Abstract
Telomerase, ribonucleoprotein, הוא אחראי לשמירה על אורך הטלומרים ולכן קידום יושרה, התפשטות, ותוחלת חיים הגנומי. בנוסף, telomerase מגן על המיטוכונדריה מלחץ חמצוני ומעניק התנגדות לאפופטוזיס, המצביע על החשיבות האפשרית שלו שלשרד של אי mitotic, תאים מאוד פעילים כגון תאי עצב. אנחנו הוכיחו בעבר את היכולת של מפעילי telomerase רומן להגביר את פעילות telomerase וביטוי באזורים במוח העכבר השונים ולהגן על תאי הנוירונים מוטוריים מלחץ חמצוני. תוצאות אלו מחזקות את הרעיון שtelomerase מעורב בהגנה על תאי עצב מנגעים שונים. כדי להדגיש את תפקידו של telomerase במוח, אנחנו כאן להשוות את הפעילות של telomerase במוח עכבר זכר ונקבה ואת תלותה בגיל. assay TRAP הוא שיטה סטנדרטית לאיתור פעילות telomerase ברקמות שונות או שורות תאים. כאן אנו מדגימים את analyאחות של פעילות telomerase בשלושה אזורים במוח העכבר על ידי שאינו denaturing הפקת חלבון באמצעות בחורים תמוגה חיץ ואחריו שינוי של assay TRAP הסטנדרטי.
ב assay 2-שלב זה, telomerase אנדוגני מתארך מצע ספציפי telomerase (פריימר TS) על ידי הוספת TTAGGG 6 חזרות נ"ב (תגובת telomerase). תוצרי תגובת telomerase הם מוגברים על ידי תגובת PCR יצירת סולם DNA של 6 תוספות נ"ב. הניתוח של סולם DNA נעשה על ידי 4.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose ברזולוציה גבוהה ואחרי צביעה עם כתם חומצת גרעין רגיש מאוד.
בהשוואה לassay TRAP המסורתי שעושה שימוש ב32 P כותרת dCTP של רדיואקטיביים לגילוי DNA וג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide לפתרון סולם DNA, פרוטוקול זה מציע זמן שאינו רעיל חיסכון assay מלכודת להערכת פעילות telomerase במוח העכבר, הממחיש את היכולת לזהות הבדלים בtelomerasפעילות דואר באזור במוח עכבר הנשי וגברי השונים.
Introduction
Telomerase הוא ribonucleoprotein המורכבת מtelomerase ההפוך transcriptase (טרט), למקטע הקטליטית של telomerase, ומרכיב RNA (TERC). התפקיד הקנוני של telomerase הוא לשמר את האורך הנכון של הטלומרים על ידי הוספת רצפים חוזרים (TTAGGG) לקצות telomeric, לכן קידום יושרת גנומי, ותא התפשטות 1. תפקידים נוספים יוחסו לטרט בתאים, כלומר היא מעניקה התנגדות לאפופטוזיס הנגרם על ידי סוכן מזיק שונים 2, מגן על תאי גזע mesenchymal אדם מלחץ חמצוני 3, ומשחק תפקיד הפרו הישרדות בתאי עצב מובחן באופן מלא על ידי הקשר שלה לTIA1 RNA החיובי גרגרים 4.
טרט מתבטא ופועל בעיקר בתאים סומטיים החלוקה וברוב סוגי הסרטן, ואילו רמות ביטוי אנזים והפעילות מוסדרות בחוזקה בתאי החלוקה הלא 5,6. מחקרים הראו כי בrמוח אודנט, פעילות telomerase הופך בלתי ניתנת לגילוי על ידי לאחר לידה יום 10, בעוד טרט mRNA נשמר ברמות נמוכות יותר בבגרותם 7. מחקרים אחרים הראו פעילות telomerase בתוך האזור הבוגר תת חדרית, הנורה חוש הריח, ההיפוקמפוס, ובמוח הקטן המבוגר והקליפה 8. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי תרכובות רומן המגבירות ביטוי telomerase ופעילות במייתרי המוח ועמוד השדרה הפעילו השפעות נוירו בN-מתיל-D-aspartate (NMDA) - עכברים שהוזרקו, עכבו את תחילתו ואת התקדמות המחלה הטרשת לרוחב amyotrophic במהונדס SOD1 עכברים והגדילו את ההישרדות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה של עכברים אלה 9. כדי להבין את התפקיד הפרו הישרדות של telomerase בתאי עצב ובמוח באופן מלא, זה חיוני כדי לפתח assay מהיר פשוט ויחסית רגיש לזיהוי של פעילות telomerase באזורים השונים של המוח.
