Introduction
Будучи в состоянии идентифицировать и количественно уровни экспрессии белка является стандартным методом с помощью животных и экспериментов на основе клеток. Однако, несмотря на давний интерес в начале эмбрионального развития сердечного клапана, оценки экспрессии белка в данном конкретном ткани во время развития в настоящее время ограничивается иммуногистохимии как в кур и мыши 1,2. Часть трудностей в количественной оценки экспрессии белка в развивающихся клапанов большинстве модельных организмов (например, кур и мышей) является небольшой размер клапанов, что ограничивает количество белка, который может быть получен. Таким образом, для количественного анализа, исследователи, как правило, полагаются на экстракции РНК и амплификации для последующего количественного ПЦР или микрочипов анализа 2-5. Тем не менее, уровни экспрессии РНК и белка не полностью корреляционная 6, так упором на выражение РНК не может обеспечить строгий учет многочисленных изменений, которые происходят в той или иной сигнализациипуть в разное время разработок. На основании этого предела в имеющихся в настоящее время методологии, цель этой процедуры в том, чтобы разработать протокол для надежной получения достаточного количества белка из развивающихся эмбриональных мышиных регионах клапана сердца для количественного анализа изменений, происходящих в различных сигнальных путей, которые важны в созревание этой ткани.
Эмбриональные клапаны уже обычно вырезали у мышей для выделения РНК и последующее гена анализа экспрессии 2-5. Тем не менее, эти исследования были ограничены использованием генной экспрессии как считывания сигнализации активации пути, который не позволяет обнаруживать обнаружить посттрансляционные модификации белков, которые могут повлиять нижестоящую передачу сигналов. Используя методы выделения РНК в качестве отправной точки, мы начали с рассекает регионах, представляющих интерес. Потому что наш интерес был обнаружения фосфорилированные белки, которые свидетельствовали о сигнализации погладитьhway активности в течение определенного периода развития клапана аорты (E13.5-14.5), мы провели все вскрытия в фосфатном свободной Трис-буфера и собирали клапанов в Трис-буфере для лизиса, основанной с фосфатазы и ингибиторы протеазы. В нашем конкретном случае, только аорты области клапанов были собраны, но область легких клапана может быть легко получена в то же время. В области клапанов были затем гомогенизируют и в сочетании с буфера выборки, которые в настоящее время используются для изучения экспрессии белка у взрослых сердечных клапанов 7. Используя небольшие объемы проб (например, 2 мкл) и объединения клапанов регионы из эмбрионов с того же генотипа, мы смогли обнаружить фосфорилированные и nonphosphorylated белки в день эмбрионального 13,5 8. Поскольку регионы клапанов можно заморозить и хранить в буфере для лизиса, эмбрионы могут быть генотипированы при необходимости до объединения.
Эта техника расширяет набор инструментов, которые доступны для оценки клеток сигнализаторг путей во время развития и обеспечивает количественный комплимент иммуногистохимии, специально для развивающихся сердечных клапанов. Эта техника должна иметь выгоду не только к кардиологам развития, но и для всех биологов развития, которые работают с ранних эмбрионов на стадии заинтересованы в регионах, которые содержат ограниченный ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл на.
1 Акцизный аортального клапана
- Использование утвержденный технику эвтаназии для эмбриональной стадии интерес, усыпить беременную мышь с щенками в нужное эмбриональный день (E) развития.
- Используйте 70% этанола для стерилизации живота беременной женщины. Подтяжка кожи и мышцы нижней части живота вверх и от внутренних органов, и препарировать полость внизу живота Откройте самки, чтобы разрешить доступ к роге матки.
- Чтобы получить рог матки, провести шейку матки щипцами и осторожно вырезать каудальнее щипцов. Поднимите рог матки, резки любой соединительной ткани, которая держит рог на месте, и завершить удаление путем разрезания стык рога матки с яйцевода.
- Поместите расчлененный рог матки в чашку Петри, содержащую седловинеD 0,1 М Трис-буфер (рН 7,6) и промыть, если необходимо. Тогда, сократить рог матки открыт продольно разоблачить эмбриональные мешочки.
- Чтобы разоблачить эмбрион, разрезать эмбриональную мешок на стыке плаценты и эмбриона и сократить сосудов пуповины, чтобы освободить эмбрион. Поместите расчлененный зародыш во втором чашку Петри с холодной 0,1 М Трис-буфера. Вернуться первый чашку Петри с остальными undissected эмбрионов до льда до готовности к следующему эмбриона.
