Introduction
Es wird geschätzt, dass die Hälfte der US-Bevölkerung erleben eine Fraktur von 65 Jahren ein. Für die Patienten mit Frakturen behandelt, chirurgisch, 500.000 Verfahren beinhalten die Verwendung eines Knochentransplantat 2, und diese Zahl wird voraussichtlich mit einer immer älter werdenden Bevölkerung 3 steigen . Obwohl Knochen ist eines der wenigen Organen, die die Fähigkeit, vollständig zu heilen, ohne Narbenbildung hat, gibt es Fälle, wo der Prozess aus 3,4. Abhängig von den Gegebenheiten und die Qualität der Behandlung, 2-30% der Frakturen langer Röhrenknochen ausfallen und dadurch den nicht gewerkschaftlich 3,5. Zwar gibt es noch einige Diskussionen über die Definition, Pseudoarthrose, kritische große oder nicht gewerkschaftlich Knochenverletzungen in der Regel bezieht sich auf eine Verletzung, die nicht über die natürliche Lebensdauer des Gegenstandes 6 heilt. Zu Versuchszwecken wird diese Dauer auf die durchschnittliche Zeit bis zur vollständigen Heilung einer mittelgroßen Knochenverletzung erforderlich ist, verkürzt. Nicht gewerkschaftlich Knochenläsionen treten für numerous Gründen, aber wichtigen Faktoren gehören extreme Trauma in einem kritisch große Lücke, Infektionen, schlechte Angiogenese, Tabakkonsum, oder gehemmt osteoregenerative Leistung durch Krankheit oder Alter von 7 Jahren. Selbst wenn Pseudarthrosenbildung erfolgreich behandelt wird, kann es über 60.000 US-Dollar pro Vorgang kostet, abhängig von der Art der Verletzung und den verwendeten 8 Ansätze.
In mittelschweren Fällen wird autologen Knochentransplantation beschäftigt. Diese Strategie beinhaltet die Gewinnung von Knochen aus einem Donor-Stelle und der Implantation an der Stelle der Verletzung. Dieser Ansatz ist zwar sehr wirksam ist, ist das Volumen der verfügbaren Spender abgeleiteten Knochens begrenzt und das Verfahren führt eine zusätzliche Operation, die in chronischen Schmerzen bei vielen Patienten 9,10 ergibt. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit des autologen Knochentransplantat abhängig von der Gesundheit des Patienten. Knochenersatz aus synthetischen Materialien oder verarbeitet Leichenknochen sind reichlich vorhanden 11-13, aber sie have erheblichen Einschränkungen, einschließlich schlechte Wirtszellhaftungseigenschaften, reduziert Osteokonduktivität, und das Potenzial für Immunabwehr 14. Es besteht daher ein dringender Bedarf für die Knochenregeneration Technologien, sicher, effektiv und weit verbreitet sind.
Unsere Fähigkeit, Knochenregenerationsstrategien verbessern hängt entscheidend von der Fähigkeit, schweren Knochentrauma bei Versuchstieren zu imitieren, aber die Erzeugung und Stabilisierung von großen Knochenläsionen ist technisch anspruchsvoll. In den meisten Fällen wird ernsthafte langKnochenTrauma experimentell durch die Schaffung eines Mangels, die nicht natürlich heilen wird nachgeahmt. Kann aber auch mit 15 Arten variieren, wird dies durch die vollständige Entfernung eines Knochensegments, die größer als das 1,5-fache des Durchmessers des Knochenquerschnitts 16 ist erreicht. Der Knochen wird dann mit einem Metallimplantat stabilisiert, um eine ordnungsgemäße Orientierung der Bruchkanten erhalten bleibt und die Mobilität. Aufgrund ihrer geringen Größe und der Zerbrechlichkeitihre langen Knochen, Einrichtung solcher Läsionen bei Mäusen sind über die Fähigkeiten der meisten Forschungsgruppen. Als solche sind lange Knochendefekt Modellen an Ratten und größere Tiere beschränkt. Dennoch Mäusen leisten bedeutende Forschung Vorteile, dass sie genetisch modifiziert und als immungeschwächten Stämme, die nicht die menschliche Zellen und Gewebe zurückweisen gezüchtet werden.
