Abstract
A telomerase, uma ribonucleoprotein, é responsável por manter o comprimento dos telômeros e, portanto, promover a integridade genômica, proliferação e longevidade. Além disso, a telomerase protege a mitocôndria do estresse oxidativo e confere resistência à apoptose, sugerindo sua possível importância para a sobrevivência dos não-mitótico, células altamente ativos, tais como os neurônios. Nós já demonstraram a capacidade dos novos ativadores de telomerase para aumentar a atividade da telomerase e expressão nas diferentes regiões do cérebro do rato e para proteger as células neurônios motores do stress oxidativo. Estes resultados vêm reforçar a noção de que a telomerase está envolvida na protecção dos neurónios de várias lesões. Para sublinhar o papel da telomerase no cérebro, nós aqui comparar a atividade da telomerase em masculino e feminino cérebro do rato e sua dependência da idade. Ensaio TRAP é um método padrão para a detecção de actividade da telomerase em várias linhas celulares ou tecidos. Aqui demonstramos a Analysis da actividade da telomerase em três regiões do cérebro do rato por não-desnaturante CHAPS extracção de proteína utilizando um tampão de lise seguido por uma modificação do ensaio TRAP padrão.
Neste ensaio, em 2 passos, a telomerase endógeno alonga um substrato da telomerase específico (TS iniciador) adicionando TTAGGG 6 repetições bp (reacção da telomerase). Os produtos de reacção da telomerase são amplificados por meio de reacção de PCR a criação de uma escada de DNA de incrementos de 6 bp. A análise do segmento de ADN é feita por electroforese em gel de agarose de alta resolução de 4,5%, seguido por coloração com mancha de ácido nucleico altamente sensível.
Em comparação com o ensaio TRAP tradicionais que utilizam 32 marcado com P radioactivo de dCTP do para a detecção do ADN e de electroforese em gel de poliacrilamida para resolver a escada de DNA, este protocolo oferece um tempo de não-tóxico poupança ensaio TRAP para a avaliação da actividade de telomerase no cérebro do rato, o que demonstra a capacidade de detectar diferenças na telomerasatividade e nos diversos região do mouse cérebro feminino e masculino.
Introduction
A telomerase é uma ribonucleoproteína composto por transcriptase inversa da telomerase (TERT), a subunidade catalítica de telomerase e um componente de RNA (TERC). O papel canônica da telomerase é preservar o comprimento adequado dos telômeros pela adição de sequências repetitivas (TTAGGG) para as extremidades teloméricas, portanto, promover a integridade genômica e proliferação celular 1. Papéis adicionais foram atribuídos a TERT em células, ou seja, que confere resistência à apoptose induzida por vários agentes prejudiciais 2, protege as células estaminais mesenquimais humanas a partir de estresse oxidativo 3, e desempenha um papel pró-sobrevivência em neurónios completamente diferenciados pela sua associação com o ARN positivo TIA1 grânulos 4.
TERT é expresso e activo, principalmente em células somáticas de se dividir e, na maioria dos tipos de cancro, enquanto que os níveis de expressão e de actividade da enzima estão fortemente regulada em células que não se dividem 5,6. Estudos têm demonstrado que, na rcérebro Odent, a atividade da telomerase torna-se indetectável por dia pós-natal 10, enquanto TERT mRNA é mantida em níveis mais baixos para a idade adulta 7. Outros estudos demonstraram a actividade da telomerase na zona sub-ventricular adulto, o bolbo olfactivo, o hipocampo e no cerebelo e córtex adulto 8. Recentemente, demonstrou que novos compostos que aumentam a expressão e a actividade de telomerase no cérebro e espinal cabos exerceu efeitos neuroprotectores em N-metil-D-aspartato (NMDA) - ratinhos injectados, atrasou o aparecimento e progressão da doença de esclerose lateral amiotrófica em SOD1 transgénico ratinhos e aumentou a sobrevivência de neurónios motores na espinal medula de ratinhos estas 9. Para compreender totalmente a função pró-sobrevivência de telomerase em neurónios e no cérebro, o que é essencial para desenvolver um ensaio simples e relativamente sensível rápido para a detecção da actividade da telomerase em várias regiões do cérebro.