- Для улучшения груди доступ стены внутри эмбриона, обезглавить эмбриона. Если генотипирование необходимо, снимите и сэкономить лишний кусочек ткани в пробирку Эппендорф помещают на лед.
- Поместите эмбриона на его спине, и сократить грудной клетки по вертикали вдоль боковой поверхности грудной клетки, вблизи передних конечностей, так и по горизонтали над диафрагмой для визуализации сердца. Затем откройте грудную стенку, чтобы выставить сердце.
- Использование щипцов высоко держать вдоль магистральных сосудов, поднять сердце с помощью щипцов и сократить сосуды ниже.н, на голову выше пинцетом, чтобы освободить сердце. Если легочные сосуды остаются режиссерский, легкие могут быть удалены с сердцем и должны быть удалены, прежде чем продолжить.
- Отрежьте легочную артерию выше уровня клапана; на эмбриональной стадии, описанные в данном документе, легочной артерии немного непрозрачным, который помогает в его дискриминации из области клапана. Вырезать чуть ниже клапана легочной артерии, избегая trabeculated миокарда желудочков и собрать как описано в шаге 1,10, если этот регион также представляет интерес. Здесь и на следующем этапе с помощью капиллярного действия, чтобы сделать избыточный буфер Tris от области, представляющей интерес до сбора в буфере для лизиса.
- Осторожно снимите аорты дистальнее аортального клапана, непосредственно над уровнем клапана; как легочной артерии, аорта остается слегка матовой в этих эмбриональных стадиях, пособничество в его удалении. Вырезать чуть ниже аортального клапана, снова избегая trabeculated миокарда желудочков, и передаватьклапан с помощью щипцов для Эппендорф трубки с 2 мкл буфера для лизиса (описано в таблице материалов), содержащий протеазы и фосфатазы ингибиторы на льду.
- Повторите шаги 1.6-1.10 до клапаны не были вырезали из всех эмбрионов, собирая каждый клапан в отдельном пробирку Эппендорф. Если все эмбрионы имеют одинаковый генотип, все клапаны могут быть собраны в одной пробирке Эппендорфа.
- Если генотипирование должны быть выполнены, чтобы определить, какие клапаны, чтобы объединить вместе, сразу поместить образцы в буфере для лизиса при -80 ° С до дальнейшего использования. Образцы могут быть объединены после генотипирования (шаг 2.1.1).
2 Белки Добыча
- Оттепель собранные ткани на льду и центрифуге при 13100 х г в течение 1 мин для сбора ткани в буфере для лизиса в нижней части трубки.
- Если эмбрионы генотипировали, использовать пипетку осторожно собрать и бассейн лизис буфера, содержащего регионы клапанов из эмбрионов с аналогичными генотипов. Для обеспечения сильное би, объединяя 3-4 клапанов регионов из эмбрионов E13.5 за образец рекомендуется.
- Если все эмбрионы были одного и того же генотипа, и все регионы клапанов были собраны вместе в шаге 1,10, лизировать весь образец, как описано в шаге 2.2.
- Проверьте объем полученного объединенного образца и добавить лизирующего буфера в общем объеме 40 мкл; Затем, сорвать и гомогенизации образцов, используя 5 мм бусы из нержавеющей стали в Эппендорф. Управляйте lyser для 2-4 мин при 50 Гц, в соответствии с инструкциями изготовителя. Спиновые трубки кратко, (~ 13 100 мкг в течение 1 мин), и передачи образцов в новые пробирки, оставляя позади нерастворимого мусора.
- Подготовка и отдельные образцы для SDS-PAGE и передачи для последующего Вестерн-блоттинга, в соответствии с протоколом, таким как Ислами соавт 9. Блоттинга белок управления загрузкой имеет важное значение для количественной оценки белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя эту технику подготовки, мы смогли обнаружить фосфорилированную Smad 1,5,8 (pSmad) в единичных аорты регионах клапанов от E13.5 эмбрионов. Как показано на фиг.1А, белок, выделенный из даже одного региона клапана достаточно, чтобы обнаружить слабый pSmad группу. Интенсивность сигнала возрастает пропорционально количеству клапанов регионах, которые объединяют. Важно отметить, что / соотношение β-актина pSmad остается почти постоянной между различными размерами выборки (Рисунок 1в). В связи с низким уровнем белка доступной, то же самое блот не могут быть удалены и повторно зондировали на общую Smad. Тем не менее, отдельные-блот, показывающий общее Smad 1 и β-актина показывает тот же характер экспрессии (фиг.1В).