Für menschliche Zell-basierte Anwendungen sind immungeschwächten Mäusen attraktiv, mit, weil sie physiologisch gut charakterisiert, einfach zu Hause zu arbeiten, kostengünstig, und analysiert radiologisch und histologisch leicht. Von größter Bedeutung ist, dass immungeschwächten Mäusen keine Zellen verschiedener Arten einschließlich des Menschen ablehnen. Ihre geringe Größe erlaubt auch die Prüfung von sehr kleinen Anzahl von Zellen oder Volumina Versuchsgerüste in orthopädischen Anwendungen. Mehrere Maus orthopädischen Modellen berichtet worden, dass verschiedene Grade der Knochenstabilität 17,18 leisten. Diejenigen systems, die eine sehr hohe Stabilität, wie externe Fixatoren und Schließbleche führen überwiegend durch intramembranöse Verknöcherung zu heilen, obwohl endochondralen Heilung wurde berichtet, 19. Im Gegensatz dazu diejenigen, die einige der Mikro- und / oder Makro-Bewegung, wie beispielsweise jene, die nicht fixierten oder teilweise fixierten Markstiften zu ermöglichen, in der Regel zu heilen mit einer Dominanz von endochondralen Verknöcherung 20,21. Verzögerte Gewerkschaft oder nicht gewerkschaftlich Mängel Röhrenknochen sind besonders schwer zu erreichen bei Mäusen durch die zusätzliche Ebene der Stabilisierung erforderlich. Allerdings sind eine Reihe von Ansätzen wurde berichtet, einschließlich Markstiften mit Verriegelungsnägeln, Verriegelungsplatten und externe Fixatoren 22. Diese Systeme in der Regel gut, aber aufgrund ihrer komplizierten Konstruktion technisch anspruchsvoll sie zu installieren sein. Beispielsweise Garcia et al. 23 entwickelt eine elegante Verriegelungsstift System zur Verwendung bei Mäusen, aber das Verfahren führt Einschnitte an zwei getrennten Standorts und umfangreiche Modifikation des Femurs, um die Stifte aufzunehmen. Diese Verfahren wurden unter einem Präpariermikroskop geführt.
Hier beschreiben wir eine einfache Schenkelmarknagel mit einem zentralen Kragen zur Schließung einer 3 mm Knochendefizit zu verhindern und auch beschreiben die ursprünglichen Ränder des Defekts. Während der Stift nicht an den Knochen selbst befestigt, und zwar Dimensionierung der Stiftdurchmesser und Aufreiben der Markhöhle zu einer ausreichenden Interferenz Torsionsbewegung (Figur 1) zu minimieren. Mit einer sorgfältigen Auswahl der Inzucht-Alter, Geschlecht und Stamm-Mäusen abgestimmt, ist das Ergebnis eine hohe Reproduzierbarkeit der hypertrophen nicht uniondefect 22, die leicht radiologisch ausgewertet werden können. Außerdem interessierende Bereiche reproduzierbar nach Mikrocomputertomographie (μCT) zur Messung der de novo Knochenbildung und histomorphologischen Parameter definiert werden. Die Stifte wurden in unserem Labor mit leicht verfügbaren Werkzeuge Prototyp.
Abbildung 1: Versuchsprinzip Schematische Zusammenfassung der segmentalen Defekt-Modell.. Das zentrale 3 mm Segment einer 9-10 mm Maus Femur chirurgisch entfernt (links). Ein 3 mm lang, 19 Gauge chirurgischen Stahlrohr wird über eine 9 mm lange, 22 G Edelstahlrohr genau in der Mitte (rechts) geleitet und mit Klebstoff fixiert. Die sich ergebende Stift in die Markkanäle der verbleibenden proximalen und distalen Abschnitt des Oberschenkelknochens mit der 19G Kragen die 3 mm Knochensegment ersetzen (unten Mitte) ausgestattet.
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Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll wird für weibliche Akt (Nu / J) Mäuse (18-25 g, 6 Wochen) von Jackson Laboratories erworben entwickelt. Da Mäusestämme unterscheiden sich etwas in Bezug auf die Anatomie und die Wachstumsrate, empfehlen wir, dass die Herstellung von Pins auf die Belastung, Geschlecht und Alter der Begünstigten vor der Implantation in den Live-Themen optimiert. Wenn die Stämme aufeinander abgestimmt sind, ist die Passung zwischen dem Stift und Markraum hoch reproduzierbar. Die Verfahren für die Unterbringung, Ernährung und allgemeine Tierhaltung würde den Rahmen dieses Protokolls, aber alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8 th Edition) und institutionelle Politik der Institutional Animal Care und stellen untergebracht Verwenden Committee (IACUC) und Abteilung für Vergleichende Medizin (DCM) bei Scott and White Hospital.
1. Herstellung von Pins
- Schneiden Sie ein 9 mm Länge von 22 G Edelstahl hypodermischen Schlauch und einem 3 mm Länge 19 G Schlauch mit einem 23,8 mm Durchmesser aus glasfaserverstärktem Hochleistungs Trennscheibe mit einem Drehwerkzeug ausgestattet. Verwenden Sie kleine spitzen Zange, um den Schlauch (2A, oben) zu immobilisieren. Tragen Sie geeignete Schutzbrille und Handgriff Drehwerkzeug mit Sorgfalt.
- Eine kleine Menge (etwa 10 ul) von Cyanacrylat-Klebstoff auf der Mitte des 9 mm Welle. Übergeben Sie die 3 mm Kragen über die 9 mm Welle, bis in der Mitte und drehen gleichmäßig zu verteilen Sie den Kleber zwischen dem Bund und der Welle. Messen Sie Dimensionen mit einem Paar von digitalen Messschieber und Vergleichen mit Abbildung 1. Lassen Sie für mindestens 15 Stunden (2A, Mitte) eingestellt.
