Protocol
注：このプロトコルで説明されているすべての動物関連する手順は、以前にデューク大学施設内動物管理使用委員会（DUIACUC）によって承認されている。
1.がん細胞培養およびインジェクション
- 蛍光標識された転移性癌細胞（ 例えば 、ヒトMDAMB231-GFP乳癌細胞、博士パトリシアシュテーク、NCIからの贈り物、とYFP標識マウス肉腫細胞、デビッドキルシュ、デューク大学医療センター、放射線腫瘍科からの贈り物）を育成（10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトアビジン、例えばダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））適切な培養培地中で、37℃で約90％コンフルエントになるまで。
- トリプシン処理細胞を、カウント、PBSでそれらを2回洗浄し、次いで27 G針を注射器を用いて、動物あたり5百万個の細胞で、イソフルラン麻酔10週齢の雌ヌードラットの尾静脈へ注入。外科レベルanesthesとりわけ、トーピンチに対する反応の欠如によって確認される。
マイクロCTを使用して、転移の2モニタリング
- 上記転移直径が直径約2mmの存在を検出するために、マイクロCT /マイクロ照射装置を用いて週に一度、ラットを調べる。以前12に記載のように、マイクロCTは、委託されている。
- イメージングの前に3％のイソフルラン麻酔の対象とラット。つま先のピンチによる深い麻酔を確認してください。
- 麻酔の発症後、すぐに画像化チャンバ内イメージングクレードルにラットを転送し、2.5から3パーセントにイソフルランと空気の混合物にノーズコーンを経由して接続します。イメージングクレードルの外部に位置制御とレーザー区切り文字を使用して、その胸部がマイクロCTスキャナの光子ビームに配置されている方法で、クレードルにラットの位置を調整します。ガンマ線から調査員を遮蔽するために、イメージング室のドアが閉じていることを確認してください。
- 再び用いて動物の位置を制御するカラービデオカメラ。低解像度のCT撮影テストの実行を実行し、胸腔のXYZ寸法に視野を調整するために、得られる画像を使用しています。
- イメージラットの40のkVpで2ミリメートルのAlフィルタを使用して、胸郭、2.5ミリアンペア、及び7 fpsで0.008ボクセルとそのケージに動物を返す。 1動物の画像化はしないより15以上または20分を取る必要があります。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。
- 胸腔内の血管では説明できない、比較的放射線不透過オブジェクトの出現によって転移を確認する（ 図1A）
3.ウィンドウ商工手術
- 麻酔、バイタルサイン及び尾静脈カテーテル法
- 転移性疾患の存在で動物を選択します。腹腔dで動物に注入する50mg / kgのペントバルビタールのOSE。先に進む前に、つま先のピンチによって外科レベルの麻酔を確認してください。
注：麻酔プロトコルは、それぞれの実験のセットアップに一致させる必要があります。容易な再投薬の選択肢を提供しながらペントバルビタールは、長い手順のための深い麻酔を誘導するために、長時間作用型麻酔薬として、ここで選ばれました。しかし、過剰投与の動物の損失はペントバルビタール麻酔に共通の問題である。ペントバルビタールよりも大きな程度に自律神経反射神経を保持する別のオプションは、そのようなしかし、単一の再投与サイクルのために許可しキシラジンまたはメデトミジン、などの鎮静剤との組み合わせでケタミンです。 - クリッパーを使用して、転移性疾患を有する、頸部領域における本体の側面に動物を剃る。皮膚から残りのすべての抜け毛を拭き取ってください。抜け毛を除去した後、乾燥するのを防ぐために、眼に獣医軟膏を適用する。
注：無胸腺ヌードラットはrequiが残留髪を持っていること外科手術手順に進む前にRES除去。それは外科的手技およびイメージングを妨げる可能性として、それは、徹底的にすべての毛を除去することは非常に重要です。 - 37℃の水を循環加熱パッド上に配置された金属板上に仰臥位で動物を修正。フロントと後肢四肢をテープでプレートに固定されている。
注：それは制御し、外科的および実験手順を通じて、パルス酸素濃度計を使用して、このような心拍数と動脈血酸素化などのバイタルサインを記録するのに便利です。
