Abstract
发育中的胚胎的中胚层咽有助于头部和心脏肌肉组织的广泛地区。我们已经开发出一种学习的头部和心脏祖细胞发育与咽弓（也称为鳃弓） 离体的新方法。使用这种方法，我们最近描述了第二咽弓包含自我更新心脏祖细胞，并作为一个微环境对祖细胞的小鼠心脏发育过程中扩张。祖细胞分化仍然膨胀和拱内，但很快就成为功能的心肌细胞，因为它们迁移出弓。我们还报道说，第一咽弓包含肌肉祖离开后拱引起肌管。在这里，我们展示了解剖，并从发展中国家小鼠胚胎的第一和第二咽弓体外培养的过程。该方法使一个研究头部和心脏祖/ dev的肌肉elopment，包括心肌细胞和肌管的详细体外形成。
Introduction
咽中胚层细胞产生的心脏的部分和咽肌肉。在胚胎发育期间，从第二心脏字段多能心脏祖细胞从咽中胚层迁移和填充心脏流出道和右心室，和它们的异常发展密切出生缺陷和出生无缺陷的先天性心脏疾病的主要原因相关相关死亡在人类1-3。最近的研究已经表明，咽中胚层有助于头部肌肉，除了心脏，使得胚层的心颅面发展4的一个关键部分。因此，在发展过程中，包括诱导，增殖，以及头部和心脏祖细胞在咽中胚层分化正在积极调查5-7。
直到最近，它仍然是未知的心脏祖细胞是否发生无覆盖扩张UT分化，部分原因是由于他们的细胞环境信息的缺乏。我们最近的研究表明，咽弓作为微环境的心脏和肌肉祖细胞的更新和可体外培养在几个星期8。该块法提供了一个新颖而独特的机会来研究心颅面祖细胞体外的发展。
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Protocol
所有小鼠均维持在实验室动物护理的认可美国协会（AAALAC）-accredited在约翰·霍普金斯大学动物设施及安置按照指南中列出了实验动物的护理和使用的程序。该机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的所有实验方案。
1.实验准备
- 外套12孔板，用10％胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中60分钟。
- 除去涂布溶液，并添加200微升无血清培养基（SFM）的。捻盘，以确保媒体的膜覆盖整个表面区域。
2.外科手术
- 安乐死使用机构的动物护理委员会批准的协议，颈椎脱位，以确保完全安乐死孕鼠。
- 喷雾和清洁鼠标的腹部区域有70％乙醇。保持严格的无菌技术，以避免污染。
- 使用镊子和剪刀，使0.5 平方厘米的切口在肚脐区域。
- 用手指捏住/抢皮肤上方和下方的切口，然后轻轻拉动以相反的方向（头部和尾部）的皮肤。
- 使用镊子和剪刀，使在膜的初始切口在肚脐区域。轻轻地从肚脐至卵巢每侧（2×1.5 cm 2）的切成V字形的膜，从而揭示子宫。
- 使用镊子夹住子宫连接卵巢和剪刀输卵管捏在输卵管卵巢端，从而释放从卵巢子宫。
- 轻轻拉起子宫与镊子输卵管切摆脱用剪刀膀胱区的子宫。
- 进一步向上拉子宫通过用钳子的输卵管，并用剪刀剪下输卵管上的另一侧，从而从m释放子宫乌斯河。
- 子宫转移至50ml管中，并加入20毫升冷无菌PBS的与钙离子和镁离子 。 PBS必须包含在胚胎解剖钙离子和镁离子 。
- 轻轻摇动管10秒以洗涤子宫血。
- 从管转移子宫用镊子并将其放置在10ml的培养皿和对子宫的顶部添加冷PBS 5毫升。
- 与广场立体显微镜下子宫菜。
注意：步骤2.13-2.19需要立体显微镜。 - 使用两对镊子从子宫逐一轻轻打开子宫解剖用的胚胎囊羊水。
- 使用两对镊子小心地打开羊膜囊包围胚胎，掐国资委一个镊子轻轻地从胚胎中取出，用另一钳剪切和从胚胎释放羊膜囊。如果特定基因型的需要，保持羊膜囊进行基因分型。
- 在广场一侧的胚胎，并使用镊子削减1 和第 2 次向后拱到心脏的弓和咽囊（ 图1A''）之间。
- 轻轻翻转胚胎到另一边，并用钳子切断第一和第二拱后方的弓和咽囊之间的心脏。
- 使用镊子将那仍然是连接1 和第 2 次咽弓的胚胎心脏流出道。取出拱门，目前仍在连接在一起蝴蝶（ 图1B）的形状，从胚胎。
- 使用镊子夹住并从剩余的心脏流出道和肠内胚层释放1日咽弓（ 图1B'标有虚线和*）。
- 使用镊子夹住并从剩余的心脏流出道释放第二咽弓和前肠内胚层（ 图1B'表示与虚线和**）。
- 传输每对单独使用镊子拱门和放置两个拱门的中央指定的很好。板1 和第 2 次咽弓在不同的孔。确保拱在与在步骤1.2中加入介质薄膜接触。至关重要的是，拱门并不包含介质，因为它们需要在此期间，以与井用于附连的表面接触。
3.孵化和影像
- 孵育拱门镀在12孔板在37℃/ 5％CO 2下2小时为拱附加到孔表面面积。
- 轻轻加入200微升37℃的SFM井里的一侧。确保拱门保持连接，并培育O / N。