- Verwenden Sie eine Körnung 220 Schleif imprägnierte Scheibe, um Grate und übermäßigen Kleber zu entfernen.
- Mit dem Drehwerkzeug, polieren den Stift mit einem Filz Polierscheibe.
- Mit deionisiertem Wasser abspülen und trocken mit umfasrochen Luft.
- Test-Integrität, indem Sie einen 19 G hypodermic stumpfen Nadel über die Welle des neu gemacht Stift und Push gegen den Bund. Sicherzustellen, dass der Kragen etwa 25 g Gewicht zu widerstehen.
- Spülen der Stift in sterilfiltrierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (2B, oben). Sicherzustellen, dass der Schaft des Stiftes paßt genau in den Oberschenkelknochenmarkhöhle mit dem Kragen an die Kanten des geschnittenen Knochens (2C). Prototype verschiedenen Konfigurationen für die besonderen Zwecke der Studie und den Empfänger (2D). Stellen Sie sicher, dass die Enden des Stiftes dringen in den trabekulären Knochen der Diaphyse, um Fixierung zu maximieren und zur Verbesserung der Festsitz (2E).
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass der Sitz auf Knochenproben vor der Implantation in lebende Mäuse (zB 2C) getestet. - Verwenden Sie einen 4 mm Durchmesser Punch-Biopsie Schneider, um einen Zylinder geschnittenaus einer 5 mm dicken Schicht des chirurgischen Gelatineschwamm. Verwenden Sie ein Skalpell, um den Zylinder zu 3 mm Länge trimmen und passieren eine 20 G Injektionsnadel entlang der Länge des Zylinders, um ein Loch (2A, unten) zu generieren.
HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass die Positionierung einer Gelatine oder Kollagengerüst an der Stelle des Defekts verbessert die Zellbindung und induziert Längenwachstum entlang der Achse des Knochens ist. - Übergeben Sie die Gelatine Schaumstoffzylinder über den Stift, und richten Sie mit dem Kragen (2B, Mitte) und Autoklaven auf einer trockenen Zyklus bei 120 ° C bei 15 psi. Die Gelatine-Schaum trocknet und dunkler in der Farbe (2B, unten).
2. Operationstechnik
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird geschrieben Berücksichtigung aller Vorschriften durch den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8 th Edition) eingestellt. Bitte beachten Sie die zusätzliche Richtlinienvon der lokalen IACUC eingestellt und sorgen für eine IACUC genehmigten Tiernutzung Protokoll (oder gleichwertig) ist, bevor mit den folgenden Abschnitten fortfahren.
Abbildung 3: Chirurgische Instrumente. (A) OP-Set. Mikrobohrer (1), das Schneidrad (2), einer absorbierbaren Naht (3), Außennaht (4), Skalpellklingen (5), Skalpellgriffstücks (6), sterile Markstiften in Folie (7) umwickelt, Mark Tiefenmaß hat Form hypodermischen Schlauch (8), feine Nase Zange (9), Rattenzahnzange (10), stumpf Reiben Nadeln (11), Nadeltreiber (12), kleine Gefäßklemme (13), einer feinen Schere (14), Raspatorium (15), geändert Kern Zange (16) (B):. Änderungen erforderlich, um Kern-style Knochengriffe für Mäuse zu erzeugen.
- Wählen Sie ein chirurgisches Verfahren, Zimmer oder sauberen Labor mit einer verschließbaren Tür und ohne Durchgangsverkehr. Desinfizieren Sie eine geeignete Arbeit surface mit klinischer Qualität quartären basierten Desinfektionsreiniger.
- Beim Tragen sterile Einweghandschuhe und Robe, die Einrichtung eines sterilen Bereich von ca. 60 x 90 cm 2 auf der keimArbeitsFläche mit autoklaviertem Tuch drapiert.
HINWEIS: Es ist ratsam, einen Assistenten entfernen Sie die äußere Verpackung und stellen die sterile Materialien an die Ermittler der Einrichtung des Feldes. - Legen Sie eine keim Heizkissen auf eine Warmwasserwieder Zirkulator auf dem Tuch angebracht und Abdeckung mit sterilen Einmal Vorhänge. Wärmen Sie eine Perle Sterilisator auf Betriebstemperatur (250 bis 265 ° C, nimmt diese bis zu 30 min).
- Auf dem sterilen Bereich, ordnen Sie die Chirurgie-Kit (3A) auf bequemen Zugang zu allen Komponenten. Ebenso bieten sterile Baumwollgaze (2 x 2 inch 2), steril Q-tips, eine sterile Edelstahlschüssel (500 ml), die sterile Salzlösung (0,9% w / v), und Chlorhexidin / Isopropylalkohol chirurgischen Desinfektions Applikatoren.
- Setzen Sie einen kleinenTiernarkosegerät neben dem sterilen Bereich mit einer Induktionskammer und Nasenkonus-Anordnung nach den tierärztlichen Anleitung und der Bedienungsanleitung. Verwenden Sie Sauerstoff klinischer Qualität wie die Gasversorgung und Isofluran, USP.
