Abstract
Telomerasi, un ribonucleoproteina, è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri e quindi promuovere l'integrità genomica, la proliferazione, e la durata della vita. Inoltre, la telomerasi protegge i mitocondri dallo stress ossidativo e conferisce resistenza all'apoptosi, suggerendo la sua possibile importanza per la sopravvivenza dei non-mitotico, cellule altamente attive come i neuroni. Abbiamo precedentemente dimostrato la capacità di attivatori telomerasi nuovi per aumentare l'attività della telomerasi e di espressione nelle varie regioni del cervello del mouse e per proteggere le cellule neuroni motori dallo stress ossidativo. Questi risultati rafforzano l'idea che la telomerasi è coinvolto nella protezione dei neuroni da varie lesioni. Per sottolineare il ruolo della telomerasi nel cervello, noi qui a confronto l'attività della telomerasi nel cervello maschile e femminile del mouse e la sua dipendenza dell'età. TRAP assay è un metodo standard per la rilevazione dell'attività della telomerasi in vari tessuti o linee cellulari. Qui mostriamo il Analysis di attività della telomerasi nelle tre regioni del cervello di topo da parte di non-denaturazione estrazione delle proteine usando CHAPS Lysis Buffer seguita dalla modifica del dosaggio TRAP standard.
In questo test 2-step, telomerasi allunga un substrato endogeno telomerasi specifico (TS primer) con l'aggiunta di TTAGGG 6 ripetizioni bp (reazione telomerasi). I prodotti di reazione telomerasi sono amplificati dalla reazione di PCR creando una scala di DNA di incrementi di 6 bp. L'analisi del DNA ladder è fatto da alta risoluzione elettroforesi su gel di agarosio 4,5% seguita da colorazione con colorante altamente sensibile acido nucleico.
Rispetto al tradizionale test TRAP che utilizzano 32 P etichettato radioattivo dCTP di per il rilevamento del DNA e di elettroforesi su gel di poliacrilamide per risolvere la scala del DNA, questo protocollo offre un risparmio di saggio TRAP per valutare l'attività della telomerasi nel cervello di topo, dimostrando la capacità di tempo non tossico rilevare le differenze di telomerase l'attività nei vari regione del cervello di topo femmina e maschio.
Introduction
La telomerasi è un ribonucleoproteina composto di telomerasi trascrittasi inversa (TERT), la subunità catalitica della telomerasi, e una componente RNA (TERC). Il ruolo canonico di telomerasi è quello di preservare la corretta lunghezza dei telomeri con l'aggiunta di sequenze ripetitive (TTAGGG) alle estremità telomeriche, promuovendo quindi l'integrità genomica, e la proliferazione delle cellule 1. Ruoli supplementari sono stati attribuiti al TERT nelle cellule, vale a dire che conferisce resistenza all'apoptosi indotta da vari agenti dannosi 2, protegge le cellule staminali mesenchimali umane da stress ossidativo 3, e svolge un ruolo pro-sopravvivenza nei neuroni completamente differenziati dalla sua associazione di TIA1 RNA positivo granuli 4.
TERT è espresso e attivo soprattutto nelle cellule somatiche dividendo e nella maggior parte dei tipi di tumori, mentre i livelli di espressione e l'attività enzimatica sono strettamente regolati in cellule non-dividendo 5,6. Studi hanno dimostrato che nel rcervello Odent, l'attività della telomerasi diventa inosservabile da giorno postnatale 10, mentre TERT mRNA viene mantenuta a livelli inferiori in età adulta 7. Altri studi hanno dimostrato l'attività della telomerasi nella zona sub-ventricolare adulto, il bulbo olfattivo, l'ippocampo, e nel cervelletto e nella corteccia adulta 8. Abbiamo recentemente dimostrato che nuovi composti che aumentano l'espressione e l'attività della telomerasi nelle corde cerebrali e spinali hanno esercitato effetti neuroprotettivi in N-metil-D-aspartato (NMDA) - topi iniettati, ritardato l'insorgenza e la progressione della malattia sclerosi laterale amiotrofica in SOD1 transgenici topi e ha aumentato la sopravvivenza dei neuroni motori nel midollo spinale di questi topi 9. Per comprendere appieno il ruolo pro-sopravvivenza della telomerasi nei neuroni e nel cervello, è necessario sviluppare un test semplice e relativamente veloce sensibile per la rilevazione dell'attività della telomerasi nelle varie regioni del cervello.