O telomérica rprotocolo de amplificação epita (TRAP) é um ensaio de sensibilidade conhecida a combinação de actividade de telomerase e canónico a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Neste ensaio, a telomerase adiciona TTAGGG repete a um substrato de telomerase (TS iniciador) oligonucleótido, seguido de amplificação de PCR, que gera 6 pares de bases (pb) escada de DNA usando o TS inversa iniciador -. ACX 32 P dCTP marcado, são utilizados para detectar a pequena quantidade de produtos de PCR. A escada de ADN foi resolvido por electroforese em gel de sequenciação de poliacrilamida (PAGE). Tanto a intensidade das bandas de DNA e o comprimento da escada de ADN reflectem a quantidade de moléculas de enzimas activas e sua processabilidade, respectivamente, 10.
Este ensaio tradicional detém algumas das maiores dificuldades: O perigo de exposição a substâncias radioactivas, grandes e difíceis de lidar com o seqüenciamento eo consumo de tempo do gel de corrida e exposição do filme do produto radioativo (durante a noite, em ambos os casos). Este protocolo apresenta um ensaio de agarose não radioactivo melhorada mini-gel à base. O DNA 6 bp ladder é resolvido usando 4,5% de alta resolução em gel de agarose ea detecção é realizada com mancha de ácidos nucleicos altamente sensível. A combinação de alta resolução utilizando mini-gel de agarose e coloração de ácido nucleico sensível oferece fácil de manusear ensaio, elimina o risco de exposição à radioactividade e encurtar significativamente a duração total do ensaio de 3 dias a várias horas.
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Protocol
As experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação animal no Universidade Ben-Gurion (IL-39-08-2010).
1. rato Cérebro extração de proteínas
- Preparar 3 tubos de 15 ml cada, contendo 5 ml de solução e colocar tubos de Ringer no gelo.
- Sacrifique o mouse usando anestesia isoflurano (ATENÇÃO - usar capuz química) por 10-20 segundos, seguido por deslocamento cervical e decapitação imediata.
- Remover o cérebro do crânio e enxaguar durante alguns segundos com uma solução gelada de Ringer para evitar danos no tecido cerebral.
- Usando uma lâmina cirúrgica, separar o cerebelo (CR) e tronco cerebral (BS), a partir do córtex frontal. Em seguida, separar o cerebelo a partir do tronco cerebral e cortar o lobo frontal (FL) a partir do córtex frontal; remover o bolbo olfactivo do lobo frontal. Coloque as três regiões do cérebro nas designadas tubos de 15 ml.
- Homogeneizar o tecido em cada tubo. Adicionar fresh solução gelo frio de Ringer assim cada tubo contenha o mesmo volume e centrifuga-se durante 7 min a 800 x g.
- Remover o sobrenadante e adicionar 100 mL de tampão de lise de CHAPS a cada tubo. Misture bem, fazendo passar a solução várias vezes (~ 10) através de uma seringa de 1 ml com uma agulha G 21, e incubar em gelo durante 30 min.
- Transferir o conteúdo de cada tubo para um novo tubo de micro-centrífuga e centrifuga-se durante 30 min a 13.000 x g. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de micro-centrífuga e determinar a concentração de proteína utilizando um método previamente estabelecido. Guardar os extractos de proteína em alíquotas de 10 ul a -80 ° C.
2. TRAP Ensaio Preparação de Instrumentos, Soluções de reacção, e cálculos de diluição de proteína
- Prepare o número apropriado de tubos etiquetados de micro-centrifugação de diluições de extracto de proteína e tampão de reacção da telomerase. Execute todas pipetagem no protocolo usando pontas com filtro para evitar a contaminação. Descongele as seguintes soluções no gelo: TRAP mistura de reação 10x, TS primer, dNTP, extratos UPW e proteínas (ver tabela de materiais de reagentes e reagentes concentrações).
- Dilui-se a solução de extracto de proteína para uma concentração final de 1 ug / mL utilizando água ultra-pura (PFS).
3. telomerase Reaction
- Prepare mistura de reação telomerase, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: mix 2 l TRAP (10x), 1 ml TS primário (0,1 g), uma dNTPs ul (10 mm) e 15 mL UPW. Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras, mais 1.