Abbildung 4: Chirurgisches Vorgehen. (AC) Ansatz und der Exposition des Oberschenkelknochens. (DE) Elevation und Schnitte. (FK) Reiben und Größenbestimmung von Markkanäle.
Abbildung 5: Chirurgisches Vorgehen. (AB) Installation der Stift. (CD) Schluss. (E) Typisches Bild richtig positioniert Stift 24 Stunden nach der Operation.
- Legen Sie eine Maus in die Induktionskammer des Anästhesiesystem und set der Ausgang auf 2 L min -1 O 2 und dem Isoflurankonzentration bis 3% (v / v).
- Überprüfen Sie, ob die Maus bewusstlos innerhalb 1 min; erhöhen die Konzentration von 4% (v / v), falls erforderlich. Die Maus, am sterilen Bereich entfernen mit dem Heizkissen darunter liegenden und wenden Sie die Bugnase. Überfluss, um den Konus und die Isofluran zu reduzieren, um 2,5%, warten weitere 20 sec, und Test angemessene chirurgische Flugzeug nach institutionellen Politik. In der Regel ist der Mangel an einem Hinterbein Reflex wenn drückte sanft ausreichend für die Bestimmung eine adäquate Anästhesie.
- Während des gesamten Prozesses, einen Assistenten-Monitor für starke regelmäßige Atmung und Rosafärbung der Extremitäten und Mundbereich, ein angemessenes Niveau der Sauerstoffversorgung während bewusstlos zu gewährleisten. Passen Anästhesie nach den tierärztlichen Beratung und institutionelle Politik, wenn nötig. Bewerben sterile künstliche Tränen Schmiermittel Salbe (15% (v / v) Mineralöl, 83% (v / v) white Petrolatum) für die Augen.
- Drehen Sie die Maus auf eine Seite mit der Hintergliedmaße nach oben auf eine neue Wegwerftuch. Entfernen Sie gegebenenfalls Fell mit einem elektrischen Rasierer oder Enthaarungscreme. Wischen Sie die Stelle mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie das zusätzliche Tuch mit einem Überschuss Fell. Legen Sie eine neue Lochtuch über die Maus, so dass alle Teile, sondern die gesamte Hinterschenkel (4A) zu decken, sondern halten Blick auf das Gesicht und Pfoten, um die Färbung und die Atmung zu überwachen.
- Finde die proximalen und distalen Enden des Oberschenkelknochens und die Haut einzuschneiden 5-10 mm entlang der Längsachse (4B). Trennen Sie die Hautschicht von der Faszie mit einem # 15 Skalpell, Belichten eines lateralen Zugang zum Femur über die biceps femoris und vastus lateralis. Suchen Sie, wo die Scheidewände beider Muskeln erfüllen (es ist eine Reihe von weißen Gewebe gegen die Rosafärbung des Muskels). Mit einem Skalpell vorsichtig zerlegen entlang der Grenze bis zum interder Oberschenkelknochen sichtbar ist (Figur 4B).
- Entwickeln Sie den Schnitt mit einem stumpfen Raspatorium, um die gesamte Diaphyse (4C) aus. Verwenden Sie den Aufzug in weiteren setzen die zentralen zwei Drittel des Oberschenkelknochens und gleichzeitig dafür Sorge, um den hinteren Gefäßnervenbündel auf der medialen Seite (4D) zu bewahren. Kratzen sanft Weichgewebe off des Knochens mit einem Skalpell und trocken mit einem sterilen Wattestäbchen oder gleichwertig.
- Die Mitte des Oberschenkelknochens mit einer Schieblehre bei Bedarf und markieren mit einem sterilen Skalpell oder Marker, markieren 1,5 mm proximal und distal vom Zentrum entfernt. Fassen Sie den Oberschenkelknochen unter Verwendung eines Paares von feinen Nase Pinzette zuvor in der Kern-Stil gestaltet, um übermäßigen Druck auf den Knochen zu verhindern.
HINWEIS: Die genauen Abmessungen für die Änderungen werden in 3B vorgesehen. Es ist ratsam, die Zange auf einem eingeschläfert Probe vor zu prüfen, um zu verwenden, um den Knochen zu gewährleisten wird nicht unter Druck brechen erforderlichd zur Immobilisierung beim Schneiden. - Mit einem feinen Bohrer mit einem feinen Diamant-Schleif beschichtet Trennscheibe (Ø 8 mm x 0,1 mm Breite) bestückt ist, den ersten Schnitt mit dem Aufzug, um die Gewebe unten (4E) zu schützen. Anheben der geschnittenen Oberschenkelknochen auf 45 °, während Festhalten des Endes der Diaphyse, machen den zweiten Schnitt, Entfernen eines 3 mm-Segment.
