Introduction
הערכה היא כי מחצית מאוכלוסיית ארה"ב חווה שבר בגיל 65 1. עבור אותם מטופלים עם שברים שטופלו בניתוח, 500,000 הליכים כרוכים בשימוש בשתל עצם 2 ומספר זה צפוי לעלות עם הזדקנות אוכלוסייה יותר ויותר 3 . למרות שעצם הוא אחד מכמה איברים שיש את היכולת לרפא לחלוטין ללא צלקות, יש מקרים שבם התהליך נכשל 3,4. בהתאם לנסיבות ולאיכות טיפול, 2-30% משברים בעצמות ארוכות ייכשלו, וכתוצאה מכך 3,5 שאינו איגוד. אמנם יש עדיין ויכוח על ההגדרה, pseudoarthrosis, פציעות עצם הקריטיות בגודל או אי-איחוד בדרך כלל מתייחס לפגיעה שאינה נרפא במשך החיים הטבעיים של הנושא 6. למטרות ניסוי, משך זה מתקצר לזמן הממוצע שנדרש להחלמה של פציעה עצם בגודל ממוצעת מלאה. נגעי עצם ללא איחוד להתרחש numסיבות erous, אך גורמים עיקריים כוללות טראומה קיצונית וכתוצאה מכך פער קריטי בגודל, זיהום, אנגיוגנזה עניה, שימוש בטבק, או יכולת osteoregenerative עכבות עקב מחלה או גיל 7. גם אם מטופלים אינם איגודים בהצלחה, זה יכול לעלות בעודף של 60,000 $ להליך, בהתאם לסוג פציעה והגישות המועסקות 8.
במקרים מתונים, השתלת עצם אוטולוגית מועסקת. אסטרטגיה זו כרוכה בהחלמה של עצם מאתר תורם והשתלה באתר של פציעה. בעוד גישה זו היא מאוד יעילה, הנפח של עצם תורם נגזרות זמין מוגבל וההליך כרוך ניתוח נוסף, שתוצאתו כאב מתמשך בחולים רבים 9,10. בנוסף, היעילות של שתל עצם אוטולוגית תלויה של בריאותו של המטופל. תחליפי עצם עשויים מחומרים סינטטיים או עצם מגופות מעובד זמינים 11-13 בשפע, אבל הם חהve מגבלות משמעותיות, כוללים נכסים עניים הידבקות מארח תאים, osteoconductivity המופחת, והפוטנציאל לדחייה חיסונית 14. אין אפוא צורך דחוף בטכנולוגיות התחדשות עצם שבטוחות, יעילים וזמינות לציבור רחב.
היכולת שלנו לשפר את אסטרטגיות משובי עצם תלויה באופן קריטי על היכולת לחקות טראומת עצם חמורה בבעלי חיים בדיקה, אבל הדור והייצוב של נגעי עצם גדולים הוא מאתגר מבחינה טכנית. ברוב המקרים, טראומת עצם ארוך רצינית חיקתה בניסוי על ידי הקמת פגם שלא באופן טבעי לרפא. למרות שזה יכול להשתנות עם מינים 15, זו מושגת על ידי הסרת קטע עצם שהוא גדול יותר מ -1.5 פעמים הקוטר של עצם החתך 16 מלאה. העצם מכן התייצב עם שתל מתכת כדי לשמור על כיוון נכון של קצות שבר ולאפשר לניידות. בשל גודלם הקטן והשברירי שלהעצמות הארוכות שלהם, הקמת כזה נגעים בעכברים הן מעבר ליכולות של רוב קבוצות מחקר. ככזה, מודלים פגם עצם ארוך מוגבלים לחולדות ובעלי חיים גדולים יותר. עם זאת, עכברים יעניקו יתרונות משמעותיים במחקר שהם יכולים להיות מהונדסים גנטיים וגדלו כזנים שנפרץ חיסון שלא לדחות תאים ורקמות אנושיים.
עבור יישומים מבוססי תאים אנושיים, עכברים שנפרץ חיסון הם אטרקטיביים לעבוד איתו כי הם מבחינה פיזיולוגית מאופיינים היטב, קל לבית, חסכוני, בקלות ובנתח radiologically והיסטולוגיה. חשיבות עליונה הוא שעכברים שנפרץ חיסון לא דוחים תאים ממינים שונים כולל בני אדם. גודלם הקטן מאפשר גם הבדיקה של מספרים קטנים מאוד של תאים או כרכים של פיגומים ניסיוניים ביישומים אורטופדיים. כמה מודלים עכבריים אורתופדים כבר דיווחו כי להרשות לעצמו דרגות שונות של יציבות עצם 17,18. תוכנה לאלהms המוביל לרמות גבוהות מאוד של יציבות, כגון תופסנים חיצוניים וצלחות נעילה בעיקר לרפא על ידי התאבנות intramembranous למרות ריפוי endochondral דווח 19. בניגוד לכך, אלה המאפשרים כמה מיקרו ו / או מקרו-תנועה, כגון אלה המעסיקים סיכות לשדיות מבולבלות או חלקי-קבועות, בדרך כלל לרפא עם דומיננטיות של התאבנות endochondral 20,21. איגוד מושהה או פגמים שאינם איחוד של עצם ארוך הם קשה במיוחד להשגה בעכברים עקב הרמה נוספת של ייצוב הנדרשת. עם זאת, מספר גישות כבר דיווחו, כולל סיכות לשדיות עם ציפורני לובים, צלחות נעילה ותופסנים חיצוניים 22. מערכות אלה בדרך כלל עובדים היטב, אבל בהתחשב בעיצוב המסובך שלהם הם יכולים להיות מאתגרים מבחינה טכנית להתקנה. לדוגמא, גרסיה et al. 23 המציא מערכת סיכה שלובים אלגנטית לשימוש בעכברים, אבל ההליך כרוך חתכים בשני אתר נפרדים ושינוי נרחב של עצם הירך כדי להכיל את הסיכות. נהלים אלה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח.
