Abstract
Le mésoderme pharyngé d'embryons en développement contribue à de larges régions de la tête et le cœur musculature. Nous avons développé une nouvelle méthode pour étudier tête et le cœur le développement des cellules progénitrices avec des arcs pharyngés (aussi connu comme arcs branchiaux) ex vivo. En utilisant cette méthode, nous avons récemment décrit que le deuxième arc pharyngien contient progéniteurs cardiaques auto-renouvellement et sert un micro pour l'expansion des progéniteurs pendant le développement du cœur de souris. Les cellules progénitrices restent indifférencié et expansive intérieur de l'arc, mais deviennent rapidement cardiomyocytes fonctionnels comme ils migrent hors de l'arche. Nous avons également signalé que le premier arc pharyngien contient progéniteurs musculaires donnant lieu à des myotubes après avoir quitté l'arc. Ici, nous démontrons la procédure pour la dissection et ex vivo culture de premier et deuxième arcs pharyngés de développement des embryons de souris. La méthode permet d'étudier une tête et le cœur géniteur / dev musculaireeloppement, y compris les cardiomyocytes et myotube formation en détail ex vivo.
Introduction
cellules du mésoderme pharyngiens donnent lieu à des parties du coeur et les muscles pharyngés. Au cours du développement embryonnaire, multipotentes cellules progénitrices cardiaques de la deuxième champ cardiaque migrent du mésoderme pharyngé et peuplent la voie d'éjection cardiaque et le ventricule droit, et de leur développement anormal est étroitement associée à la maladie du coeur congénitale principale cause de malformations congénitales et la naissance defect- décès liés à l'homme 1-3. Des études récentes ont démontré que le mésoderme pharyngé contribue à la tête de muscles, en plus du coeur, ce qui rend le mésoderme un élément essentiel du développement de la cardio-craniofaciale 4. Ainsi, les processus de développement, y compris l'induction, la prolifération et la différenciation des progéniteurs cardiaques tête et dans le mésoderme pharyngé sont sous enquête active 5-7.
Jusqu'à récemment, il est resté inconnu si les cellules progénitrices cardiaques subissent l'expansion withodifférenciation ut, en partie en raison de l'absence d'informations sur leur environnement cellulaire. Notre étude récente suggère que les arcs pharyngiens servent un micro pour le renouvellement de progéniteurs cardiaques et musculaires et peuvent être cultivées ex vivo sur plusieurs semaines 8. Cette méthode des explants offre une occasion nouvelle et unique d'étudier le développement des progéniteurs cardio-craniofaciale ex vivo.
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Protocol
Toutes les souris ont été maintenus à une association américaine pour l'accréditation de laboratoire Animal Care (AAALAC) accrédité par l'animalerie de l'Université Johns Hopkins et logés conformément aux procédures décrites dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) a approuvé l'ensemble des protocoles expérimentaux.
1. Préparation expérimentale
- Manteau de plaque à 12 puits avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans la solution tamponnée au phosphate (PBS) pendant 60 min.
- Enlever la solution de revêtement et ajouter 200 ul de médias sans sérum (SFM). Twirl plaque pour veiller à ce que un film des médias couvre la totalité de la surface.
2. Interventions chirurgicales
- Euthanasier les souris enceintes utilisant le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux de l'institution suivie par dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.
- Pulvériser et nettoyer la région du ventre de la souris avec 70%l'éthanol. Maintenir techniques stériles strictes pour éviter la contamination.
- Utiliser des pinces et des ciseaux pour faire une incision de 0,5 cm 2 à la région du nombril.
- Utilisez les doigts pour pincer / saisir la peau au-dessus et en dessous de l'incision et tirez doucement la peau dans des directions opposées (de tête et de queue).
- Utiliser des pinces et des ciseaux pour faire une incision initiale dans la membrane de la région du nombril. Couper délicatement la membrane en forme de V entre le nombril et les ovaires de chaque côté (2 x 1,5 cm 2), révélant ainsi l'utérus.
- Utilisez une pince pour pincer l'oviducte reliant l'utérus à l'ovaire et des ciseaux pour pincer l'oviducte sur le côté de l'ovaire, libérant ainsi l'utérus de l'ovaire.
- Tirez doucement l'utérus par l'oviducte avec la pince et couper l'utérus libre de la région de la vessie avec des ciseaux.
- Tirer l'utérus en outre par l'oviducte avec la pince, et couper avec des ciseaux l'oviducte de l'autre côté, en libérant ainsi l'utérus de la mouse.
- Transfert de l'utérus à un tube de 50 ml et ajouter 20 ml de PBS froid stérile avec du Ca 2+ et Mg 2+. PBS doit contenir Ca 2+ et Mg 2+ au cours de la dissection embryon.