- 転移性疾患の存在で動物を選択します。腹腔dで動物に注入する50mg / kgのペントバルビタールのOSE。先に進む前に、つま先のピンチによって外科レベルの麻酔を確認してください。
- 気管挿管
- 動物の換気のためにカテーテルを配置するために、最初の気管に縦筋系の腹の中央分離することにより横方向子宮頸部皮膚切開を行う。
- 気管の背側を通して縫合糸の通路を作成するには、鋭いピンセットを用いて繰り返し開閉·ツー·クローズアクションを使用します。
- T上の気管内に小さな切開を作る彼腹側、およそ第二及び第三の気管輪の間に、半円形を超えない。気管カテーテルの固定を可能にするために、背側表面に露出した気管の十分長い部分のままにしておきます。
- 気管内に2.5〜3.0ミリメートル "Y"気管カニューレを挿入し、4-0モノフィラメント縫合糸で締めます。正の肺動脈圧を維持するために、カニューレは水の6センチメートルで満たされている有効期限のダクトに接続され、ボトルに圧力循環人工呼吸器に接続されていることを確認してください。実験的にそれ以外の目的のない限り、流入ガスは、100％酸素でなければなりません。
- 25-27 G針でカテーテルを挿入し、ラットの尾静脈のいずれかに、ヘパリン化生理食塩水で満たされ、テープで固定します。
注：繰り返し尾静脈にヘパリン処理生理食塩水を少量注入することにより、作業中は尾静脈カテーテルの開存性を確認してください。気管の指導すなわちまた、オロ·気管挿管、麻酔した動物の口を経由し、気管に喉頭過去のチューブは、ここで説明されている気管切開手順に可能な代替である。しかし、この方法は、気管への損傷を避けるために、特別な訓練と経験を必要とし、また、食道の偶発的カニューレ挿入を排除する。
- 肺のウィンドウの適用
- 切開を作成することにより、転移性疾患が配置されて胸の側から皮膚を除去した後、鈍的切開を使用して皮膚を外す。
注：皮膚を切除し、剥離の後に除去することができます - オーバーレイする筋肉組織（胸筋、鋸、および広背筋）の2つの層を切開するが、そのまま肋間筋を残すことによって進んでください。典型的には、2つの隣接するリブの一部を除去することにより、直径約1.5cmの胸腔内の穿孔を作成する。理想的には、第六及び第七rの領域の中に穿孔を見つけるIBS。
- 骨切り術：
- 肺表面に出血し、被害を最小限に抑えるために、しっかりと切削中に歯の手術鉗子で切断するリブを開催。外科用ハサミを使用して、外部のポインティング残存肋骨の尖った側を残して、約45°の角度で、第一リブの内側をカット。
- その後、再度、肺表面の損傷を防止するために、外側に向いて肋骨の尖った側を残して、同様にして肋骨の側面を切る。
- 肋間筋をカットし、切除した部分を削除した後、隣接するリブのための手順を繰り返します。この手順の間、肺表面と胸郭との間の機械的相互作用が最小化されるように、肺の圧力を維持する。適切に人工呼吸器上のインスピレーションの圧力を調節することによってこれを行います。
- ウィンドウの挿入：
- あるカバーガラスからなる、カスタムメイドの肺のウィンドウを挿入しますプレキシグラスソケット（ 図1B）に装着。接着によってソケットに窓を取り付け、または真空グリースの非常に少量を適用することによって。表面転移がウィンドウの中心に近い位置していることのようにウィンドウを挿入します。必要に応じて、それぞれの側に少し穴を大きくすることで、ウィンドウの中心に微小転移をもたらすために挿入された穴を調整します。
注：胸膜表面上の転移性疾患は、割れ目に沿って、主に現れる肺表面のそれ以外の場合はピンク·ツー·サーモン色の健全な部品内明確に認識白い点または領域として識別することができます。微小転移は胸膜外装の他の領域で発生する可能性がありますが、調べた細胞株は、ほとんど常に転移性疾患は放射線学的に検出することができたら、穿孔領域に微小転移を浮上表示します。 - 穿孔にソケットに挿入、およびlの臓側胸膜との直接接触を作成した後長官、4.0モノフィラメント縫合糸（ 図1C）を使用して、周囲の肋間筋に、窓枠の縁を縫合する。脱出するとシールを作成するために残留空気を助けるために人工呼吸器にインスピレーション圧力のわずかな増加を使用してください。
注：ラットの呼吸速度は、それは70と90拍の間の呼吸速度を調整することが推奨されるなど、麻酔、興奮や不安状態、吸気中の酸素濃度（のFiO 2）の状態に応じて、大きく変化し得る。インスピレーション圧力が慎重に調整されるべきであり、約以上に設定することはできませ。肺表面への損傷を回避するための8cm H 2 O（0.6 mmHg）で、。