במסמך זה, אנו מתארים סיכה לשדית הירך פשוטה עם צווארון מרכזי שנועד למנוע סגירת גירעון עצם 3 מ"מ וגם להתוות את הקצוות המקוריים של הפגם. בעוד הסיכה לא הייתה קבועה לעצם עצמו, לשינוי גודל מדויק של קוטר הסיכה וreaming של תוצאות החלל הלשדיות בהתערבות מספיקה כדי למזער תנועת torsional (איור 1). עם בחירה זהירה של גיל טהור, מגדר ועכברים בהתאמה מתח, התוצאה היא שאינו uniondefect hypertrophic מאוד לשחזור 22 ניתן יהיה להעריך בקלות radiologically. יתר על כן אזורים של עניין יכולים להיות מוגדרים reproducibly לאחר טומוגרפיה-מחושב מיקרו (μCT) למדידת דה נובו היווצרות עצם ופרמטרי histomorphological. הסיכות היו prototyped במעבדה שלנו תוך שימוש בכלים זמינים.
איור 1: עיקרון ניסויי סיכום תרשים של מודל הפגם המגזרי.. קטע 3 מ"מ המרכזי של עצם ירך עכברית 9-10 מ"מ הוא נכרת בניתוח (משמאל). צינור פלדה כירורגית ארוך 3 מ"מ, 19 מד הוא חלף על פני מ"מ ארוך 9, 22 צינור הנירוסטה G וקבוע עם דבק במרכז המדויק (מימין). סיכת התוצאה היא מצויד לתוך התעלות הלשדיות של החלקים הפרוקסימלית ודיסטלי הנותרים של עצם הירך עם 19 צווארון G החלפת קטע 3 מ"מ של עצם (להלן, במרכז).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מיועד לעכברי עירום נשיים (נו / J) (18-25 גרם, 6 שבועות) שנרכשו ממעבדות ג'קסון. מאחר שזנים של עכברים להשתנות מעט במונחים של אנטומיה וקצב צמיחה, אנו ממליצים כי הייצור של סיכות הוא מותאם לזן, המין והגיל של המקבלים לפני השתלה לנושאים חיים. אם הזנים מותאמים בקפידה, ההפרעות בכושר בין הסיכה וחלל מוח הוא מאוד לשחזור. נהלים לדיור, תזונה וגידול בעלי חיים כלליים הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה, אבל כל העכברים שוכנו בבהתאם למדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (8 Edition ה) ומדיניות מוסדית נקבע על ידי מוסדי הטיפול בבעלי החיים ועדת שימוש (IACUC) וחוג למדע הרפואה (DCM) בשעה סקוט ולבן בבית החולים.
1. ייצור של סיכות
- לחתוך באורך 9 מ"מ של 22 צינורות תת עורי נירוסטה G, ואורך 3 מ"מ של 19 צינורות G באמצעות מצויד לכלי סיבובי גלגל חתוך חובה כבדה פיברגלס קוטר 23.8 מ"מ מחוזק. השתמש בצבת שקצהו קנס קטנה כדי לשתק את צינורות (איור 2 א, לעיל). משקפי מגן מתאימים ולטפל כלי סיבובי עם טיפול.
- מניחים כמות קטנה (כ -10 μl) של דבק cyanoacrylate לאמצע פיר 9 מ"מ. להעביר את צווארון 3 מ"מ מעל פיר 9 מ"מ עד במרכז ולסובב כדי לפזר את הדבק בין הצווארון והפיר באופן שווה. למדוד ממדים עם זוג מחוגה דיגיטלית ולהשוות עם איור 1. אפשר להגדיר לפחות 15 שעות (איור 2 א, במרכז).
- השתמש בתקליטור ספוג שמיר 220 חצץ כדי להסיר קוצים ודבק מוגזם.
- שימוש בכלי הסיבובי, ללטש את הסיכה באמצעות דיסק ליטוש הרגיש.
- לשטוף עם מים ללא יונים ויבשים עם compreאוויר ssed.