- Adicionar 19 ul da mistura de reacção para cada tubo de reacção e adicionar 1 ul do extracto de proteína diluída (1 ug de proteínas) a cada tubo para um volume final de 20 ul.
- Colocar os tubos de ensaio num banho de água pré-aquecida a 30 ° C durante 45 min.
4. PCR Reação
- Quinze min antes do final da reação telomerase, descongelar as seguintes soluções: primers ACX, Titanium Taq buffer, UPW.
- Prepare mistura da PCR, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: 2.5 l Titanium Taq Buffer (10x) 1 ml ACX primário (0,1 g), 2 l UPW (1 ml quando IC é usado) e 0,5 mL Titanium Taq Polimerase (50x). Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras mais 2.
- Adicionar 6 ul de mistura de PCR, cada tubo de PCR e adicionar todo o volume da reacção da telomerase (20 ul) a cada tubo para um volume final de 26 ul.
- Inserir os tubos de PCR para um termociclador PCR e executar o seguinte programa:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 seg *
- 60 ° C - 30. Seg *
- 72 ° C - 45. Sec *
- 72 ° C - 2 min.
O armazenamento de produtos de PCR a -20 ° C.
* = 34 ciclos
5. Agarose Mini-gel Preparação, Amostras Correr, e Gel Coloração
- Adicionar 25 ml de tampão de electroforese refrigerados (TBE) e uma barra de agitação para um copo que é 2-4 vezes o volume de solução tampão e, lentamente, por aspersão, em 1,125 g da alta resolução (HR) de agarose em pó, enquanto a solução é rapidamente agitada . Remova a barra de agitação, cobrir o copo com um filme plástico e furar em um pequeno buraco para ventilação. Aqueça a taça no microondas em potência "Low" por 3 min e depois mudar para poder "High" e aquecer a solução em pulsos curtos, com cuidado para não causar derramamento. Note-se que quando a espuma criada pelo aquecimento torna-se grandes bolhas e desaparece após alguns segundos, a agarose é preparado.
- Lançar o gel a um aparelho de mini-gel horizontal, depois de o gel solidifica à temperatura ambiente para permitir que o gel relaxar durante 20 min a 4 ° C antes da utilização.
- Coloque cada pista com 25 mL de amostra de TRAP (20 l TRAP produtos de PCR e 5 de corante gel-loading ul 6x) e executado em 110 V durante 3 horas numa câmara fria a 4 ° C.
- Prepare 3x mancha de ácido nucleico solução de trabalho adicionando 15 ul 10.000x mancha de ácido nucleico-, solução de estoque a 50 ml de água duplamente destilada (ADD), com 0,1 M de NaCl (0,29 g). Corar o gel durante 20 minutos com agitação suave.
- Use fonte UV com 302 nm de comprimento de onda para ver as bandas de DNA escada TRAP.
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Representative Results
Extratos de proteínas de células inteiras foram preparados a partir do lobo frontal (FL), tronco cerebral (BS) e cerebelo (CR), obtido a partir de 3 CD-1 do sexo feminino e 3 CD-1 camundongos machos com as idades de 1 e 3 meses de idade para a ensaio TRAP modificado e 3 ratinhos CD-1 do sexo masculino com a idade de 2 meses de idade para o ensaio TRAP radioactivos. A actividade da telomerase foi detectada em 1 mg de extracto de proteínas usando o ensaio TRAP modificado e extrair 2 ug de proteínas para o ensaio TRAP radioactivos. A detecção da actividade da telomerase por ensaio TRAP radioactivos e pelo ensaio TRAP modificado mostra que uma melhor visualização e resolução dos produtos de ADN de telomerase é observado com o ensaio modificado como visto pela duração e intensidade de escada de ADN (Figura 1A 1C vs e 1D). A redução gradual nos produtos de DNA telomerase é observada quando a diminuir as concentrações de extratos de proteínas, derivadas de glioblastoma linha celular U-251, foi utilizado suggepicar a sensibilidade do método de ensaio TRAP modificada para a detecção da actividade da telomerase em concentrações mais baixas de extracto de proteínas (Figura 1B).