- 第二天，在视觉上检查咽弓连接，轻轻地加入200微升37℃SFM下来的边良好。如果仍然拱门未婚和漂浮，轻轻地用吸管取出介质而不删除拱门，直到只有媒体的膜离开。用枪头把拱门井和重复步骤3.1的中间。
- 日常监控;添加〜100-200微升媒体每2天更换任何媒体蒸发。
注：迁移细胞后24-48小时左右出现拱，将增殖和迁移拱在未来5-8天。后36-72小时形成跳动的心肌细胞可以从第二咽弓（ 图2B）中观察到。肌管形成可以从第1次咽弓3-7天附件（ 图2A）后进行观察。
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Representative Results
在开发过程中，面部肌肉和心脏祖细胞可以作为他们增殖并从1 和第 2 次咽弓迁移，成为头部和心脏肌肉组织，分别为（ 图1A，A'和A''）进行跟踪。培养咽弓提供学习心脏和肌肉的发育，详细体外的独特方式。解剖和附件咽弓后，从拱门连接迁移细胞可以在24-48小时的培养中观察到。内的培养肌管形成3天可以从1次咽弓和从第二咽弓心肌形成（ 图2A和2B）被观察到。心肌细胞的形成可通过自发收缩簇细胞迁移和/或特定的心肌标记物的分析在视觉上确认（ 例如，心肌肌钙蛋白T）。 Myotu可/面部肌肉形成可以通过长的细长（高达500微米长）自发抽搐细胞和/或特定的肌肉标记物（ 例如，肌细胞生成素）的分析进行目视观察。通过使用CRE-lox系统中的小鼠，中胚层子代可以通过荧光报告时CRE-表达体外培养（ 图2A'和2B'）期间跟踪。同样，用这种方法，可以研究后代的命运，其中感兴趣的特定基因被有条件地敲除或过表达，否则会导致早期胚胎致死性，因为我们先前描述的8。
图1：小鼠胚胎（CRE Mesp1，AI9）9.5天受精后（E.9.5 >）。 （ 一 ）左胚胎的一面。 （PA：咽弓，OT：流出道，LV：。左心室（A'）Mesp1行数踪; RFP标志着Mesp1 +细胞和它们的后代箭头表示RFP + Mesp1-后代的PA2是连续的OT。 （A''）虚线指示在何处削减PA1和PA2后的心脏（B）蝴蝶般左右PA1和PA2从胚胎解剖后FE：。肠内胚层（B'）RFP标记Mesp1后代在PA1和PA2（B''）* **，并用虚线表示一起到哪里切割并与OT和FE比例尺释放PA1和PA2：500微米请点击这里查看本一个更大的版本图。
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图2：培养咽弓 （ 一 ）培养PA1（培养3天）。 （A'）RFP在PA1标志着Mesp1后代。箭头和*表明早期肌管形成。 （A''）在PA1 RFP表达覆盖。 （二）培养PA2（8天的文化）。 （B'）中的RFP标记Mesp1子代中PA2。箭头和**表示跳动的心肌细胞的区域（从Shenje 等人 8修改）。 （B''）的PA2 RFP表达覆盖。比例尺：250微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这段视频中，我们将演示如何隔离和9.5天的小鼠胚胎文化第一和第二咽弓。咽弓是短暂的，分段出现在胚胎发育9，其中含有多能心脏祖细胞，积木胚胎10,11 -in第二拱门和头部肌肉祖细胞在第一拱8时，使心脏的craniolateral侧面凸起。
咽弓的解剖需要先进的小鼠胚胎解剖技能。一旦拱已成功解剖使用这种分步协议，并转移至预包被的孔，即拱连接到所述底部区域是至关重要的。在这个协议中，我们外套井具有10％FBS随后培养于SFM导致附着和拱的> 75％的增长，但是其它的涂层材料可用于（基质胶，明胶，纤连蛋白等 ）以及血清CONTA进不去媒体。
咽弓作为原基开发过程中大量的结构。初步形成了咽弓（8天后受精小鼠）后，每次点击费用扩大在PA2和迁移到心脏流出道在那里他们分化成心肌细胞，从而作为每次点击费用的可再生能源供给，以维持心脏细胞所需成长。由于咽弓是暂时的发育结构（E8-11.5）和每次点击费用的发生约E8-E10迁移到流出道），这带来了一定的限制的技术。对于中国共产党的研究，我们建议使用E9-10之间解剖咽弓，在这个阶段，每PA2含有约5-800 RFP +细胞（Mesp1行数痕迹）。
用荧光标记，这体外培养使我们能够监视开发祖细胞和它们分化 成跳动的心肌细胞肌小管或我ñ实时性。此外，这种体外培养系统可以用来研究影响使用现有的Cre / loxP位线心脏/肌肉祖细胞的增殖，迁移和分化细胞自主和微环境因素的作用。因此，该系统将有利于心脏/肌肉祖利基研究，这可能会导致更好的理解心脏/肌肉形成和疾病。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