- שלמות בדיקה על ידי הצבת מחט מזרק בוטה 19 G מעל הפיר של הסיכה שנעשתה לאחרונה ודחיפה כנגד הצווארון. ודא שהקולר יכול להתנגד כ 25 גרם במשקל.
- יש לשטוף את הסיכה בפוספט-מסונן סטרילי שנאגרו (איור 2, למעלה). ודא שהפיר של הסיכה המתאימה בנוחות לתוך החלל לשדי הירך עם סומק הצווארון כנגד קצות העצם לחתוך (איור 2 ג). תצורות שונות Prototype למטרות הספציפיות של המחקר והנמען (איור 2 ד). ודא שהקצוות של הסיכה לחדור לתוך עצם trabecular של diaphysis על מנת למקסם קיבעון ולשפר את ההפרעה בכושר (איור 2E).
הערה: מומלץ כי הכושר נבדק על דגימות עצם לפני ההשתלה בעכברים חיים (למשל איור 2C). - השתמש בחותך אגרוף-ביופסית קוטר 4 מ"מ לחתוך גלילמגיליון בעובי של 5 מ"מ של ספוג ג'לטין כירורגית. השתמש באזמל כדי לחתוך את הגליל לאורך 3 מ"מ ולהעביר מחט מזרק 20 G לאורכו של הגליל כדי ליצור חור (איור 2 א, להלן).
הערה: מצאנו כי המיצוב של פיגום ג'לטין או קולגן באתר של הפגם משפר שימור תא וגורם לצמיחה ארוכת טווח לאורך הציר של העצם. - להעביר את גליל קצף ג'לטין על הסיכה וליישר עם הצווארון (איור 2, במרכז) והחיטוי במחזור יבש ב 120 ° C ב 15 psi. קצף ג'לטין יתייבש ולהכהות בצבע (איור 2 ב, להלן).
2. טכניקה כירורגית
הערה: ההליך הבא נכתב התבוננות כל ההנחיות שנקבעו על ידי המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (מהדורת 8 th). שים לב, כל פוליסות נוספותשנקבע על ידי IACUC המקומי ולהבטיח פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC (או שווה ערך) הוא במקום לפני שתמשיך עם הסעיפים הבאים.
איור 3: מכשירי ניתוח. (א) ערכת כירורגי. להבי אזמל מיקרו-מקדח (1), (2), תפר נספג חיתוך גלגל (3), תפר חיצוני (4), (5), ידית אזמל (6), סיכות לשדיות סטרילי העטוף בנייר כסף (7), מד עומק לשדי טופס שנעשה צינורות תת עורי (8), מלקחיים חוטם קנס (9), מלקחיים עכברוש-שיניים (10), מחטים קהות reaming (11), נהגי מחט (12), hemostats הקטן (13), מספריים עדינים (14) מעלית, periosteal (15), מלקחיים שונה קרן (16) (ב):. שינויים הנדרשים כדי לייצר עצם אוחז בסגנון קרן לעכברים.
- בחר חדר ניתוחי הליך או מעבדה נקייה עם דלת closable ולא באמצעות תנועה. לטהר surfac עבודה מתאימהדואר עם שואב חיטוי מבוסס רבעוני כיתה קלינית.
- בעוד לובש כפפות סטריליות חד פעמיות וגלימה, להגדיר שדה סטרילי בסך של כ 60 x 90 סנטימטר 2 על משטח העבודה המחוטאת עם וילונות בד autoclaved.
הערה: מומלץ לי עוזר להסיר את האריזה החיצונית ולהציג את החומרים סטריליים לחוקר הקמת השדה. - הנח מצויד מחדש circulator מים חם על וילון כרית חימום מחוטא ולכסות עם וילונות חד פעמי סטרילית. לחמם מעקר את חרוז לטמפרטורת הפעלה (C ° 250-265, זה לוקח עד 30 דקות).
- , על שדה סטרילי לארגן הערכה הניתוחית (איור 3 א) כדי לספק גישה נוחה לכל הרכיבים. כמו כן, מספק גזה סטרילית כותנה (2 x 2 אינץ '2), Q-טיפים סטריליים, קערת סטרילי פלדה (500 מיליליטר) המכילה תמיסת מלח סטרילית (0.9% w / v) applicators, וחומר חיטוי / איזופרופיל אלכוהול כלורהקסידין כירורגית.
- להרכיב קטןיחידת הרדמה בעלי חיים ליד השדה סטרילי עם תא אינדוקציה והרכבת האף-קונוס בהתאם להדרכת וטרינרים ומדריך למשתמש. השתמש חמצן כיתה קליני כאספקת הגז וisoflurane, USP.
איור 4: הליך כירורגי. גישה (AC) וחשיפה של עצם הירך. (DE) העלאה וחתכים. Reaming (FK) ושינוי גודל של תעלות לשדיות.