Il telomerica rprotocollo di amplificazione EPEAT (TRAP) è un noto test sensibile che unisce l'attività canonica della telomerasi e la reazione a catena della polimerasi (PCR). In questo saggio, la telomerasi aggiunge TTAGGG ripete ad un substrato telomerasi (TS primer) oligonucleotide, seguita da amplificazione PCR che genera 6 coppie di basi (bp) scala del DNA utilizzando il TS inverso fondo -. ACX 32 P etichettato dCTP di sono utilizzati per rilevare la bassa quantità di prodotti di PCR. La scala di DNA viene risolto mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide sequenziamento (PAG). Sia l'intensità delle bande di DNA e la lunghezza del DNA ladder riflettono la quantità di molecole di enzima attivo e la loro processività rispettivamente 10.
Questo test tradizionale contiene alcune importanti difficoltà: Il pericolo di esposizione a sostanze radioattive, grandi e difficili da gestire sequenziamento PAGE e il consumo di tempo del gel corsa e l'esposizione pellicola del prodotto radioattivo (pernottamento in entrambi i casi). Questo protocollo offre un miglioramento non radioattivo agarosio saggio basato mini-gel. Il DNA 6 bp ladder viene risolto utilizzando 4,5% ad alta risoluzione su gel di agarosio e l'individuazione ha luogo con colorazione molto sensibile acido nucleico. La combinazione di alta risoluzione usando agarosio mini-gel e macchia sensibile acido nucleico offre maneggevole dosaggio, elimina il rischio di esposizione alla radioattività e abbreviare notevolmente la durata complessiva dosaggio da 3 giorni a diverse ore.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico per la sperimentazione animale nel dell'Università Ben-Gurion (IL-39-08-2010).
1 del mouse Cervello estrazione di proteine
- Preparare 3 tubi da 15 ml contenenti ciascuna 5 ml di soluzione e posizionare i tubi di Ringer su ghiaccio.
- Sacrifica il mouse utilizzando anestesia isoflurano (ATTENZIONE - utilizzare cappa chimica) per 10-20 secondi seguita da dislocazione cervicale e la decapitazione immediata.
- Rimuovere il cervello dal cranio e sciacquare per qualche secondo con la soluzione ghiacciata di Ringer per evitare danni al tessuto cerebrale.
- Utilizzando una lama chirurgica, separare il cervelletto (CR) e tronco cerebrale (BS) dalla corteccia frontale. Avanti, separare il cervelletto dal tronco encefalico e tagliare il lobo frontale (FL) dalla corteccia frontale; rimuovere il bulbo olfattivo del lobo frontale. Posizionare i 3 regioni cerebrali nelle apposite provette da 15 ml.
- Omogeneizzare il tessuto in ogni tubo. Aggiungi frsoluzione ghiaccio esh freddo Ringer in modo che ogni provetta contenga lo stesso volume e centrifugare per 7 minuti a 800 x g.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 ml di tampone di lisi CHAPS ad ogni provetta. Mescolare bene, facendo passare la soluzione di diverse volte (~ 10) attraverso una siringa da 1 ml con un ago da 21 G, e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Trasferire il contenuto di ogni provetta in una nuova provetta micro-centrifuga e centrifugare per 30 minuti a 13.000 x g. Trasferire il surnatante in una nuova provetta micro-centrifuga e determinare la concentrazione di proteine utilizzando un metodo precedentemente stabilito. Conservare gli estratti proteici in aliquote da 10 ml a -80 ° C.
2 TRAP Assay Preparazione degli strumenti di reazione, Soluzioni e proteine Calcoli diluizione
- Preparare numero adeguato di appositi tubi micro-centrifuga etichettati per proteine diluizioni estratto e tampone di reazione telomerasi. Eseguire tutti pipettaggio nel protocollo utilizzando puntali con filtro per prevenire la contaminazione. Scongelare le seguenti soluzioni su ghiaccio: TRAP mix di reazione 10x, TS fondo, di dNTP, estratti UPW e proteine (vedi tabella di materiali per reagenti e reattivi concentrazioni).
- Diluire la soluzione di estratto proteico ad una concentrazione finale di 1 mg / mL con acqua ultra-pura (UPW).
3 telomerasi Reazione
- Preparare la miscela di reazione telomerasi aggiungendo quanto segue a un tubo micro-centrifuga: mix 2 microlitri TRAP (10x), 1 ml TS Primer (0.1 mg), 1 microlitri dNTP (10 mm) e 15 ml UPW. Per campioni multipli, moltiplicare i volumi di cui sopra per il numero di campioni, più 1.
