Abstract
端粒酶，核糖核蛋白，是负责维持端粒的长度，从而推动基因组的完整性，细胞增殖和寿命。此外，端粒酶免受氧化应激线粒体和赋予抗细胞凋亡，表明如神经元非有丝分裂的，高活性的细胞的尚存其可能的重要性。我们以前表明的新颖端粒酶的活化剂，以增加端粒酶活性和表达在各种小鼠的大脑区域，并保护运动神经元细胞免受氧化应激的能力。这些结果加强了端粒酶是参与神经元的各种病变的保护的概念。强调端粒酶在脑的作用，我们在这里比较端粒酶在雄性和雌性小鼠大脑的活性和其对年龄依赖性。 TRAP法是在各种组织或细胞系中检测端粒酶活性的标准方法。在这里，我们展示了analy端粒酶活性在小鼠大脑的三个区域的sis通过非变性使用CHAPS蛋白提取裂解缓冲后跟标准TRAP法的变形例。
在这两步法，内源性端粒酶拉长特定端粒酶衬底（TS引物）加入TTAGGG 6 bp的重复序列（端粒酶反应）。端粒酶反应产物进行PCR反应创造了6个基点为单位的DNA阶梯放大。的DNA梯状条带的分析是由4.5％的高分辨率琼脂糖凝胶电泳，然后用高灵敏度的核酸染色剂染色制成。
相比于使用32 p标记的放射性的dCTP的用于DNA检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳对解决该DNA梯的传统TRAP法，该协议提供了一种无毒的时间节省TRAP法评价端粒酶活性在小鼠脑，展示出的能力检测端粒酶的差异E活动中的各种女性，雄性小鼠的大脑区域。
Introduction
端粒酶是一种端粒酶的组成核糖核蛋白逆转录酶（TERT），端粒酶催化亚基和RNA组分（TERC）。端粒酶的规范作用是通过将重复序列（TTAGGG）的端粒末端，因此促进基因组的完整性，以及细胞的增殖1保持端粒的适当长度。其他角色归因于TERT在细胞中， 即它赋予对诱导细胞凋亡的各种损伤剂2，保护免受氧化应激3人间充质干细胞，并通过其关联到TIA1阳性RNA起着完全分化的神经元的促存活作用颗粒4。
TERT表达和活性，主要在体分裂的细胞，并在大多数类型的癌症，而酶的表达和活性水平在非分裂细胞5,6紧密调节。有研究显示，在第rodent脑，端粒酶活性检测不到就由出生后10天，而TERT mRNA的维持在较低水平到成年7。其他研究表明成年子脑室区，嗅球，海马内端粒酶活性，并且在成人小脑和皮层8。我们最近证明了增加在大脑和脊髓中端粒酶的表达和活性的新化合物作用于N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）的神经保护作用 - 注射的小鼠，延迟的肌萎缩性侧索硬化病的SOD1转基因的发作和进展小鼠和增加运动神经元的存活在这些小鼠9的脊髓。要充分了解端粒酶在神经元和大脑中的促存活作用，有必要开发一种简单和相对敏感的快速测定端粒酶活性在脑的各个区域的检测。
端粒ŘEPEAT扩增法（TRAP）是一个众所周知的敏感测定法结合端粒酶的典型活性和聚合酶链式反应（PCR）。在该试验中，端粒酶添加TTAGGG重复到端粒酶衬底（TS引物）的寡核苷酸，然后通过PCR扩增，产生6个碱基对（bp）的使用TS的反向引物的DNA梯- ACX 32 p标记的dCTP的被用于检测的PCR产物的量低。的DNA梯状条带是由测序聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）解决。两个DNA带的强度和DNA片段化的长度反映活性酶分子的数量和它们的持续合成能力分别为10。
这种传统的检测容纳了一些重大的困难：暴露于放射性物质，大和难以处理的测序PAGE和凝胶运行的时间消耗和放射性产物的膜曝光（过夜在这两种情况下）的危险。 该协议提供了一种改进的无放射性的琼脂糖微凝胶基础的检测。该DNA 6 bp梯度是使用4.5％的高分辨率琼脂糖凝胶上分辨并使用该检测，实现高灵敏度的核酸染色。使用高分辨率的琼脂糖微凝胶和敏感核酸染色的组合提供了易于处理法，可以消除暴露于放射性的危险和显著缩短为3天总测定时间至几小时。