איור 5: הליך כירורגי. התקנה (AB) של סיכה. סגירה (CD). (E) תמונה אופיינית של שעות ממוקמות כראוי סיכת 24 לאחר ניתוח.
- מניחים את העכבר בתא האינדוקציה של מערכת ההרדמה וset הפלט 2 L דקות -1 O 2 וריכוז isoflurane עד 3% (V / V).
- בדוק שהעכבר הוא מחוסר הכרה בתוך דקות 1; להעלות את הריכוז עד 4% (V / V) במידת צורך. הסר את העכבר, המקום בשדה סטרילי עם כרית החימום ממוקמת מתחת ולהחיל את חרטומו. העברה תזרום לקונוס, ולהפחית את isoflurane ל -2.5%, לחכות 20 שניות נוספות, ומבחן למטוס כירורגית נאות בהתאם למדיניות מוסדית. בדרך כלל, חוסר רפלקס גפיים האחורי כאשר לחץ בעדינות הוא נאות לקביעת הרדמה נאותה.
- במהלך כל התהליך, יש לפקח עוזר לנשימה סדירה חזקה וצבע ורוד של הגפיים ופה האזור כדי להבטיח רמה נאותה של חמצון ואילו הלא-מודע. התאם הרדמה בהתאם להדרכת וטרינרים ומדיניות מוסדית במידת צורך. v ש"ש החל המשחה סטרילי דמעות מלאכותיות חומר סיכה (15% (V / V) שמן מינרלים, 83% (/ v)וזלין ITE) לעיניים.
- הפכת את העכבר על צד אחד עם האחורי-האיבר כלפי מעלה על וילון חד-פעמי חדש. אם יש צורך, להסיר את הפרווה עם מכונת גילוח חשמלי או קרם להסרת שיער. נגב את האתר עם תמיסת מלח סטרילית ולהסיר את הווילון נוסף עם פרווה עודפת. הנח וילון fenestrated חדש על העכבר כדי לכסות את כל החלקים אבל כל-הגפיים האחורי (איור 4 א), אלא לשמור על מבט של הפנים והכפה לפקח צבע ונשימה.
- אתר את הקצוות הפרוקסימלית והדיסטלי של עצם הירך ולחתוך את העור למשך 5-10 מ"מ לאורך ציר האורך (איור 4). הפרד את שכבת העור מfascia עם אזמל # 15, חושף את גישה לרוחב לעצם הירך באמצעות femoris שרירי וlateralis vastus. אתר שבו septa של שני השרירים להיפגש (זה קו של רקמה לבנה על רקע הצבע הוורוד של השריר). עם אזמל, לנתח בזהירות לאורך גבול intermuscular עדעצם הירך היא גלויה (איור 4).
- לפתח את החתך עם מעלית periosteal בוטה כדי לחשוף את מלוא diaphysis (איור 4C). השתמש במעלית כדי לחשוף את שני שלישים המרכזיים נוסף של עצם הירך תוך הקפדה לשמר את צרור העצבים וכלי הדם האחורי בצד המדיאלי (איור 4D). בעדינות לגרד את רקמות רכות של העצם עם אזמל, ויבשות עם Q-קצה או שווה ערך סטרילי.
- אתר המרכז של עצם הירך עם מחוגה במידת צורך וסימן עם אזמל סטרילי או סמן, לאחר מכן לסמן 1.5 מ"מ proximally וdistally מהמרכז. בעדינות לתפוס את עצם הירך בעזרת זוג מלקחיים בסדר חוטם עיצבו בעבר בסגנון קרן כדי למנוע לחץ מופרז על העצם.
הערה: ממדים מדויקים לשינויים מסופקים באיור 3. מומלץ לבדוק את המלקחיים על דגימה מורדמים לפני השימוש כדי להבטיח את העצם לא ישבור תחת לחץ דורשד לקיבוע במהלך חיתוך. - באמצעות מצויד בגלגל יהלום-חצץ דק מצופה חיתוך (קוטר x 0.1 מ"מ רוחב 8 מ"מ) תרגיל בסדר, לעשות את החיתוך הראשון עם המעלית במקום כדי להגן על רקמה מתחת (איור 4E). העלאת הירך לחתוך עד 45 מעלות תוך החזקת תקיפות הגפיים של diaphysis, עובר את הסינון השני, הסרת קטע 3 מ"מ.
הערה: הגנת Face מומלצת בשלב זה. - עם העצם משותק על ידי מלקחיים, לקדד בזהירות את החללים הלשדיים של כל קצה עם מזרק 23 G בוטה. שימוש בעומק-מד שהוכן מראש, עשוי מאורך של 22 צינורות G להציב 19 צינורות G (איור 3 א, אני TEM 8), להעריך את העומק של החלל הלשדי חרוש ולהבטיח את זה הוא 3 מ"מ (איור 4F-K) . אם החלל הלשדי מתנגד מד עומק 22 G, לקדד שוב עם מחט מזרק 22 G בוטה.