- Aggiungere 19 ml di miscela di reazione per ciascun tubo di reazione e aggiungere 1 ml di estratto proteico diluita (1 mg proteine) a ciascuna provetta per un volume finale di 20 microlitri.
- Mettere le provette di reazione in un 30 ° C bagnomaria già caldo per 45 min.
4. PCR Reazione
- Quindici kmn prima della fine della reazione telomerasi, scongelare le seguenti soluzioni: ACX di primer, Titanium Taq Buffer, UPW.
- Preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo quanto segue a un tubo micro-centrifuga: 2,5 microlitri Titanium Taq Buffer (10x), 1 ml ACX Primer (0.1 mg), 2 ml UPW (1 ml quando si usa IC) e 0,5 ml Titanium Taq polimerasi (50x). Per campioni multipli, moltiplicare i volumi di cui sopra per il numero di campioni più 2.
- Aggiungere 6 ml di miscela PCR per ciascuna provetta PCR e aggiungere l'intero volume della reazione telomerasi (20 microlitri) ad ogni provetta per un volume finale di 26 microlitri.
- Inserire le provette PCR ad un termo cycler PCR ed eseguire il seguente programma:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sec *
- 60 ° C -. 30 sec *
- 72 ° C -. 45 sec *
- 72 ° C - 2 min.
Conservare i prodotti di PCR a -20 ° C.
* = 34 cicli
5. Agarose Mini-gel Preparazione, Campioni Correre, e Gel colorazione
- Aggiungere 25 ml di tampone di elettroforesi refrigerati (TBE) e ha una ancoretta in un becher che è 2-4 volte il volume della soluzione tampone e lentamente cospargere a 1.125 g del-alta risoluzione (HR) polvere di agarosio mentre la soluzione viene agitata rapidamente . Rimuovere la barra di mescolare, coprire il becher con un involucro di plastica e forare in un piccolo foro per la ventilazione. Riscaldare il bicchiere nel forno a microonde a potenza "Low" per 3 minuti e poi passare al potere "Alto" e riscaldare la soluzione a impulsi corti con attenzione a non provocare la fuoriuscita. Si noti che quando la schiuma creata dal riscaldamento diventa grosse bolle e scompare dopo pochi secondi, l'agarosio è pronto.
- Cast gel ad una apparecchiatura di mini-gel orizzontale, dopo il gel si solidifica a temperatura ambiente consentono il gel per raffreddare per 20 minuti a 4 ° C prima dell'uso.
- Caricare ogni corsia con 25 ml di campione TRAP (20 microlitri TRAP prodotti di PCR e 5 microlitri 6x gel-loading dye) e correre alle 110 V per 3 ore a 4 ° C in camera fredda.
- Preparare nucleici 3x acido macchia soluzione di lavoro con l'aggiunta di 15 microlitri 10.000X macchia nucleico-acido, soluzione madre a 50 ml Doppio Acqua distillata (DDW) con 0.1 M NaCl (0,29 g). Colorare il gel per 20 minuti agitando delicatamente.
- Utilizzare transilluminatore UV con 302 nm di lunghezza d'onda per visualizzare le bande di DNA ladder TRAP.
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Representative Results
Estratti proteici cellulari totali sono stati preparati dal lobo frontale (FL), tronco encefalico (BS) e cervelletto (CR), derivato da 3 CD-1 femmina e 3 CD-1 topi maschi all'età di 1 e 3 mesi di età per l' saggio TRAP modificato e 3 CD-1 topi maschi all'età di 2 mesi per il saggio TRAP radioattivo. Attività della telomerasi è stata rilevata nel 1 mg di proteine estratto impiegando il saggio TRAP modificato e 2 mg di proteine estrarre per il saggio TRAP radioattivo. Rilevazione di attività della telomerasi dal saggio TRAP radioattivi e dal saggio TRAP modificato indica che una migliore visualizzazione e la risoluzione dei prodotti DNA telomerasi è osservata con il dosaggio modificato come si vede dalla lunghezza e l'intensità della scala del DNA (Figura 1A vs 1C e 1D). Una riduzione graduale dei prodotti DNA telomerasi si osserva quando concentrazioni decrescenti di estratti proteici, derivati dalla linea cellulare di glioblastoma U-251, è stato utilizzato suggepungere la sensibilità del metodo di dosaggio TRAP modificati per rivelare l'attività della telomerasi a basse concentrazioni di proteine dell'estratto (Figura 1B).