R telomericפרוטוקול ההגברה EPEAT (TRAP) הוא assay רגיש ידוע שילוב הפעילות הקנוני של telomerase ותגובת השרשרת של פולימראז (PCR). ב assay זה, telomerase מוסיף TTAGGG חוזר למצע telomerase (פריימר TS) oligonucleotide, ואחריו ההגברה PCR אשר מייצרת 6 זוגות בסיס סולם DNA (נ"ב) באמצעות TS פריימר ההפוכה -. ACX 32 P כותרת dCTP של המשמשים לאיתור כמות נמוכה של מוצרי PCR. סולם DNA נפתר על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide רצף (עמוד). שתי עוצמת להקות DNA ואורכו של סולם DNA משקפים הסכום של מולקולות אנזים פעילים וprocessivity בהתאמה 10.
assay המסורתי זה מחזיק כמה קשיים עיקריים: הסכנה של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים, גדולים וקשים להתמודד עמוד רצף והצריכה של ריצת ג'ל הזמן וחשיפת סרט של מוצר רדיואקטיבי (לילה בשני המקרים). פרוטוקול זה מציע assay משופר אינו רדיואקטיביים agarose מיני ג'ל המבוסס. הסולם נ"ב DNA 6 נפתר באמצעות 4.5% agarose ג'ל ברזולוציה גבוהה והאיתור מושגת באמצעות כתם חומצת גרעין רגיש מאוד. השילוב של שימוש ברזולוציה גבוהה agarose מיני ג'ל וכתם חומצת גרעין רגיש מציע קל לטפל assay, מבטל את הסכנה של חשיפה לקרינה רדיואקטיבית ולקצר באופן משמעותי את משך זמן assay הכולל מ3 ימים לכמה שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת בן גוריון (IL-39-08-2010).
הפקת חלבון .1 עכבר מוח
- הכן 3 צינורות של 15 מ"ל כל אחת מכיל 5 מ"ל צינורות הפתרון ומקום של רינגר על קרח.
- להקריב את העכבר באמצעות ההרדמה Isoflurane (זהירות - להשתמש במנדף כימי) ל10-20 שניות אחריו נקע בצוואר הרחם ועריפת ראש מיידי.
- הסר את המוח מהגולגולת ולשטוף במשך כמה שניות עם הפתרון של קרח קר הצלצול כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
- באמצעות סכין כירורגית, להפריד את המוח הקטן (CR) וגזע המוח (BS) מקליפת המוח הקדמית. בשלב הבא, להפריד את המוח הקטן מגזע המוח ולחתוך את האונה הקדמית (FL) מקליפת המוח הקדמית; להסיר את הנורה חוש הריח מהאונה הקדמית. הנח את האזורים במוח 3 ב15 מ"ל הצינורות המיועדים.
- Homogenize הרקמות בצינור אחד. הוספת frפתרון קרח אש הצלצול של קר ולכן כל צינור מכיל את אותו נפח ו צנטריפוגות במשך 7 דקות ב800 x גרם.
- הסר את supernatant ולהוסיף של חיץ תמוגה בחורים 100 μl על צינור אחד. מערבבים היטב, על ידי העברה כמה פעמים הפתרון (~ 10) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט G 21, ולדגור על קרח למשך 30 דקות.
- העבר את התוכן של כל צינור לצינור מיקרו צנטריפוגות חדש ו צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 13,000 x גרם. העבר את supernatant לצינור מיקרו צנטריפוגות חדש ולקבוע את ריכוז החלבון בשיטה הוקמה בעבר. אחסן את תמציות החלבון בaliquots של 10 μl ב -80 מעלות צלזיוס.
.2 TRAP Assay הכנת מכשירים, פתרונות תגובה, וחישובי דילול חלבון
- הכן מספר המתאים של צינורות מיקרו צנטריפוגות שכותרתו עבור דילולים תמצית חלבון וחיץ תגובת telomerase. לבצע את כל pipetting בפרוטוקול באמצעות טיפים מסנן למניעת זיהום. להפשיר את הפתרונות על הקרח הבא: תערובת TRAP תגובת 10x, פריימר TS, dNTP של, תמציות UPW וחלבון (ראה טבלה של חומרים לריכוזי חומרים כימיים וחומרים כימיים).
- לדלל את הפתרון של תמצית החלבון לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl באמצעות מים טהורים לחלוטין (UPW).
.3 תגובת הטלומרז
- הכן תערובת תגובת telomerase ידי הוספה הבאה לצינור מיקרו צנטריפוגות: לערבב 2 μl TRAP (10x), פריימר μl 1 TS (0.1 מיקרוגרם), dNTPs 1 μl (10 מ"מ) ו15 UPW μl. לדוגמאות רבות, להכפיל כמויות הנ"ל במספר דוגמאות, בתוספת 1.