- הכנס את הסיכה הלשדית להפרוקסימלי אז ג הלשדי דיסטלי בזהירותavities להביא את עצם הירך האחורית לאורכה המקורי ולהקים פער 3 מ"מ יציב (איור 5 א ', ב'). במידת צורך, למרוח כמות קטנה של לחץ ידני על מנת להשיג בכושר טוב להפרעה של המוט עם עצם קליפת המוח של עצם הירך. ודא שהפינים מתאים בנוחות לתוך החללים הלשדיים של שני הצדדים והקצוות של עצם הקיצוץ מיושר עם הצווארון. אם יש פער, לקדד שוב עם מחט קהה 22 G.
- למקם מחדש את השריר ורקמה היקפית על הסיכה ולסגור עם 5-0 נספג תפר מתמשך (איור 5 ג). חתך בעור הדוק עם 5-7 ניילון מרובע קשר 5-0 תפרים וחותם עם דבק כירורגים (איור 5D).
3. נהלים לאחר ניתוח
- לאחר סגירת החתך בעור, לסגת הרדמה, אלא לאפשר O 2 להישאר זורם עד שהעכבר מתחיל לנוע; זה צריך לקחת דקות פחות מ 1. אם העכבר נשאר ללא תנועה לאחר 5 דקות שלO 2 ממשל, מתייחס למדיניות מוסדית על התערבות וטרינרית.
- כאשר העכבר מתחיל לנוע, בעדינות להעביר אותו לכלוב רצוי המכיל מצעים יבשים, autoclaved.
- מניחים קן איגלו-סוג בכל כלוב והעכבר ייסוג לתוכו, צמצום תנועה. בדוק שהעכבר משחזר ניידות אחורית-איבר 5-10 דקות לאחר ההתאוששות של תודעה.
- לבצע ניטור לאחר ניתוח יומי בהתאם למדיניות מוסדית. מספק לחות gelatinized ואוכל על הרצפה של הכלוב ל5-7 הימים הראשונים ולנהל שיכוך כאבים לאחר ניתוח וניטור בהתאם למדיניות שאושרה מוסדי.
הערה: אנו לנהל 0.05-0.1 מ"ג לקילו -1 עצירות 24 עם 0.25 מיליליטר מלוח מתחת לעור, פעמיים ביום למשך 3 הימים הראשונים ולאחר מכן, אם העכבר לא להחזיר את השירות רגיל.
- לאחר 24 שעות הראשונות של התאוששות, לבצע הדמיה רנטגן ביצורי חי undeההרדמה r לדמיין מיקום סיכה (4E איור). אם סיכת נקע, לשקול ניתוח לתיקון מיידי.
- ביום 7 לאחר ניתוח, להסיר תפרים בהרדמה ובית בקבוצות בהתאם למדיניות בעלי חיים מוסדיים.
- לאחר 2-5 שבועות, באנושיות להרדים בעלי חיים בהתאם לאמריקנית לרפואת וטרינרית האגודה אישרו שיטות להמתת החסד 25.
הערה: זריקת intraperitoneal של קוקטייל המתת חסד רביטורטים-שילוב זמין מסחרי היא יעילה ואנושית, אבל צריכה להיות במעקב מדיניות מוסדית מקומית על המתת חסד. - לנתח בזהירות האחורית-האיבר על ידי חשיפת עצם הירך הפרוקסימלית והאגן מהצד המדיאלי. לחץ בעדינות את המפרק פנימה מהצד לרוחב של האיבר תוך ניתוק ראש עצם הירך מַרחֶשֶׁת (שקע הירך) עם אזמל. חותך נותר שרירים ועור עם אזמל חד או מיקרו מספריים, שחרורכל האיבר בצורת האגן. עם זוג חד של rongeurs או מספריים כבדים, לחתוך את-הגפיים האחוריות התחתונים (שוקה / שוקית) כ 5 מ"מ מתחת למפרק הברך.
הערה: מומלץ שכל הדגימות נשמרות באופן זהה לפני הניתוח. - להסיר את העור, אך להשאיר את השריר במקום. לתקן את הרקמה ב -10% פורמלין שנאגרו בתוספת 10 מ"מ CaCl 2 מקבע לשבוע ואחרי האחסון בופר פוספט 1 בתוספת 10 מ"מ CaCl 2 לתקופה של עד 1 חודש לפני ההדמיה. בצע קיבעון ואחסון ב 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, לסרוק דגימות באופן מיידי ללא קיבעון.
4. ניתוח של דגימות
הערה: ריפוי עצם ניתן להעריך על ידי מגוון רחב של שיטות שהם מעבר להיקף של פרוטוקול זה. הבא הוא שיטה שיש לנו בהצלחה מועסק באמצעות תרמי microCT דגימה (μCT). מומלץ הפרמטרים הבאים arהדואר נבדק בתחילה, ולאחר מכן מותאם לצרכי הספציפיים של הפרויקט.