HINWEIS: Gesichtsschutz wird in dieser Phase empfohlen. - Mit dem Knochen durch die Zange immobilisiert sorgfältig ream die Markhöhlen von jedem Ende mit einer stumpfen 23G Injektionsnadel. Mit einem vorgefertigten Tiefe Spur ab einer Länge von 22 G Schlauch in 19 G Schlauch gelegt hat (3A tem i 8), bewerten die Tiefe des aufgebohrten Markraum und sicherzustellen, dass sie 3 mm ist (4F-K) . Wenn der Markhöhle widersteht der 22 G Tiefenmesser, wieder Ries mit einem stumpfen 22 G Injektionsnadel.
- Der Marknagel in das proximale dann distalen Mark c vorsichtigavities um den Oberschenkelknochen zurück an seine ursprüngliche Länge einer stabilen 3 mm Zwischenraum (5A, B) zu bringen und zu etablieren. Falls nötig, eine kleine Menge an manueller Belastung um einen guten Preßsitz des Stabes mit dem kortikalen Knochen des Oberschenkels zu erreichen. Sicherzustellen, dass der Stift paßt genau in die Markhöhlen von beiden Seiten und die Kanten des geschnittenen Knochens bündig mit dem Kragen. Wenn es eine Lücke, Ries wieder mit einer 22 G stumpfe Nadel.
- Positionieren Sie die Muskeln und peripheren Gewebe über den Stift und schließen mit einem kontinuierlichen resorbierbaren Naht 5-0 (5C). Schließen Hautschnitt mit 5-7 quadratischen Knoten Nylon 5-0 Nahtmaterial und Dichtung mit chirurgischen Klebstoff (5D).
3. Postoperative Verfahren
- Nach dem Schließen der Hautschnitt, zurückzutreten Anästhesie, aber erlauben O 2 fließt, bis die Maus zu bewegen beginnt zu bleiben; sollte weniger als 1 min dauern. Wenn die Maus bewegungslos bleibt nach 5 minO 2 Verwaltung finden Sie in der institutionellen Politik auf Tier Intervention.
- Wenn die Maus zu bewegen beginnt, sanft überträgt es auf einen Käfig vorzugsweise trocken, autoklaviert Bettwäsche enthalten.
- Ein Iglu-Typ-Nest in einem Käfig und die Maus in sie zurückziehen, wodurch die Bewegung. Überprüfen Sie, ob die Maus wieder Hintergliedmaße Mobilität 5-10 Minuten nach der Wiederherstellung des Bewusstseins.
- Führen Sie tägliche postoperative Überwachung gemäß institutionelle Politik. Geben verkleisterte Feuchtigkeit und Nahrung auf dem Boden des Käfigs in den ersten 5-7 Tagen und zu verwalten, Analgesie und postoperative Überwachung gemäß institutionell genehmigten Richtlinien.
HINWEIS: Wir verwalten 0,05-0,1 mg kg -1 Buprenorphin 24 mit 0,25 ml Kochsalzlösung subkutan, zweimal täglich für die ersten 3 Tage danach, und wenn die Maus nicht normalen Gebrauchszurückzugewinnen.
- Nach den ersten 24 Stunden der Erholung, live-Tier-Röntgenbildgebung under Anästhesie Stiftanordnung (4E) zu visualisieren. Wenn der Stift verrenkt, sollten Sie sofort Revisionsoperation.
- Am Tag 7 nach der Operation, zu entfernen Nähte unter Narkose und Haus in Gruppen in Übereinstimmung mit institutionellen Tierhaltung Politik.
- Nach 2-5 Wochen, menschlich einschläfern Tiere gemäß der American Veterinary Medical Association anerkannten Methoden für die Euthanasie 25.
HINWEIS: Eine intraperitoneale Injektion von handelsüblichen Barbiturat-Kombination Euthanasie Cocktail effektive und humane, aber die lokalen institutionellen Richtlinien zur Sterbehilfe zu beachten ist. - Sorgfältig sezieren entfernt die Hintergliedmaße, indem die proximalen Femur und das Becken von der medialen Seite. Nach innen Drücken Sie den gemeinsamen von der lateralen Seite des Schenkels während Abnehmen des Hüftkopfes aus der Hüftpfanne (die Hüftpfanne) mit einem Skalpell. Die Reste der Muskeln und Haut mit einem scharfen Skalpell oder Mikroscheren, Trennder ganze Leib bilden das Becken. Mit einem scharfen Paar Rongeure oder schwere Schere, schnitt die untere Hinterschenkel (Schienbein / Fibula) ca. 5 mm unterhalb des Kniegelenkes.
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass alle Proben in gleicher Weise vor der Analyse gelagert. - Entfernen Sie die Haut, aber lassen Sie Muskel vorhanden. Fix des Gewebes in 10% gepuffertem Formalin mit 10 mM CaCl 2 Fixiermittel für 1 Woche, gefolgt von der Lagerung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10 mM CaCl 2 für bis zu 1 Monat vor der Bilderzeugung ergänzt ergänzt. Führen der Fixierung und Lagerung bei 4 ° C. Alternativ scannen Proben sofort ohne Fixierung.