- הוספת 19 μl של תערובת התגובה לצינור כל תגובה ולהוסיף 1 μl של התמצית מדוללת חלבון (1 מיקרוגרם חלבונים) על צינור אחד עבור נפח סופי של μl 20.
- מניחים את צינורות התגובה באמבט מים מחוממים מראש 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
.4 תגובת PCR
- חמש עשרה מילn לפני סוף תגובת telomerase, להפשיר הפתרונות הבאים: פריימר ACX, טיטניום תקי הצפת, UPW.
- הכן תערובת תגובת PCR על ידי הוספה הבאה לצינור מיקרו צנטריפוגות: 2.5 μl טיטניום תקי חוצץ (10x), פריימר 1 μl ACX (0.1 מיקרוגרם), 2 μl UPW (μl 1 כאשר IC משמש) ו0.5 μl טיטניום תקי פולימראז (50x). לדוגמאות רבות, להכפיל כמויות הנ"ל במספר דוגמאות בתוספת 2.
- להוסיף 6 μl של PCR לערבב על צינור אחד PCR ולהוסיף כל הנפח של תגובת telomerase (20 μl) לצינור אחד עבור נפח סופי של μl 26.
- הכנס את צינורות PCR לCycler תרמו PCR ולהפעיל את התכנית הבאה:
- 90 ° C - 2 דקות.
- 94 ° C -. שניות 30 *
- 60 ° C -. שניות 30 *
- 72 ° C -. שניות 45 *
- 72 ° C - 2 דקות.
מוצרי PCR חנות ב -20 C °.
* = 34 מחזורים
.5 Agarose Mini-GEהכנת ליטר, דוגמאות ריצה, וג'ל הכתמה
- הוסף 25 מ"ל חיץ אלקטרופורזה המצונן (TBE) ובר ומערבב לכוס שהיא 2-4 פעמים הנפח של פתרון החיץ ומפזרים באיטיות ב1.125 גרם של הרזולוציה הגבוהה אבקת agarose (HR) ואילו הפתרון הוא עורר במהירות . הסר את בר והמערבב, מכסה את הכוס עם ניילון נצמד ופירס בחור קטן לאוורור. מחממים את הכוס במיקרוגל בעצמה "נמוכה" במשך 3 דקות ולאחר מכן לעבור לשלטון "גבוה" ולחמם את הפתרון בפולסים קצרים עם טיפול שלא לגרום לשפיכה. שים לב שכאשר הקצף שנוצר על ידי חימום הופך בועות גדולות ונעלם אחרי כמה שניות, agarose מוכן.
- עופרת ג'ל למנגנון מיני ג'ל אופקי, לאחר ג'ל מתמצק בטמפרטורת חדר מאפשר את הג'ל לצנן ל20 דקות ב 4 ° C לפני השימוש.
- לטעון כל מסלול עם 25 μl של מדגם TRAP (מוצרי PCR TRAP 20 μl ו5 צבע ג'ל טעינת μl 6x) ולרוץ ב110 V עבור 3 שעות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס.
- הכן 3x כתם חומצת גרעין עובד פתרון על ידי הוספת 15 μl 10,000x כתם גרעין חומצה, פתרון מניות 50 מ"ל זוגי מים מזוקקים (DDW) עם 0.1 M NaCl (0.29 ז). כתם ג'ל ל20 דקות עם רעד עדין.
- השתמש transilluminator UV עם 302 אורך גל כדי לראות את להקות DNA סולם TRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמציות חלבון תא כל הוכנו מהאונה הקדמית (FL), גזע המוח (BS) ומוח קטן (CR), הנגזרים מ3 CD-1 עכברי זכרי CD-1 נשים ו -3 בגילים ישנים 1 ו -3 חודשים ל assay הותאם TRAP ו3 עכברי זכרים CD-1 בגיל 2 חודשים ישנים עבור assay TRAP רדיואקטיבי. פעילות telomerase זוהתה ב1 מיקרוגרם חלבונים לחלץ באמצעות assay TRAP שונה ו2 מיקרוגרם חלבונים לחלץ עבור assay TRAP רדיואקטיבי. איתור של פעילות הטלומרז ידי assay TRAP רדיואקטיביים ועל ידי assay TRAP שונה מראה כי להדמיה טובה יותר ורזולוציה של מוצרי DNA telomerase הוא ציין עם assay שונה כפי שניתן לראות לפי האורך והאינטנסיביות של סולם DNA (איור 1 א נ 1 ג ו1D). הפחתה הדרגתית של מוצרי DNA telomerase הוא ציין כאשר יורד ריכוז של תמציות חלבון, הנגזרות משורת תאי גליובלסטומה U-251, שימשה Suggeעוקץ את הרגישות של שיטת assay TRAP הותאם לצורך זיהוי של פעילות telomerase בריכוזים נמוכים יותר של חלבונים לחלץ (איור 1).