- לעטוף דגימה בשכבה דקה של סרט איטום הפלסטיק ומיקומו במאונך בתא המכשיר. ודא כי עצם הירך היא בניצב לבמה המדגם במהלך כל הסריקה. הגדר את הסריקה לפרמטרים הבאים; מתח = 29 קילו וולט, = 661 מייקרו-אמפר הנוכחי, הכח = 19 W, גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר) = 21.00; 360 סיבוב תואר = כן; מיצוע מסגרת = על (5); צעד סיבוב (מעלות) = 1.00, תנועה אקראית = על. לשמור תמונות כקבצי JPEG בתיקייה אחת יעד לסריקה (למשל איור 6 א).
הערה: הסריקה צריכה להיות שלמה ב -57 דקות. - לנצל את תוכנת השחזור כדי ליצור תמונות ציריות המבוססות על הפרמטרים הבאים; החלקה = על (4), פיצוי חוסר תיאום = ב, הפחתת חפץ טבעת = על (5), (40%) תיקון התקשות הקרן, סיבוב CS (deg) = 0.00. להגדיר פלט 2,000-15,000 יחידות Hounsfield. לשמור תמונות כקבצי JPEGבתיקיית יעד יחידה לסריקה.
- שימוש בתמונות ציריות ותוכנה אנליטית, מגדיר את האזור של העניין (ROI) על ידי הגדרה הפרוקסימלי וקצוות מרוחקים של הפגם המקורי הראשון. להשיג זאת על ידי בחירת החלקים שיקיפו את הצווארון בלבד. בגלל הצווארון הוא עבה יותר מהפינים הלשדיים, סעיפים אלה מוגדרים בקלות (איור 6, משמאל). אל תכלול את הצווארון מחישובים על ידי ציור אזור הדרה סביבו (עם מרווח של 100 מיקרומטר) והעברת האזור לכל אחד מהסעיפים בROI (איור 6, מימין).
הערה: רגעי פולאר אינרציה, 3D שחזורים וחישובים כגון הנפח של עצם חדש (איור 6 ג, ד) בקלות יכולה להיות מושגת באמצעות התוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים בדרך כלל להתאושש תודעה ואחורית-איבר ניידות 5-10 דקות לאחר הנסיגה של הרדמה. במהלך 5 הימים הראשונים, רצוי לבית עכברים בנפרד ולהציג את ההעשרה סביבתית כדי למנוע שימוש יתר בגפיים. לצורך כך, קיני איגלו הסוג להפחית את הצורך בבניית קן ולעודד מנוחה. יש לנו גם ציינו כי אספקת מזון והידרוג'ל על רצפת הכלוב מקטינה את ההסתברות של עקירת סיכה. בתקופה של 5 הימים, שיכוך כאבים צריכים להינתן כנדרש בהתאם למדיניות שאושרה על-מוסדי. ירידה במשקל של עד כ -15% מהמשקל טרום הניתוחי המקורי ניתן בתקופה שלאחר ניתוח 5 הימים. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, צילומי רנטגן של האיבר המושפע מומלצים להעריך פיני מיקום. הסיכות צריכה להיות מוכנסות כהלכה לתוך התעלות הפרוקסימלי ודיסטלי הלשדיים עם הקצוות של סומק הפגם נגד הצווארון (איור 2 ג,2E, איור 5E, ואיור 6 א). במקרים נדירים (<5% מהמקרים), יכולות להיות נקע סיכות בפרוטוקולים של שימוש ריפוי ובעלי חיים בשלבים מוקדמים אמורים לספק לניתוח תיקון אם זה קורה. אמנם זה מאתגר מבחינה טכנית לכמת תנועת torsional על עצמות ירך עכבריות, מישוש ידני של דגימות אישר כי תנועת torsional אורך והרוחב היא שולית לאחר 7 ימים כרקמת חיבור מצטברת סביב הפין. לאחר 5 ימים של מעקב לאחר ניתוח, ניתן להחזיר את העכברים לדיור קהילתי סטנדרטי כמו לכל מדיניות שאושרה-מוסדי.