A actividade da telomerase é considerado significativamente maior nas regiões FL e BS, em comparação com o CR de 3 meses de idade do sexo feminino e masculino, conforme revelado pela intensidade das bandas de DNA e o comprimento da escada, os produtos de ADN. Além disso, é mostrado que durante a transição do rato na idade adulta de actividade da telomerase aumentos na FL e diminui no BS e CR (Figura 1E). Comparação entre os sexos demonstra que a actividade da telomerase em FL é mais elevada nas mulheres, em contraste com o BS e CR, mostrando a actividade de telomerase superior nos machos.
Em tecidos que expressam níveis baixos de actividade da telomerase, descobrimos que a detecção de ADN usando a escada de PCR é mais eficiente, sem usar o controlo interno (CI) do iniciador, uma vez que a IC utiliza a tS como um iniciador para a frente, portanto, interferir com a amplificação do segmento de ADN. A reprodutibilidade dos dados é alcançada repetindo várias vezes cada experimento.
Figura 1 A atividade da telomerase no cérebro do rato: Tradicional contra ensaio TRAP modificado. A) A actividade da telomerase em três regiões cerebrais analisados por ensaio TRAP radioactivos (2 meses de idade ratinhos CD-1 do sexo masculino, 2 ug extrair proteínas). B) Sensibilidade do ensaio TRAP modificado é mostrado por diminuição das concentrações das proteínas de extracto derivado de glioblastoma U -251 linha celular. C, D), a actividade da telomerase em três regiões do cérebro de meses CD-1 do sexo feminino e ratos machos 1 (C) e 3 (D). A escada de ADN inicia a banda de 50 pb com incrementos de 6 bp. (NC - controle negativo, IC- de controlo interno, BS - tronco cerebral, CR - cerebelo, FL - lobo frontal).
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Discussion
Análise de actividade da telomerase no cérebro do rato através do ensaio TRAP é constituído por quatro etapas principais: 1) extracção de proteínas a partir de regiões específicas do tecido cerebral 2) TS alongamento do iniciador pela telomerase - reacção da telomerase 3) amplificação dos produtos de reacção da telomerase por RCP 4 ) separação dos produtos de PCR em gel de agarose, utilizando alta resolução.
Este ensaio TRAP modificado aborda duas grandes dificuldades que se erguem a partir do ensaio tradicional: o uso de radioativos dCTP é para detecção sensível de produtos e PAGE PCR separação da escada de DNA. Alta resolução em gel de agarose simplifica a detecção dos produtos de reacção da telomerase (a escada de DNA) em comparação com o disco de manusear sequenciação PAGE. Além disso, a coloração de ácido nucleico, é uma solução não-tóxicos com elevada sensibilidade necessária para detecção de uma pequena quantidade de ADN.
Deve ser dada especial atenção aos seguintes etapas críticas: 1) Mantendo o tempo decorrido entre a remoção do tecido e homogeneização a um mínimo para preservar a integridade da proteína 2) CHAPS lise recongelar tampão deve ser evitado 3) extractos de proteína deve ser mantido em alíquotas e descongelado apenas uma vez antes de usar. Evite recongelar de amostras.
Podem ocorrer problemas durante a etapa de preparação gel desde gel de agarose de alta concentração é propenso a spillover e requer muita atenção durante o cozimento. A técnica tem algumas limitações com a necessidade de executar o gel em uma sala fria. Além disso, a baixa quantidade de produtos de PCR não pode ser visualizado em uma tabela UV.
Nível de actividade da telomerase varia entre diferentes tecidos e é considerada como sendo de baixa no cérebro. Este protocolo apresenta um método de detecção mais sensível, comparar com o ensaio radioactivo tradicional permitindo uma melhor detecção de actividade da telomerase no cérebro. Apesar de diferentes métodos eficientes em termos de tempo são disponíveis (kits de ensaio TRAP uma etapa com um labeled primer para a detecção de TS), estes métodos são significativamente mais caros. Além disso, a utilização de agarose elimina o risco tóxico de gel de poliacrilamida.
Como revelado nos resultados representativos, utilizando o método acima descrito, é possível demonstrar as diferenças nos níveis de actividade da telomerase entre as várias regiões do cérebro e entre masculino e feminino. Este método pode ser usado para a detecção da actividade da telomerase em outros tecidos normais, com uma baixa actividade da telomerase.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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