técnica. En nuestro caso, la combinación deun marco de ventana de retención de sólidos y un dispositivo de restricción de la dirección Z ha demostrado ser eficaz para eliminar suficientemente el movimiento lateral del pulmón para permitir mediciones de flujo de sangre automatizados de la circulación pulmonar en una ventana de pecho cerrado 10.
Un método común para medir la velocidad del flujo de sangre de intravital pilas de imágenes de microscopía es el uso de la coincidencia espacial de patrones de flujo sanguíneo en imágenes consecutivas de un segmento dado vascular 14. Con el fin de reducir el esfuerzo de tiempo asociado con el análisis de los vasos sanguíneos individuales, un algoritmo de formación de imágenes flujo de sangre se ha introducido que produce mapas de velocidad de flujo de sangre de todo el campo óptico 11. Además de la ventaja de tiempo, este método también permite el análisis espacial simultánea de flujo de sangre en el campo óptico conjunto, independientemente de la morfología vascular o puntos de ramificación. Esto es particularmente importante cuando se estudia el microambiente tumoral, donde múltiples vasos sanguíneos CONTRIbuir a la situación de suministro de un área determinado tumor 13,16,17. De hecho, la tortuosidad conocida de la vasculatura del tumor y la existencia de grandes lagunas intervasculares se pueden ver claramente en ambos tipos de cáncer metastásicas que han sido investigados, (Figura 2a). El método de la ventana pulmonar también ha sido probado por su capacidad para informar de los cambios en la velocidad del flujo sanguíneo en la lesión metastásica, midiendo el efecto de un tratamiento farmacológico que se ha encontrado recientemente para aumentar la velocidad del flujo sanguíneo en la circulación pulmonar: la efedrina drogas hipertensiva aumenta la frecuencia cardíaca, mientras que el ambrisentan bloqueador del receptor de endotelina reduce el tono arteriolar pre-capilar, lo que resulta, cuando los medicamentos se administran en combinación, en un aumento de la velocidad del flujo sanguíneo en los capilares pulmonares. Si bien estos datos están actualmente bajo revisión en otro lugar, la capacidad de la combinación de un fármaco hipertensiva y un antagonista del receptor de endotelina para aumentar musculares periféricaperfusión ha sido publicado de forma independiente 18. Mientras que bajo condiciones normales, un aumento dependiente de la dosis de la velocidad del flujo de sangre se puede observar después de que ambas inyecciones, el hecho de que la segunda inyección no conduce a un aumento adicional de la velocidad del flujo en las metástasis de sarcoma podría resultar del hecho de que los vasos tumorales máxima vasodilatación que ya se ha alcanzado después de la primera inyección combinada de efedrina y ambrisentan.
Las siguientes limitaciones se aplican a la técnica presentada aquí: Este protocolo es aplicable a las ratas (y teóricamente, mamíferos de tamaño similar) de aproximadamente 180 a 300 g o más. Mamíferos más pequeños, tales como ratones requerirán modificación especial para acomodar la anatomía más frágil y la fisiología de la caja torácica. La resolución espacial máxima que se puede conseguir con la técnica presentada teóricamente sólo está limitado por la apertura numérica del objetivo y el espesor de la corredera de cobertura que se utiliza (~ 0.08 a 0,1 micras de marcas estándar), a los objetivos de 100x, con el uso de inmersión en aceite. En la práctica sin embargo, el movimiento restante del pulmón podría limitar el uso de objetivos de alta resolución más allá de 20X. Si todo el movimiento autónomo de los pulmones se elimina, la resolución temporal de la técnica sólo está limitado por la velocidad de fotogramas de la cámara, y la intensidad de la señal de la etiqueta fluorescente, que determina el tiempo de exposición, a aproximadamente 100 fotogramas por segundo. Las siguientes limitaciones adicionales se aplican a la técnica presentada: por un lado, la configuración microscópica y computacional actual sólo permite el análisis de la superficie de una metástasis dado. El uso de la microscopía profundidad de penetración, como las estrategias de imagen avanzadas de microscopía confocal, podrá en el futuro permitir la medición de la velocidad del flujo sanguíneo en 3 dimensiones. Además, la técnica presentada no puede, en su forma actual, se utiliza para visualizar las lesiones más en el interior del parénquima pulmonar. En tercer lugar, la inserción de un glaventana ss en contacto directo con los vasos sanguíneos activo tiene un cierto potencial para perturbar el flujo microvascular por sí mismo, a través de la compresión espacial de los vasos sanguíneos, o por el impacto de la temperatura locorregional. En cuarto lugar, el uso de un ventilador externo y la presión positiva en el pulmón también tiene potencial para alterar el flujo sanguíneo en la microcirculación pulmonar. Por otra parte, sólo las áreas limitadas de la caja torácica son prácticamente accesible para los procedimientos quirúrgicos, relativamente sencillos descritos. Otras áreas de la superficie del pulmón, como el acceso medial ventral o dorsal requerirían técnicas quirúrgicas más elaboradas, además de profundas perturbaciones de la biomecánica de la caja torácica. Debido a la falta de alternativas de imágenes de microscopía para estudiar el flujo sanguíneo en la microcirculación, las principales novedades se pueden esperar en el futuro cercano para superar estos obstáculos y estudiar los tumores malignos en alta resolución temporal-espacial en todas las partes del pulmón de roedores.
En resumen, un método es presenteder para medir los patrones de, y cambios en, la velocidad del flujo sanguíneo microvascular en las metástasis superficiales del pulmón de rata. La combinación de un modelo quirúrgico tórax cerrado agudo con un método automatizado de medición de velocidad del flujo sanguíneo en todo el campo óptico microscópico, esta técnica ofrece relativa preservación del medio ambiente fisiológico del pulmón, es capaz de detectar cambios en la velocidad general de flujo sanguíneo en la microcirculación y la dirección , y es relativamente fácil de usar. Se puede esperar que esta técnica será de gran utilidad para todos los grupos que estudian la microcirculación de las metástasis pulmonares y otros procesos dinámicos en este entorno de enfermedad en modelos de roedores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
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