ללא התערבות טיפולית, את הקצוות של הפגם בדרך כלל להאריך 0.5 מ"מ במהלך 21 ימים, אבל במקרים נדירים, צמיחת עצם חדשה יכולה להיות עד 1 מ"מ (איור 6 א). מעצרי צמיחת עצם לאחר תקופה זו כשלבים דלקתיים ואנבוליים של הפסקת התחדשות וכתוצאה מפגם שאינו איגוד. לאחר 14-21 ימים של ריפוי, o הנפחדה נובו עצם f ניתן לקבוע בקלות מתמונות ציריות שנוצרו על ידי סריקת μCT. שימוש בסריקה, הליכי שיקום ובחירת ROI צירי המתוארים בפרוטוקול, הנפח של עצם החדש שנוצרו עולה עם זמן, אך אינו עולים בדרך כלל על סך של 1 מ"מ 3 בהעדר ההתערבות הטיפולית (איור 6 ג) בהשוואה ל6- 7 מ"מ 3 באזור מבחינה אנטומית מקביל של עצם ירך וללא כל פגע. בעוד הבדיקות ביו-מכאניות קונבנציונליות היא מאתגרות מבחינה טכנית בשל גודל הדגימה וטבעה של שיטת הקיבוע, הרגע הקוטבי של האינרציה (PMI), הערכה של היכולת של חומר להתנגד פיתול המבוססת על אזור וצפיפות חתך, היה מוצג לייצג הערכה מתאימה של כוח בעצמות ארוכות 26,27. באמצעות שיטה זו, חתכים צירי במרחקים שונים מקצות הנגע יכולים להיבחר לניתוח. לאחר 21 ימים, fr 0.25 מ"מ PMI של עצם דה נובואום נגע קצות טווחים מבין 0.05-.35 מ"מ 4 בהשוואה ל0.02-.08 מ"מ 4 במרכז הנגע המאשר את נוכחותם של לא-איחוד במקרים שלא טופלו (איור 6 ד) נוסף. מדד מנהלי הרכש של עצם ירך וללא כל פגע במיקום אנטומית מקביל נע בדרך כלל בין 0.5-0.7 מ"מ 4 באמצעות התנאים שתוארו כאן.
איור 6: תוצאות אופייניות. סריקות () X-ray של עצמות ירך ביום 7, 14 ו -21 לאחר הניתוח מפגינות ingrowth המוגבל של עצם הלוח ב ':. ייצוג תרשים של הפרמטרים למדידת ההחזר על ההשקעה עצם נפח. צירי נציג חתך עם אזור הרחקה (EX) על סיכת הצווארון כולל 100 מיקרומטר שוליים כדי לא לכלול מדידה של חפצים בממשק מתכת-הרקמה (משמאל). סריקת עצמות מלאה (right, למעלה) מדגים את ההחזר על ההשקעה האורך שהוגדרה על ידי החלקים של עצם בין קצות הצווארון עם רקמה מקורית עצם נכללה (EX). קצות הנגע המקוריים נמצאים בסעיפים הצירי באמצעות ההבדל בין הקוטר של הפינים והצווארון (מימין, בהמשך). (ג) מדידות נפח אופייניות ביום 7, 14 ו -21 לאחר ניתוח ללא התערבות טיפולית (פירוש עם סטיות תקן, n = 3). (ד) מדידות PMI בסעיפים צירי 0.25 מ"מ מהקצוות הפרוקסימלית ונגע דיסטלי ונקודת האמצע (אמצעי עם סטיות תקן, n = 3). (מוטבעים-פרפין מוכתם Trichrome E) של האסון סעיף (משמאל) לחתוך בכיוון האורך מפגין תולדת עצם מורכבת מהסחוס (CA) ורקמת עצם ספוגי (ב) (בר = 0.5 מ"מ בקנה מידה). המיקום של השדה מצויינים בסריקת רנטגן (מימין). ללא decalcifi (F)ed, סעיף העטרה משובץ methacrylate מהתיל של פגם 1 בן יומו המוכתם בhematoxylin ו eosin (בר = 1.0 מ"מ בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Decalcification של הרקמות בדרך כלל לוקח 10-14 ימים באמצעות תנאים סטנדרטיים, ומנוטר בקלות על ידי סריקת רנטגן. מומלץ לשמור על כמה שרירים בדגימות במהלך decalcification כדי לשפר את היציבות במהלך טיפול. לאחר decalcification, סיכות ניתן להסיר בזהירות עם אזמל חד המאפשר הטבעת פרפין והיסטולוגיה. צביעת Trichrome של האסון של סעיפים אורך מאפשרת הדמיה של תולדת עצם endochondral עם קצה מוביל של הסחוס (CA) ואחריו רקמת עצם ספוגי (CB) (איור 6-ה). בעוד כמה נזק יהיה בלתי נמנע להתרחש במהלך נתיחה, המבנה היסטולוגית של עצםורקמת חיבור נשארת ברורה אם הסיכה היא הסירה בזהירות. לחלופין, הטבעת methacrylate מתיל וחתך של סעיפים שאינם demineralized ניתן לבצע עם הסיכה במקום (איור 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי ליצור פגם-התייצב סיכה קריטית בגודל של עצם הירך העכברית באמצעות מעבדה סטנדרטית וציוד וטרינרים. בעוד ההרכבה של הסיכות וההליך הכירורגי עצמו דורש תרגול, זה גם בתוך את היכולות של מדען מאומן היטב ביו-רפואי או מחקר וטרינר.