Эти регионы клапанов почти полностью лишена загрязняющих миокарда желудочков. Используя эту технику подготовки в сочетании с образцами правого желудочка, мы были не в состоянии обнаружить ventricулар миокарда маркер ANP в аорты регионах клапанов, в то время как этот маркер был легко обнаружить в желудочке (Рисунок 2). Кроме того, желудочка миокарда маркер легкой цепи миозина 2В также легко обнаружить в образце желудочка, но едва обнаруживаемой в регионах аорты клапана. Эти результаты подтверждают правильность работы вскрытия.
Рис.1 Smad фосфорилирования в эмбриональных аорты регионах клапанов. Образцы готовили с увеличением числа объединенных эмбриональных мышиных регионах аортального клапана, от 1 до 4 клапанов регионов на образец. Каждый образец включает в себя все белки, выделенные из всей области (ы) клапана в общем объеме 25-28 мкл. Готовые ткани затем подвергали Вестерн-блот-анализа для фосфорилированного Smad1,5,8 (pSmad) (A), Общее Smad1 (С), и β-актина (А, С). Белок был обнаружен с помощью Lumigen ECL Ультра и полученную с программным обеспечением УВМ VisionWorks. Интенсивность полосы pSmad и β-актина пропорциональна количеству исходного материала, как количественно (B), используя программное обеспечение ImageJ. Эти данные приведены среднее значение и стандартное отклонение двух отдельных пятна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис.2 аорты регионы клапанов не выражают желудочковых маркеры миокарда. Образцы готовили с увеличением числа объединенных эмбриональных мышиных регионах аортального клапана, от 1 до 4 клапанов регионов на образец, или сОбразец правого желудочка. Образцы были обработаны, как описано на фиг.1, и смыл для миокарда желудочков маркеров ANP (А) и легкой цепи миозина (MLC) -2 В (В). АНП полностью ограничено образца желудочка, а MLC-2v выражается в чрезвычайно малых количествах по сравнению с желудочковой образца. β-актин, как показано управления загрузкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность количественно уровни белка в раннем эмбриональном мыши и цыпленок регионы клапана сердца обеспечивает дополнительный инструмент для понимания критических событий клеточные сигнальные для развития клапана. Наш протокол, описанный здесь, не сильно отличаются от стандартных процедур выделения белка. Однако, изменив некоторые ключевые шаги, мы успешно получили фосфорилированные белки от чрезвычайно малых размеров выборки. Для достижения этого результата, следующие шаги имеют особое значение. Чтобы гарантировать, что качество белка получается, очень важно, чтобы образцы охлажденные, то ли на льду или при помощи льда и холодной буферы, в присутствии протеазы и, при необходимости, ингибиторы фосфатазы. Кроме того, гомогенизации с устройством, которое предназначено для обработки небольших объемов образцов имеет важное значение для адекватного нарушая клеточные мембраны. Даже с этими мерами предосторожности, полученный выход белка может быть слишком низкой, чтобы обнаружить с помощью анализа Брэдфорда с помощью спектрофотометраили комплект белок количественное и до сих пор образец доступной для последующих анализов. Мы смогли определить, что каждый аорты область клапан содержит приблизительно 1 мкг белка путем объединения 7 аорты регионы клапанов и с помощью весь образец для количественного определения. Несмотря на это ограничение, достаточно белка получают, чтобы определить фосфорилированные и не фосфорилированных белков, при том, что отсутствие предварительного количественного делает контроль загрузки важное значение. Мы специально использовали β-актина, потому что это высокая численность белок, который позволил нам обнаружить его даже после удаления мембранных много раз; его молекулярная масса отличается от наших белков, представляющих интерес; и экспрессируется повсеместно. Пробный вестерн-блот с различным числом объединенных пробах рекомендуется определить, сколько ткани должны быть объединены как для эмбриональных регионах сердечных клапанов в других стадиях развития или для других мелких тканях интерес. Кроме того, мы рекомендуем объединения по крайней мере, три тОбразцы выпуск для каждого образца белка для учета изменчивости размеров рассеченных тканей, а также в продолжительности времени, каждый из эмбриона СБ на льду перед вскрытием. Если интересующий белок не могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга, даже после объединения образцов, рекомендуется уменьшить объем образца, а увеличение времени гомогенизации, чтобы гарантировать, что весь потенциал белок доступен для обнаружения. Кроме того, ингибиторы протеаз, также могут быть добавлены к охлажденной льдом Трис-буфера при вскрытий для неустойчивых или легко деградированных белков. Если интерес белок экспрессируется на низких уровнях, дополнительной диагностики во время вестерн-блот части эксперимента, например, регулируя инкубации первичного антитела или метод обнаружения субстрат, может помочь с визуализацией.