- あるカバーガラスからなる、カスタムメイドの肺のウィンドウを挿入しますプレキシグラスソケット（ 図1B）に装着。接着によってソケットに窓を取り付け、または真空グリースの非常に少量を適用することによって。表面転移がウィンドウの中心に近い位置していることのようにウィンドウを挿入します。必要に応じて、それぞれの側に少し穴を大きくすることで、ウィンドウの中心に微小転移をもたらすために挿入された穴を調整します。
- 蛍光顕微鏡下で、恒温（電気）加熱ブランケット上に配置された鋼板上のZ方向の動き（ 図1D）を排除するように設計されているカスタムデザインの制止に動物を配置します。動物の体を制御する直腸サーミスタを用いた温度。動物の制止のネジを調整し、人工呼吸器にインスピレーション圧力が横方向の動きの最適な制御を実現する。
注：二国間、背腹、および頭尾：哺乳動物の自然な呼吸は、肺の動きと胸の延長のすべての3つの方向を伴う。可能な限り自然な呼吸運動を維持するためには、必要な範囲でZ方向の圧縮を最小限にすることが重要である。 Z次元拘束血流と他のパラメータに影響を与える可能性のアーチファクトを導入する可能性があるので、同じ動物で繰り返した一連の測定の間、一定の条件を維持することが望ましい。
- 切開を作成することにより、転移性疾患が配置されて胸の側から皮膚を除去した後、鈍的切開を使用して皮膚を外す。
微小循環血流の4イメージングおよび測定
- 心穿刺によって赤血球を収集し、前述のように、のDiI（1,1 = -dioctadecyl -3,3,3- =、3 =テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩）でそれらをラベル<SUP> 10。
- 窓室手術が行われる前にガラス窓に初回通過の接着効果を回避するために、ラットの尾静脈への標識赤血球の300μLを注入する。静脈内への空気の導入はそれ以上の注射を阻害するように、注射器やカテーテル内の任意の気泡を除去。
- 画像血液温度を冷却-40℃チップにおける顕微鏡CCDカメラで流れ、及び約100X全体の解像度（10X顕微鏡対物レンズを有する、すなわち 、および10Xプレカメラ眼）。標準ローダミン/ TRITCフィルターセット（励起450から490ナノメートル、放射> 515 nm）を使用してください。結果として生じる画像シーケンスの実際のフレームレートとピクセル解像度を記録する。スタックごとにレコードが少なくとも200（理想的には約300）の画像は、流速の成功分析を確実にする。
- すべての時間食塩IPの約1ミリリットルを注入することによって、動物における流体損失を補充する。
注：介入を伴う実験的な設定、 例えば肺の癌転移における血流速度を修正する薬剤は、肺転移癌の血流速度の繰り返し測定を必要とする。これらの拡張された実験では、十分な流体を動物に補充することが重要である。 - 尾静脈に3NのKCl 3mlを注入することによって動物を安楽死させる
- すべての血流の流速グレースケール及びカラーコードされたマップ10,11をトレース作成され公開され、公的に利用可能なMatlabのベースのコンピュータアルゴリズムを使用して画像スタックを評価する。続いて、そのようなイメージJとして、商業的または公的に利用可能な画像解析ソフトを用いて得られたグレースケール画像を評価し、血液細胞のない動きがないことを示す値から閾値処理の後、アクティブな脈管構造、すなわちない 。
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Representative Results
固形腫瘍における血管系は、屈曲度の大きい度、高い脈管間の距離13を示し、正常な血液供給と大きく異なることが知られている。正常な肺の微小循環（ 図2A、上パネル）と比較した場合、それに応じて、実験的肺乳癌および肉腫の転移における血流トラックは、不規則な形状、大きな脈管間の隙間（ 図2A、下側2パネル）を有する。以前の研究では、肺のウィンドウ法の能力は、正常な肺10内の血流速度の変化の自動測定を行うことが示された。肺のウィンドウ法はまた、肺転移における血流速度の増加を測定することができるかどうかを調査するために、交感神経作用薬エフェドリン、最近、健康な肺における微小循環を増加させることが見出されているエンドセリンブロッカーアンブリセンタンの薬物の組み合わせ、（他の場所で会計データ）ここで適用した。