4. Analyse der Proben
HINWEIS: Die Knochenheilung kann durch eine Vielzahl von Methoden, die den Rahmen dieses Protokolls beurteilt. Im Folgenden ist eine Methode, die wir erfolgreich mit einer Probe microCT (μCT) Imager sind eingesetzt. Es wird empfohlen, dass die folgenden Parameter are getestet anfänglich dann für die spezifischen Bedürfnisse des Projekts optimiert.
- Wickeln Muster in einer dünnen Schicht aus Kunststoffdichtungsfolie und Position vertikal in der Instrumentenkammer. Sicherstellen, dass die Femur ist senkrecht zu der Probenstufe während der gesamten Abtastung. Stellen Sie den Scan auf die folgenden Parameter; Spannung = 29 kV, Strom = 661 & mgr; A, Leistung = 19 W, Bildpixelgröße (um) = 21,00; 360-Grad-Drehung = yes; Bildmittelung = on (5); Rotationsschritt (Grad) = 1,00, zufällige Bewegung = on. Bilder als JPEG-Dateien speichern in einem Zielordner pro Scan (zB 6A).
HINWEIS: Der Scan sollte vollständig sein, in 57 min. - Nutzen das Rekonstruktionssoftware zur axialen Bildern auf der Grundlage der folgenden Parameter zu generieren; Glättung = on (4), Versatzausgleich = on, Ring Artefaktreduktion = on (5), Strahlhärtekorrektur (40%), CS Drehung (Grad) = 0.00. Stellen Sie Ausgang 2,000-15,000 Hounsfield-Einheiten. Bilder als JPEG-Dateien speichernin einem Zielordner pro Scan.
- Mit den axialen Bildern und Analysesoftware, definieren Sie die Region of Interest (ROI), indem Sie zuerst die proximalen und distalen Kanten des ursprünglichen Defekt. Sie erreichen dies, indem Sie die Abschnitte, die nur den Kragen zu umfassen. Da der Kragen ist dicker als der Marknagel, sind diese Abschnitte leicht definiert (6B, links). Schließen Sie die Manschette aus Berechnungen, indem eine Sperrzone um es (mit einer 100 & mgr; m-Marge) und die Übertragung der Zone zu jedem der Abschnitte in der ROI (6B, rechts).
HINWEIS: Polar Trägheiten 3D-Rekonstruktionen und Berechnungen wie das Volumen von Knochen (6C, D) kann leicht mit Hilfe der Software erreicht werden.
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Representative Results
Mäuse in der Regel erholen Bewusstsein und Hintergliedmaße Mobilität von 5-10 Minuten nach dem Herausziehen der Anästhesie. Während der ersten 5 Tage, ist es ratsam, Mäuse einzeln untergebracht und stellen eine Bereicherung der Umgebung, um überschüssige Verwendung des Gliedes zu verhindern. Dazu Iglu-Art Nester reduzieren die Notwendigkeit für Nestbau und ermutigen Ruhe. Wir haben auch beobachtet, dass von Speisen und Hydrogel auf dem Boden des Käfigs reduziert die Wahrscheinlichkeit von Stiftverschiebung. Während der 5-Tage-Frist, sollte Analgesie, der nach institutionell anerkannten Richtlinien erforderlich verabreicht werden. Gewichtsverlust von bis zu etwa 15% des ursprünglichen präoperativen Gewicht während der 5-tägigen postoperativen Phase möglich. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation werden die Röntgenstrahlen der betroffenen Extremität empfohlen, Pin-Platzierung zu bewerten. Die Stifte sollten vollständig in den proximalen und distalen Markkanäle mit den Kanten des Defekts bündig gegen den Kragen (2C eingefügt werden,2E, 5E und 6A). In seltenen Fällen (<5% der Fälle), können Stifte in einem frühen Stadium der Heilung und der Tiernutzung Protokolle ausgerenkt geworden sollte für Revisionsoperationen bereitstellen, wenn dies der Fall ist. Zwar ist es technisch schwierig, Torsionsbewegung auf murine Oberschenkelknochen zu quantifizieren ist, manuelle Palpation der Proben bestätigt, dass Dreh- und Längsbewegung ist marginal nach 7 Tagen, wie Bindegewebe sammelt sich um den Stift. Nach 5 Tagen postoperative Überwachung können die Mäuse zum Standard kommunale Wohnbau nach institutionell anerkannten Richtlinien zurückgegeben werden.