הסיכה ממוקמת לתוך התעלה הלשדית ללא קיבוע נוסף, מה שהופך את הליך בחינה טכני יותר ריאלי מאשר גישות מורכבות יותר המעסיקות תופסנים חיצוניים או ברגים שלובים. בעוד כמה תנועת torsional עלולה להתרחש במהלך המוקדמים של ריפוי השלבים, זה למזער על ידי תשומת לב קפדנית לקוטר הסיכה וreaming נאות של תעלה הלשדית כדי להשיג חברה בכושר התערבות בין השתל וendosteum. עם בחירה זהירה של מתח והתאמה של גיל ומין טהורים, הכושר הופך reproducibly חזק בתוך ימים ספורים. אף על פי כן, wiה כניסתו של טכניקות הדפסת 3D, צפוי כי תנועת torsional ניתן להפחית עוד יותר על ידי גרסאות מתוחכמות יותר של הפינים המשלבים משטחים מחוספסים ו / או אתרים מצורפים תיל. הקלות של זיוף סיכה ואת הזמינות של מגוון רחב של גדלי צינורות תת-עורית גם מאפשרות אופטימיזציה של הטכניקה עבור כמעט כל עכבר מולד מבוגר, ללא קשר לפנוטיפ עצם הטבעי או ניסיוני.
עיצוב סיכת הצווארון הייחודי משרת שתי מטרות: (i) למניעת היצרות חריגה של הפגם והנזק של הגפיים העצם באמצעות החלקת אורך, וכן (ii) על מנת לספק נקודות ציון המגדירים את הקצוות המקוריים של הפגם. כמדידות כאלה, נפח ומדד מנהלי רכש יכולות להתבצע בקלות באמצעות סורק μCT דגימה כגון 1174. Skyscan אכן, גישה זו מאפשרת לרמה של quantitation שאינו מתקבלת בקלות עם טכניקות בגודל שאינם קריטיות סטנדרטית שבר שמפגין לעתים קרובות משתנים או קקיrly מוגדר פציעות. בעוד יחידת μCT עדיפה לכימות של ריפוי, הערכה על ידי הערכה אובייקטיבית של תמונות רנטגן המאונכות או טכניקות ניתוח תמונת 2D עשוי לייצג חלופות אפשרית. בשל תכולת המינרלים בגודל קטן ונמוך יחסית שלהם, גפיים עכבריים יכולים להיות מוכנים בקלות להיסטולוגיה ורכובים כדגימות כל לhistomorphometry הקונבנציונלי. זה מבטל את בעיות דגימה לעתים קרובות בפני חוקרי ביצוע ניתוחי histomorphometric לשברים בבעלי חיים גדולים.
בניסויים שתוארו כאן, זמן ההחלמה היה קצר יחסית בשבועות 3, אשר תואם את השלב המהיר, אנבוליים של ריפוי עצם. לאחר מכן, שיפוץ עצם הוא תהליך איטי מאוד 28. בדרך כלל, אם הגישור לא נצפה לאחר 4 שבועות, הריפוי סביר להתרחש וזאת בהסכמה, אנו צופים צמיחת עצם נוספת קטנה מאוד לאחר 4 שבועות במערכת זו. יתר על כן, פער 3 מ"מ עומד בקריטריונים של מפתח etl. 16 לפגם בגודל קריטי ואל גרסיה et. הוכיח כי פער צר כמו 1.8 מ"מ אינו מרפא מספיק לאחר 10 שבועות וזה יכול להתעכב עד 15 שבועות עם perichondrium הפשיט 23.
בעוד אתגרים בגודל ושבריריות של עצמותיהם הנוכחיות קשים טכניים למחקר אורתופדים, השימוש בעכברים הוא יתרון בדרכים רבות. לדוגמא, יש מגוון של זנים שנפרצו חיסוניים המאפשרים בדיקה של תאים וחלבונים אנושיים ללא פחד מדחייה חיסונית, וגודלם הקטן מפחית את הצורך בכמויות עודפות של חומרים יקרי ערך, תאים או תרכובות ניסיוניים. זה בא לידי ביטוי על ידי המחקר שנערך לאחרונה שלנו הוכיח את יעילותם של תאי בוגרים גזע אנושיים והחלבונים תאיים שלהם לosteoregeneration 29. תוחלת חיים קצרות יחסית של עכברים גם להציג את ההזדמנות למחקר להזדקנות 30 והמגוון הרחב של זנים טהורים peRMIT המחקר של גנוטיפ העולמי על ריפוי 31. ישנם גם מספר דגמי מחלה שהוקמו בקלות בעכברים כמו סוכרת ואוסטאופורוזיס 32,33. ראוי לציין משמעותי היא הזמינות של עכברים הטרנסגניים רבים שניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקדם את ההבנה של פיזיולוגיה עצם משובי בתנאים של טראומה הקיצונית שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות וטרינרים במחלקת סקוט & White בית החולים השוואתי רפואה, בית המקדש, טקסס, לקבלת הייעוץ יסולא בפז שלהם וסיוע בפיתוח של טכניקה זו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי המכון למשובי קרנות תכנית לרפואה, סקוט & White RGP # מענק 90,172, NIH 2P40RR017447-07 וNIH R01AR066033-01 (NIAMS). אנו מודים לד"ר סוזן זיתוני לבידוד את כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C.
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V.
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H.
- Aro, H. T., Aho, A. J.
- Burstein, F. D.
- Kao, S. T., Scott, D. D.
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A.
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