本研究では、この方法の能力は、エフェドリンとの組み合わせた（20mg / kg）およびエンドセリン受容体拮抗薬、アンブリセンタン（0.5ミリグラム/の投与によって引き起こされる、マウス肉腫の肺転移における血流速度の増加を検出することが示されているキロ、両薬剤を腹腔内、 図2B）。各データポイントは、5分間隔で3回の測定のプールされた個々の平均を表し、5匹の動物で取得したデータにわたって平均。二回目の注射は、0.74±0.19ミリメートル/秒で上昇流速を維持し、一方、最初の注射は、有意に（p <0.01）、0.74±0.19 0.61±0.12ミリメートル/秒の腫瘍領域における血流速度を増加させた（）。第二の注入は、血流速度のさらなる増加を誘発しなかった。 N = 5、すべての統計：反復測定ANOVA。
図1：ラットベアリング肺転移（矢印）のライブ顕微鏡イメージングのための肺転移担持ラットを調製する方法（A）マイクロCT画像（B）肺窓枠胸壁の穿孔及び肺のウィンドウ（C）ラット。付属の蛍光顕微鏡下ウィンドウチャンバ及び拘束装置と（D）Z方向の胸部の動きを制限する抑制装置。（E）ラットは。注：SDラットベアリングパネルCとEショーの髪を、ヌードラット胸腺ません。
図2：肺転移の血流の増加の定量化。通常の（A）において、血流方向及び速度肺およびMDAMB-231およびマウス肉腫から癌転移。左側の列には、蛍光顕微鏡写真の画像シリーズからのスナップショットが含まれています。肺胞は、正常肺におけるバックグラウンド蛍光パターン（上パネル）の一部として識別することができる。転移は、注入された癌細胞（破線）の内因性蛍光タンパク質による蛍光によって配置することができる。右の列はmm /秒で測定された色符号化された血流方向のマップ（色表示ホイールは、細胞が流れているに向かう方向をマーク）と流速（B）を合わせエフェドリンの反復注射後の微小循環血流の変化とアンブリセンタン（注射あたり20および0.1mg / kg）を投与した。全体的な流速の有意な増加（反復測定ANOVAはp <0.01）は、最初の注射後ではなく、第二の後に観察された（N = 5）。
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Discussion
モデルは、生体顕微鏡と計算血流分析を用いて、画像の微小循環血流の変化とラットの肺転移の他の動的プロセスを実行可能であることが示されている。他の方法は、げっ歯類の開放胸郭内の露出肺に顕微鏡検査を実行するために存在するが、このモデルは、閉胸設定における胸壁の穿孔を通して画像肺転移の最初のものである。この方法を使用して、実現可能性は、肺転移の微小循環血流の薬理学的に誘導された変化を測定するために示されている。
2つの基本的な方法は、画像に肺表面に直接接触して、自発的な血流により潅流生体げっ歯類の肺に存在する：開胸モデルは、呼吸および心臓活動に対する肺の一定の動きの問題を排除する吸入窓を適用することによって肺の表面に、心肺複合体の残りの部分はexpに可能にしながらそして、オープン胸腔7,14内で契約。この方法は、優れた実験的なアクセスを提供しますが、完全な肺8の条件と比較した場合、開胸条件と吸引ウィンドウがアーティファクトを紹介する。また、ほとんど無傷胸郭を残す非開胸手順はそのような互いの血流動態上の心臓と肺の動きの相互影響としてそのまま胸腔内の元の状態を維持するの約束を負担する。これらのモデルは、典型的には、胸壁15、または組織9の乾燥を防止するために、肺表面と直接接触させる透明な膜に縫合されるウィンドウ枠を含む。収容顕微鏡イメージングを可能にするために心肺運動を交渉することの難しさは、主要な技術的な非開胸手順のチャレンジ、およびこの技術の低い全体的な普及のために、おそらく原因である。我々の場合、の組み合わせで固体窓保持枠とZ方向の拘束装置が十分に閉胸窓10に肺循環の自動化された血流の測定を可能にするために、肺の横方向の動きを排除するために有効であることが証明されている。