Ohne therapeutische Intervention, die Ränder des Defekts zu verlängern typischerweise 0,5 mm während 21 Tage, aber in seltenen Fällen kann neues Knochenwachstum von bis zu 1 mm (6A) sein. Knochenwachstum Verhaftungen nach dieser Zeit wie die entzündliche und anabole Phasen der Regeneration nicht mehr, was zu einem nicht gewerkschaftlich Defekt. Nach 14 bis 21 Tagen nach der Heilung, das Volumen of de novo Knochen leicht von axialen Bildern von μCT Scannen erzeugten bestimmt werden. Verwendung der Abtastung in dem Protokoll beschriebene axiale Rekonstruktion und ROI-Auswahlverfahren, das Volumen des neuen Knochens erzeugt mit der Zeit zunimmt, jedoch im allgemeinen nicht überschreiten insgesamt 1 mm 3 in der Abwesenheit von therapeutischen Intervention (6C) im Vergleich zu 6- 7 mm 3 in einer anatomisch äquivalenten Bereich der unverletzten Femurs. Während herkömmliche biomechanischen Tests sind technisch anspruchsvoll aufgrund der Probengröße und der Art der Fixationsmethode, dem Trägheitsmoment (PMI), die Einschätzung der Fähigkeit eines Materials auf Torsion wider auf Basis von Querschnittsbereich und der Dichte, ist gezeigt, um eine geeignete Abschätzung der Stärke in langen Knochen 26,27 repräsentieren. Unter Verwendung dieses Verfahrens können axiale Querschnitte an verschiedenen Abständen von den Rändern Läsion zur Analyse ausgewählt werden. Nach 21 Tagen der PMI der de novo Knochen 0,25 mm from die Läsion Kanten im Bereich zwischen 0,05-0,35 mm 4 im Vergleich zu 0,02 bis 0,08 mm 4 in der Mitte der Läsion weitere Bestätigung der Anwesenheit von nicht gewerkschaftlich in unbehandelten Fällen (6D). Der Einkaufsmanagerindex der unverletzten Femurs bei einem anatomisch gleichwertige Position liegt typischerweise im Bereich zwischen 0,5 bis 0,7 mm 4 unter Verwendung der hier beschriebenen Bedingungen.
Abbildung 6: Typische Ergebnisse. (A) Röntgenscans von Oberschenkelknochen am Tag 7, 14 und 21 nach der Operation zeigen begrenzte Knocheneinwachsen Steuerung. B: Schematische Darstellung der ROI Parameter für volumetrische Knochenmessung. Repräsentative axialen Querschnitt mit einer Sperrzone (EX) über den Stift-Kragen einschließlich einer 100 um Marge auf die Messung von Artefakten an der Metall-Gewebe-Grenzfläche (links) auszuschließen. Vollständige Knochenscan (right, oben) zeigt den Längs ROI durch die Abschnitte von Knochen zwischen den Rändern der Kragen mit Original ausgeschlossen Knochengewebe (EX) definiert. Die ursprünglichen Läsion Kanten sind in den axialen Abschnitten mit der Differenz zwischen dem Durchmesser des Stifts und dem Kragen (rechts, unten) befindet. (C) Typischer volumetrische Messungen am Tag 7, 14 und 21 nach der Operation ohne therapeutische Intervention (Einrichtung mit Standardabweichungen, n = 3). (D) PMI Messungen an axialen Abschnitten 0,25 mm von der proximalen und distalen Läsion Kanten und Mittelpunkt (Mittelwerte mit Standardabweichungen, n = 3). (E) Masson Trichrom-gefärbten Paraffin eingebetteten Abschnitt (links) in Längsrichtung zeigt Knochen Auswuchs aus Knorpel (ca) und Spongiosa (b) (Maßstab = 0,5 mm) geschnitten. Die Position des Feldes auf der X-ray-Scan (rechts) angegeben. (F) nicht-decalcified, Methylmethacrylat eingebettet Frontalschnitt von 1 Tag alten Defekt mit Hämatoxylin und Eosin (Maßstab = 1,0 mm) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Entkalkung der Geweben dauert 10-14 Tage unter Standardbedingungen, und wird leicht durch Röntgenscan überwacht. Es ist ratsam, eine Muskulatur der Proben während der Entkalkung zu behalten, um die Stabilität bei der Handhabung zu verbessern. Nach Entkalkung, kann Stifte vorsichtig mit einem scharfen Skalpell erlaubt Paraffineinbettung und Histologie entfernt werden. Trichrom-Färbung von Längsabschnitten Masson ermöglicht die Visualisierung der enchondralen Knochen Auswuchs mit einer führenden Kante des Knorpels (CA), gefolgt von Spongiosa (cb) (6E). Während einige Schäden unweigerlich bei der Präparation auf, die histologische Struktur der Knochenund Bindegewebe bleibt unklar, ob der Stift sorgfältig entfernt. Alternativ kann Methylmethacrylat Einbetten und Schneiden von nicht-entmineralisierten Abschnitte mit dem Stift an Ort und Stelle (6F) durchgeführt werden.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um eine kritische großen Stift stabilisierten Defekt der Maus Femur mit Standard-Labor- und Tierarztausrüstung zu generieren. Während der Montage der Stifte und der Operation selbst benötigt der Praxis ist es im Rahmen der Fähigkeiten eines gut ausgebildeten biomedizinischen Forschung Wissenschaftler oder Tierarzt.