Если доказательства (например, иммуногистохимии и гибридизации на месте) показывает, что интерес белок экспрессируется как в сердечных клапанах и surrouнахождении миокарда, аорты или легочной артерии миокарда может быть дразнили друг от друга нежно с вольфрамовыми иглами, даже из клапанов от E12.5 эмбрионов 5. Потому что это дополнительный шаг будет удлинить время вскрытия и существенно расширить технические трудности, мы предполагаем применить ее в случае необходимости только. В нашем первоначальном исследовании, мы начали с иммуногистохимического анализа, который показал, что Smad фосфорилирования были только изменены в мезенхимы клапана; Таким образом, мы были уверены, что любые различия, наблюдаемые через вестерн были в связи с изменением экспрессии в клапана мезенхимы 8. Кроме того, поскольку клапаны развивающиеся отток тракта сидеть на стыке крупных артерий и желудочков, выполняя управления кляксу на загрязнение желудочка с использованием миокарда желудочков конкретных антител, такие как ANP или MLC-2v рекомендуется.
Поскольку клапаны подвергаются драматический реорганизации в процессе их развития, мы предлагаем следующий этап конкретных гЕКОМЕНДАЦИИ для подушки / клапанов и окружающей их ткани. Для начала подушками (E9.5-11.5), как выносящего тракта и атриовентрикулярных подушки легко визуализировать и расчлененный благодаря полупрозрачности миокарда 10; Тем не менее, эти эмбрионы малы, и рассечения иглы рекомендуется вместо щипцов и microscissors. Для середины стадии дифференциации (E12.5-14.5) 10, полулунных клапанов (т.е. аорты и клапанов легочной артерии) будет более доступным, чем атриовентрикулярных клапанов (т.е. митрального и трикуспидального клапанов). Тем не менее, полулунные клапаны должны быть тщательно препарировали потому аорта и легочная артерия которые septating и вращающихся в течение этого времени 11,12. Особое внимание должно быть уделено вращения основания аорты и легочной артерии, а середина между этими артерий должны быть последовательно определены. На более поздних стадиях клапана созревания и конденсации (E15.5 и позже) 10, митральный и трехстворчатый клапаны могут быть дразнили от внутри желудочков; однако, полулунные клапаны должны быть более доступными.
Вестерн-блот анализ представляет собой метод давней для количественной оценки уровней экспрессии белка у взрослых сердечных клапанов 13, где размер биопсии является большим. В отличие от этого, дополнительный раннего эмбрионального анализы были направлены на либо не количественной иммуногистохимии для выявления экспрессии белка или обратной транскрипции ПЦР, где небольшое количество исходной изолированной мРНК может быть усиленный до анализа. Эти используемые в настоящее методы обеспечивают некоторую соответствующую информацию относительно изменений в экспрессии сигнальной и генной но не имеют возможности количественно оценить уровни белка. С этого протокола, мы можем теперь добавить количественные данные экспрессии белка коррелирует с количественных данных экспрессии мРНК и иммуногистохимических анализов.
Этот протокол комплименты создана методы для выделения мРНК из эмбриональных сердечных клапанов и экспрессии белка изображений. Таким образом, комбинируя эти методы позволят более полных анализов вверх и вниз регулирования сигнальных путей, от мРНК к пост-трансляционной модификации белков. Кроме того, этот метод позволяет для количественного определения экспрессии белка, что позволит расширить используемые в настоящее время методы иммуногистохимии. Вместе, мы считаем, что эта техника будет представлять интерес для любого исследователя, заинтересованного в сердечных клапанов или получения других особенно небольшие эксплантов тканей для количественного Вестерн-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