פעילות telomerase גבוהה באופן משמעותי נראית באזורי פלורידה וBS לעומת CR בנקבות בת 3 חודשים וגברים כפי שנחשפה על ידי העצמה של להקות DNA ואורכו של סולם מוצרי DNA. בנוסף, הוא הראה כי במהלך מעבר העכבר לעליית פעילות telomerase הבגרות בפלורידה והירידות בBS וCR (1D איור). השוואה בין המינים מוכיחה כי בפעילות telomerase FL הוא גבוה יותר בנשים בניגוד לBS וCR מראים פעילות telomerase גבוהה יותר אצל גברים.
ברקמות המבטאות רמות נמוכות של פעילות הטלומרז מצאנו כי זיהוי של סולם DNA באמצעות PCR הוא יעיל יותר מבלי להשתמש בבקרה הפנימית פריימר (IC), מאז IC מנצל TS כפריימר קדימה ובכך מפריע להגברת סולם DNA. שחזור של נתונים מושגת על ידי חזרה על כל ניסוי מספר פעמים.
פעילות איור 1 הטלומרז במוח העכבר: מסורתית לעומת assay TRAP שונה. ) פעילות הטלומרז ב3 אזורים במוח נותחה על ידי assay TRAP רדיואקטיבי (-1 CD עכברים ישנים 2 חודשי זכר, 2 מיקרוגרם חלבונים לחלץ). רגישות של assay TRAP שונה מוצגת על ידי הפחתת ריכוזים של החלבונים ב ') לחלץ נגזרת מגליובלסטומה U -251 תא שורה. פעילות הטלומרז ב3 אזורים במוח של 1 (ג) ו -3 (ד) חודשים נקבה CD-1 ישנה ועכברים זכרי C, D). סולם DNA מתחיל בלהקת 50 נ"ב עם 6 תוספות נ"ב. (NC - ביקורת שלילית, IC- שליטה, BS הפנימי - גזע המוח, CR - המוח הקטן, FL - אונה קדמית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח של פעילות telomerase במוח העכבר באמצעות assay TRAP מורכב מ -4 שלבים עיקריים: 1) חלבוני חילוץ מאזורים ספציפיים של רקמת המוח 2) TS התארכות פריימר על ידי telomerase - תגובת telomerase 3) הגברה של תוצרי תגובת telomerase על ידי 4 PCR הפרדה) של מוצרי PCR באמצעות ג'ל agarose ברזולוציה גבוהה.
assay TRAP שונה זה מטפל בשני קשיים עיקריים העולים מassay המסורתי: השימוש בdCTP של רדיואקטיביים לגילוי רגיש של הפרדת מוצרים ועמוד PCR של סולם DNA. ג'ל agarose רזולוציה גבוה מפשט את זיהוי של תוצרי תגובת telomerase (סולם DNA) בהשוואה לקשה להתמודד עמוד רצף. בנוסף, צביעת חומצות הגרעין היא פתרון שאינו רעיל עם רגישות גבוהה הנדרשת לזיהוי של כמות הקטנה של DNA.
תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לשלבים הקריטיים הבאים: 1) שמירת הזמן בין ההסרה ולתפעול רקמה עד למינימום כדי לשמור על שלמות חלבון 2) בחורים יש להימנע refreezing מאגר תמוגה צריכה להישמר 3 תמציות חלבון) בaliquots ומופשרים פעם לפני השימוש. הימנע refreezing של דגימות.
בעיות עלולות להתרחש במהלך שלב הכנת ג'ל מאז agarose ג'ל ריכוז הגבוה נוטה גלישה ודורש תשומת לב רבה במהלך בישול. הטכניקה מחזיקה במספר מגבלות עם ההכרח של ריצת ג'ל בחדר קר. בנוסף, הכמות הנמוכה של מוצרי PCR לא ניתן לראות על שולחן UV.
רמת פעילות telomerase משתנה בין רקמות שונות ונחשבת לנמוך במוח. פרוטוקול זה מציע שיטת זיהוי רגישה יותר, בהשוואה לassay רדיואקטיבי המסורתי המאפשר זיהוי טוב יותר של פעילות telomerase במוח. למרות ששיטות זמן יעיל שונות (ערכות זמינות צעד אחד assay TRAP, באמצעות labeleד TS פריימר לגילוי) שיטות אלה באופן משמעותי יותר יקר. יתר על כן, השימוש בagarose מבטל את המפגע הרעיל של שימוש בג'ל polyacrylamide.
כפי שנחשף מתוצאות הנציג, על ידי שימוש בשיטה שתוארה לעיל, ניתן להדגים את ההבדלים ברמות פעילות telomerase בין האזורים השונים במוח ובין הזכר לנקבה. שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי של פעילות telomerase ברקמות נורמליות אחרות עם פעילות telomerase נמוכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