Der Stift wird in den Markraum ohne zusätzliche Fixierung positioniert, wodurch das Verfahren technisch machbar als kompliziertere Ansätze, Fixateurs externes oder Verriegelungsschrauben zu verwenden. Während einige Torsionsbewegung kann während der frühen Heilungsstadien auftreten, wird dies durch sorgfältige Aufmerksamkeit auf den Stiftdurchmesser und ausreichende Aufreiben des Markkanals minimiert, um so eine feste Preßpassung zwischen dem Implantat und Endosteum zu erreichen. Mit einer sorgfältigen Auswahl der Inzuchtstamm und Abstimmung von Alter und Geschlecht, wird die Passform reproduzierbar robust innerhalb von wenigen Tagen. Dennoch with dem Aufkommen von 3D-Druckverfahren, wird erwartet, dass Torsionsbewegung kann durch komplexere Versionen des Stiftes, die aufgerauhte Flächen und / oder mit Widerhaken versehene Befestigungsstellen inkorporieren reduziert werden. Die Leichtigkeit der Stiftherstellung und der Verfügbarkeit einer Vielzahl von hypodermischen Schlauchgrößen erlauben auch die Optimierung der Technik für praktisch jede erwachsenen Mausinzucht unabhängig von natürlichen oder experimentellen Knochen Phänotyp.
Die einzigartige Pin-Kragen-Design dient zwei Zwecken: (i), um anomale Verengung der Fehler und Schaden der Knochen Extremitäten durch Längsschlupf zu verhindern, und (ii) um die Landmarken, die die ursprünglichen Kanten des Mangels zu definieren ist. Als solche volumetrischen und PMI-Messungen kann einfach mit ein Exemplar μCT-Scanner, wie eine Skyscan 1174. In der Tat gemacht werden, erlaubt dieser Ansatz eine Quantifizierungsniveau, die nicht leicht mit Standard-unkritische große Bruch Techniken erhalten wird, die oftmals eine variable oder poorly definiert Verletzungen. Während ein μCT Einheit ist bevorzugt, die Quantifizierung der Heilung, der Beurteilung durch objektive Beurteilung der orthogonalen Röntgenaufnahmen oder 2D-Bildanalysetechniken können brauchbare Alternativen darstellen. Aufgrund ihrer geringen Größe und der relativ niedrigen Mineralgehalt können murine Glieder leicht zur Histologie vorbereitet und als ganze Proben für herkömmliche Histomorphometrie montiert. Dies entlässt Probenahme Fragen häufig von Forschern die Durchführung histomorphometrische Analysen von großen Tier Brüche konfrontiert.
In den hier beschriebenen Experimenten wurde die Heilungszeit von 3 Wochen, die zur schnellen, anabole Phase der Knochenheilung entspricht relativ kurz. Danach ist Knochenumbau ein sehr langsamer Prozess 28. Im Allgemeinen, wenn Brückenteil nicht nach 4 Wochen beobachtet, ist die Heilung unwahrscheinlich und in Absprache beobachten wir sehr wenig zusätzliche Knochenwachstum nach 4 Wochen in diesem System. Weiterhin ist ein 3 mm Abstand erfüllt die Kriterien der Key et al. 16 für eine kritische Größe Mangels und Garcia et al., dass ein Spalt so schmal wie 1,8 mm nicht ausreichend nach 10 Wochen heilen, und dies könnte zu 15 Wochen bei abgestreift Perichondrium 23 verzögert werden.
Während die Größe und Zerbrechlichkeit ihrer Knochen stellen ernsthafte technische Herausforderungen orthopädischen Forschung, ist die Verwendung von Mäusen vorteilhaft auf zahlreiche Weisen. Zum Beispiel gibt es eine Vielzahl von immungeschwächten Stämme, die das Testen von menschlichen Zellen und Proteinen erlauben, ohne Angst vor einer immunologischen Abstoßung, und ihre geringe Größe reduziert den Bedarf an großen Mengen von wertvollen experimentellen Materialien, Zellen oder Verbindungen. Dies wird durch unsere kürzlich durchgeführte Studie, die die Wirksamkeit von adulten menschlichen Stammzellen und deren extrazelluläre Proteine Osteoregeneration 29 beispielhaft dargestellt. Die relativ kurze Lebensspanne von Mäusen auch präsentieren die Gelegenheit für die Erforschung des Alterns 30 und die Vielzahl von Inzuchtstämmen peRMIT das Studium der globalen Genotyps auf die Heilung 31. Es gibt auch eine Reihe von Krankheitsmodellen, die sich leicht in Mäusen wie Diabetes und Osteoporose 32,33 etabliert sind. Von besonderer Bedeutung ist die Verfügbarkeit von vielen transgenen Mäusen, die mit dieser Technik verwendet werden, um das Verständnis der regenerative Knochenphysiologie bei extremer Trauma weiter verwendet werden kann.
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Acknowledgments
Wir danken dem Personal und Tierärzte an der Scott & White Krankenhaus Abteilung für Vergleichende Medizin, Temple, Texas, für ihre wertvolle Beratung und Unterstützung bei der Entwicklung dieser Technik. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Institut für Regenerative Medizin Programm Funds, Scott & White RGP Zuschuss # 90.172, NIH 2P40RR017447-07 und NIH R01AR066033-01 (NIAMS) gefördert. Wir danken Dr. Suzanne Zeitouni für das Proofing das Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
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