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Protocol
动物实验批准了在本·古里安大学（IL-39-08-2010）动物实验伦理委员会。
1，鼠脑蛋白提取
- 制备各含在冰上5毫升林格氏溶液和地方管15×3管中。
- 用异氟醚麻醉牺牲鼠标（注意 - 使用化学罩）10-20秒后颈椎脱位和即时斩首。
- 从头骨取出脑和漂洗数秒用冰冷的林格氏溶液，以防止损坏的脑组织。
- 使用手术刀片，从额皮层分离的小脑（CR）和脑干（BS）。接着，分离脑干，小脑和切断来自额叶皮层的额叶（FL）;除去来自额叶嗅球。将3个脑区中的指定15ml试管。
- 均质化中的每个管中的组织。添加FRESH冰冷的林格氏液使每管含有相同的体积和离心800×g的7分钟。
- 除去上清液，加入100μl的CHAPS裂解液，每管。拌匀，通过1毫升注射器用21G针头使溶液多次（〜10），并在冰上孵育30分钟。
- 以13,000×g的各管的内容物转移到一个新的微量离心管中，离心分离30分钟。将上清转移到一个新的微型离心管中，并确定使用先前建立的方法的蛋白浓度。存储所述蛋白质提取物中的10微升等分试样在-80℃下。
仪器仪表，反应液和蛋白质计算稀释2 TRAP法准备
- 制备标记的微离心管中的蛋白质提取物的稀释和端粒酶的反应缓冲液的适当的数。执行所有的移液使用过滤嘴，以防止污染的协议。 解冻的冰以下解决方案：陷阱反应混合物10倍，TS引物，dNTP的年代，超纯水和蛋白提取物（见表格材料，试剂和试剂浓度）。
- 稀释的蛋白提取物的溶液来使用超纯水（UPW）1微克/微升的最终浓度。
3，端粒酶反应
- 准备端粒酶反应混合物中加入以下为微型离心管：2微升陷阱组合（10X），1微升的TS引物（0.1微克），1微升的dNTP（10毫米）和15μL超纯水。对于多个样品，通过样品中，加1的数乘以上述卷。
- 加入19微升反应混合物中的每个反应管中，加入1微升稀释蛋白提取物（1微克蛋白）向每管中以20微升的最终体积。
- 将反应管在30℃下预热的水浴中放置45分钟。
4，PCR反应
- 十五英里n中的端粒酶反应结束前，解冻了以下解决方案：ACX底漆，钛Taq缓冲液，超纯水。
- 2.5微升钛Taq缓冲液（10X），1微升ACX底漆（0.1微克），2μL超纯水（1微升时，IC的使用）和0.5微升钛Taq酶：通过添加以下到微量离心管中准备PCR反应混合物（50X）。对于多个样品，通过样品加2的数量乘以上述卷。
- 加入6微升的PCR混合到每个PCR管中，添加了端粒酶反应（20微升），每管的整个体积为26微升的最终体积。
- 将PCR管到的PCR热循环仪，并运行以下程序：
- 90℃ - 2分钟。
- 94°C - 30秒*
- 60°C - 30秒*
- 72°C - 45秒
- 72℃ - 2分钟。
商店的PCR产物于-20℃。
* = 34次
5，琼脂糖迷你GEL的制备，样品运行和凝胶染色
- 加25毫升冷冻电泳缓冲液（TBE）和搅拌棒的烧杯中是这样的缓冲溶液的2-4倍的体积和在1.125克的高分辨率（HR）琼脂糖粉末缓慢洒而将溶液快速搅拌。取出搅拌棒，盖上保鲜膜，皮尔斯在一个小孔用于通风的烧杯中。热火在“低”电3分钟微波的烧杯中，然后切换到“高级”电力，热力的短脉冲，注意不要造成溢出的解决方案。请注意，当通过加热产生的泡沫变大，气泡和消失，几秒钟后，将琼脂糖已准备就绪。
- 投凝胶到水平微型凝胶装置中，凝胶固化后在室温下使凝胶在4℃下在使用前放松20分钟。
- 加载每个车道25微升样品陷阱（20微升的TRAP PCR产物5μL6X凝胶样染料）和运行在110 V 3小时，在4℃冷室。
- 加入15微升10000核酸染色，原液至50ml双蒸水（DDW）用0.1 M氯化钠（0.29克）准备核酸染色3倍的工作方案。染色凝胶20分钟，轻轻摇动。
- 使用紫外透射与302 nm的波长，以查看陷阱阶梯DNA条带。
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Representative Results