生体顕微鏡画像スタックからの血流速度を測定するための一般的な方法は、特定の血管セグメント14の連続する画像内の血流パターンの空間的なマッチングを使用することである。単一の血管の分析に関連する時間の労力を低減するために、血流画像化アルゴリズムが全体の光フィールド11の血流速マップを生成するように導入されている。時間の優位性に加えて、この方法も関わらず、血管の形態や分岐点の、全体の光学分野における血流の同時空間的な分析を可能にする。腫瘍微小環境は、複数の血管contriを検討する場合に特に重要であるビュート与えられた腫瘍領域13,16,17の供給状態に。実際に、腫瘍脈管構造の既知のねじれ及び大血管間のギャップの存在が明らかに研究されている両方の転移性癌のタイプ（ 図2A）に見ることができる。高血圧薬のエフェドリン：肺のウィンドウ法も最近肺循環における血流速度を増加させることが見出されている薬理学的治療の効果を測定することによって、転移性病変内の血流速度の変化を報告する能力について試験されているエンドセリン受容体ブロッカーのアンブリセンタン薬物を組み合わせて与えた場合、肺毛細血管における血流の増加速度で、その結果、プリ毛細血管細動脈の緊張を、減少させる一方で、心拍出量を増加させる。これらのデータは、他の場所で現在検討中であるが、高血圧薬の組み合わせの能力とエンドセリン受容体アンタゴニストは、末梢筋肉を増加させる灌流は独立して18を出版されました。通常の条件下では、血流速度の用量依存性の増加が両方の注射後に観察することができるが、第二射出肉腫転移における流速のさらなる増加にはつながらないという事実は、事実から生じる可能性のある最大の腫瘍血管の血管拡張すでにエフェドリンとアンブリセンタンの第1の合成注射後に達しました。
次のような制限は、ここで提示された技術に適用されます。このプロトコルは、約180〜300グラム以上からラット（と理論的には、同様のサイズの哺乳類）にも適用可能である。マウスのような小型の哺乳類は胸郭のより脆弱な解剖学と生理学に対応するために特別な修正が必要になります。提示された技術を用いて達成することができる最大の空間分解能は、理論的にのみ目的と〜0（使用されるカバースライドの厚さの開口数によって制限される。標準のブランドで08から0.1μm）で、油浸の使用と100Xの目的、に。しかし実際には、肺の残りの動きは、20Xを超えて高解像度の目的の使用を制限する場合があります。肺のすべての自律移動が排除されている場合、技術の時間分解能しか毎秒約100フレームに、カメラのフレームレート、露光時間を決定し、蛍光標識のシグナル強度によって制限される。次の追加制限事項が提示された技術に適用されます。一方で、現在の微視的および計算設定は、与えられた転移の表面の唯一の分析を可能にする。高度な共焦点顕微鏡イメージング戦略として深度貫通顕微鏡の使用は、将来的に3次元的に血流速度の測定を可能にすることができる。また、提示された技術は、現在の形で、肺実質のさらに内側の病変を可視化するために使用することができない。第三に、GLAの挿入アクティブな血管と直接接触ssのウィンドウは、血管の空間的な圧縮を介して、または局所領域の温度に影響を与えることによって、自身が微小血管の流れを撹乱するためのいくつかの可能性がある。第四に、肺における外部換気装置及び正圧の使用はまた、肺微小循環血流を変化させる可能性がある。また、胸郭の限られた領域が記載され、比較的複雑での外科的処置のために実用的にアクセス可能である。そのような内側 - 腹側または背側のアクセスなど肺表面の他の領域は、胸郭の生体力学の深遠な摂動と一緒に、より精巧な外科技術を、必要とするであろう。なぜなら微小循環血流を研究するためのイメージング顕微鏡法に代わるの不足の主要な開発は、これらの障害を克服し、げっ歯類の肺のすべての部分に高い時間、空間分解能での悪性疾患を研究するために、近い将来に期待することができる。
要約すると、本方法は、プリアンプであるパターン、およびラット肺表面の転移において、微小血管の血流速度の変化を測定するために取得済み。全体顕微鏡光学視野内の血流速度を測定する自動化された方法で、急性非開胸外科モデルを組み合わせることで、この技術は、肺の生理学的環境の相対的な保全を提供し、全体的な微小循環血流速度および方向の変化を検出することが可能である、および使用が比較的容易である。なお、この技術は、げっ歯類モデルにおいて、この疾患設定において肺転移および他の動的プロセスの微小循環を研究するすべてのグループに非常に有用であることが期待できる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
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