Una attività telomerasica significativamente più elevata è visto nelle regioni FL e BS rispetto al CR in 3 mesi vecchie femmine e maschi come rivela l'intensità delle bande di DNA e la lunghezza della scala prodotti DNA. Inoltre, è dimostrato che durante il passaggio del mouse verso l'età adulta telomerasi attività aumenti di FL e diminuisce nel BS e CR (Figura 1D). Confronto tra i sessi dimostra che l'attività della telomerasi FL è più alto nelle femmine in contrasto con la BS e CR che mostrano l'attività della telomerasi maggiore nei maschi.
Nei tessuti esprimenti bassi livelli di attività telomerasica abbiamo trovato che l'individuazione della scala di DNA mediante PCR è più efficace senza utilizzare il controllo interno (IC) primer, poiché l'IC utilizza il TS come primer forward interferendo così con l'amplificazione del DNA ladder. La riproducibilità dei dati è ottenuta ripetendo ogni esperimento diverse volte.
Figura 1 L'attività telomerasica nel cervello di topo: Tradizionale vs saggio TRAP modificato. A) L'attività telomerasica in 3 regioni cerebrali analizzate da radioattive TRAP assay (2 mesi di età CD-1 nei topi maschi, estraggono 2 mg proteine). B) Sensibilità del test TRAP modificato è mostrato da diminuire le concentrazioni delle proteine estratto derivato da glioblastoma U -251 cella linea. C, D), l'attività della telomerasi nelle 3 regioni cerebrali di 1 (C) e 3 (D) mesi CD-1 femmina e topi maschi. La scaletta del DNA inizia alla banda dei 50 bp con incrementi di 6 bp. (NC - controllo negativo, IC di controllo interno, BS - tronco cerebrale, CR - cervelletto, FL - lobo frontale).
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Discussion
Analisi delle attività della telomerasi nel cervello di topo mediante il dosaggio TRAP composto da 4 fasi principali: 1) proteine estrazione dalle regioni specifiche del tessuto cerebrale 2) TS allungamento fondo da telomerasi - reazione telomerasi 3) amplificazione dei prodotti di reazione telomerasi mediante PCR 4 ) separazione dei prodotti PCR utilizzando alta risoluzione gel di agarosio.
Questo saggio TRAP modificato affronta due principali difficoltà che si innalzano dal test tradizionale: l'uso di dCTP radioattive di per il rilevamento sensibile della PCR prodotti e PAGE separazione della scala del DNA. Alta gel di agarosio risoluzione semplifica la rivelazione dei prodotti di reazione telomerasi (il DNA ladder) rispetto al disco per gestire sequenziamento PAGE. Inoltre, la colorazione acido nucleico è una soluzione non tossica con elevata sensibilità necessaria per la rilevazione di piccole quantità di DNA.
Particolare attenzione dovrebbe essere data ai seguenti punti critici: 1) Mantenendo il tempo tra la rimozione dei tessuti e omogeneizzazione al minimo per preservare l'integrità delle proteine 2) Chaps Lysis Buffer rigelo dovrebbe essere evitata 3) estratti di proteine devono essere conservati in aliquote e scongelato una volta prima dell'uso. Evitare il ricongelamento dei campioni.
I problemi possono verificarsi durante la fase di preparazione del gel dal gel di alta concentrazione di agarosio è soggetta a spillover e richiede molta attenzione durante la cottura. La tecnica contiene diverse limitazioni con la necessità di eseguire il gel in una stanza fredda. Inoltre, la bassa quantità di prodotti di PCR non può essere visualizzato su un tavolo UV.
Livello di attività telomerasi varia tra i diversi tessuti ed è considerato basso nel cervello. Questo protocollo offre un metodo di rilevamento più sensibile, confrontare il dosaggio radioattivo tradizionale consentendo una migliore rilevazione dell'attività della telomerasi nel cervello. Sebbene diversi metodi di time-efficiente sono disponibili (kit di analisi TRAP un passo, utilizzando un labeled primer per il rilevamento TS) questi metodi sono molto più costosi. Inoltre, l'uso di agarosio elimina il pericolo tossico di usando gel di poliacrilammide.
Come rivelato dai risultati rappresentativi, utilizzando il metodo sopra descritto, è possibile dimostrare le differenze nei livelli di attività telomerasica fra le varie regioni del cervello e tra maschio e femmina. Questo metodo può essere usato per la rilevazione dell'attività della telomerasi in altri tessuti normali con bassa attività telomerasica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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