全细胞蛋白质提取物来自额叶（佛罗里达州），脑干（BS）和小脑（CR）的制备，来自于3的CD-1雌性和3的CD-1雄性小鼠以1和3个月大的年龄为改性TRAP法和3的CD-1雄性小鼠以2个月大的放射性TRAP法的年龄。端粒酶活性在1微克的蛋白质提取物检测采用改良TRAP法和2微克的蛋白质中提取的放射性TRAP法。由放射性TRAP法和由改性TRAP法检测端粒酶活性表明，端粒酶的DNA产物的更好的可视化和分辨率被观察到的改性试验所看到的DNA梯状条带（ 图1A 与 1C的长度和强度和1D）。逐渐减少的端粒酶DNA产物减少蛋白提取物，从胶质母细胞瘤U-251细胞系衍生的浓度时观察到，使用sugge在较低的蛋白质浓度刺痛改性TRAP分析方法端粒酶活性的检测灵敏度提取物（ 图1B）。
甲显著更高的端粒酶活性被认为是在比CR的FL和BS的区域中3个月大女性和男性所揭示的DNA条带的强度和的DNA产物梯子的长度。另外，它表明，在小鼠过渡到成年端粒酶活性的增加在FL中，并减少在BS和CR（ 图1D）。两性之间的比较表明，在佛罗里达州的端粒酶活性是女性相对于BS和CR表示男性高端粒酶活性更高。
在组织中的表达端粒酶活性水平较低，我们已经发现，使用PCR的DNA梯状条带的检测是不使用内部对照（IC）的引物更有效，因为在IC利用将nS作为正向引物从而干扰了DNA梯状放大。数据的重现性是通过重复各实验几次来实现。
图1端粒酶活性在小鼠大脑：传统与改良TRAP法。 a）在3大脑区域端粒酶活性的放射性TRAP法（2个月大的CD-1雄性小鼠，2微克蛋白提取物）。 二）改良TRAP法的灵敏度表示通过降低蛋白质的浓度进行分析提取胶质母细胞瘤衍生ü -251细胞系C，D）中的1（C）和3（D）月龄的CD-1雌性和雄性小鼠3的大脑区域中端粒酶活性的 DNA梯状条带开始于50个bp的条带，6碱基对的增量。 （NC - 阴性对照，IC - 内部控制，BS - 脑干，CR - 小脑佛罗里达州 - 额叶）。
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Discussion
在通过TRAP法对小鼠脑细胞端粒酶活性的分析包括4个主要步骤：1）蛋白质从脑组织2）特定地区开采端粒酶TS引物延伸 - 端粒酶反应3）的端粒酶反应产物PCR扩增4 ）的分离使用高分辨率琼脂糖凝胶对PCR产物。
这种改良TRAP法解决了上升，从传统的检测两大困难：使用放射性的dCTP的灵敏检测PCR产物和PAGE分离的DNA梯状的。高分辨率琼脂糖凝胶简化了端粒酶的反应产物的检测（将DNA梯）相比，难以处理测序PAGE。此外，该核酸染色是用所需的小量DNA的检测灵敏度高，无毒的溶液。
应特别注意考虑以下关键步骤：1）保持组织去除和均质化之间的时间最小化，以保持蛋白完整性2）CHAPS，应避免裂解缓冲液再冻结3）的蛋白提取物应保持在等分并在使用前解冻一次。不要再冷冻样品。
期间，由于高浓度的琼脂糖凝胶，凝胶制备步骤可能发生的问题是容易产生溢出，并要求在烹饪过程中密切关注。该技术拥有几个局限性，在冷室中运行的凝胶的必要性。此外，PCR产物的量很低，不能在紫外线表查看。
端粒酶活性水平而变化的不同组织中，被认为是低的在脑中。该协议提供了一个更敏感的检测方法，比较传统的放射性检测能够更好的检测端粒酶活性的大脑。虽然不同的时间，有效的方法是可用的（一步TRAP检测试剂盒，使用labeleðTS引物进行检测），这些方法都显著更昂贵。此外，使用琼脂糖消除使用聚丙烯酰胺凝胶的毒性危害。
所揭示的代表性结果，通过使用上述方法，有可能表现出大脑的不同区域之间的男性和女性之间的差异中的端粒酶活性水平。此方法可用于端粒酶活性与低端粒酶活性的其它正常组织中检测。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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