- Secouer doucement le tube pendant 10 sec pour laver l'utérus de sang.
- Transfert de l'utérus à partir du tube avec une pince et placez-le dans un plat de 10 ml et ajouter 5 ml de PBS froid sur le dessus de l'utérus.
- Placez le plat avec l'utérus sous un stéréomicroscope.
Remarque: Les étapes 2.13 à 2.19 nécessite une loupe binoculaire. - Utiliser deux paires de pinces pour ouvrir doucement l'utérus et disséquer sacs amniotiques embryons avec de l'utérus, un par un.
- Utilisez deux paires de pinces à ouvrir avec précaution le sac amniotique qui entoure l'embryon, pincer le sac avec une pince et doucement retirer de l'embryon, utiliser les autres pince à couper et à libérer le sac amniotique de l'embryon. Si un génotype spécifique nécessaire, garder sac amniotique pour le génotypage.
- Placez l'embryon sur le côté et utiliser une pince pour couper le 1 er et 2 ème arc postérieur au cœur entre la voûte et la poche pharyngée (figure 1A '').
- Retourner doucement à l'embryon de l'autre côté et utiliser une pince pour couper le 1er et le 2ème arc postérieur au cœur entre la voûte et la poche pharyngée.
- Utilisez une pince pour couper la voie d'éjection cardiaque qui est encore connecte le 1 er et 2 ème pharyngés arches à l'embryon. Retirez les arches, qui sont encore attachés ensemble sous la forme d'un papillon (figure 1B), à partir de l'embryon.
- Utilisez une pince pour pincer et libérer les 1 er pharyngés arches du reste cardiaque voies de sortie et l'endoderme intestin antérieur (figure 1B '' indiqué par une ligne pointillée et *).
- Utilisez une pince pour pincer et de libérer les arches 2 ème pharyngés de la sortie cardiaque restant voieset endoderme intestin antérieur (figure 1B '' indiqué par une ligne pointillée et **).
- Transférer chaque paire d'arcs séparément à l'aide des pinces et placer les deux arches en plein milieu d'un bien désigné. Planche 1 er et 2 ème pharyngés arcs dans des réservoirs séparés. Assurez-vous que les arches sont en contact avec le film de support a été ajoutée à l'étape 1.2. Il est crucial que les arcs ne sont PAS couverts par le milieu, car ils ont besoin de prendre contact avec la surface du puits pour la fixation au cours de cette période.
3. Incubation et imagerie
- Incuber arcs métallisés dans la plaque à 12 puits à 37 ° C / 5% de CO2 pendant 2 h pour les arcs se fixer à la surface du puits.
- Ajouter délicatement 200 pi de 37 ° C GDF sur le côté du puits. Assurez-vous que les arcs restent attachés et incuber O / N.
- Le lendemain, vérifier visuellement que arcs pharyngés sont attachés et ajouter doucement 200 pi de 37 ° C GDF sur le côté de labien. Si arches restent seules et flottante, retirez délicatement les médias avec une pipette sans enlever arcs jusqu'à ce que seul un film des médias est à gauche. Utilisez pointe de la pipette pour placer des arcs dans le milieu du bien et répétez l'étape 3.1.
- Daily Monitor; ajouter ~ 100-200 pi des médias tous les 2 jours pour remplacer tout support évaporé.
Remarque: 24-48 heures après la migration des cellules apparaissent autour de l'arc et proliférer et migrer d'arc au cours des 5-8 prochains jours. Après la formation de 36-72 heures de cardiomyocytes battant peut être observée à partir de la 2 ème pharyngée arc (figure 2B). Formation Myotubes peut être observée à partir des 1 er pharyngée arc 3-7 jours après la fixation (figure 2A).
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Representative Results
Au cours du développement, musculaires et cardiaques progéniteurs du visage peuvent être tracées comme ils prolifèrent et migrent de la 1 ère et 2 ème pharyngée arc, à devenir la tête et le cœur musculature, respectivement (figure 1A, A 'et A' '). Cultivant arcs pharyngés offre un moyen unique d'étudier le développement du cœur et des muscles en détail ex vivo. Après dissection et la fixation des arcs pharyngés, migration des cellules provenant arcs attachés peuvent être observés dans les 24-48 heures de la culture. Dans les 3 jours de culture la formation de myotubes peut être observé à partir du 1er arcs pharyngés et la formation des cardiomyocytes des arcs pharyngés 2 e (figure 2A et 2B). formation des cardiomyocytes peut être confirmée visuellement par des amas de cellules et / ou l'analyse de marqueurs spécifiques des cardiomyocytes qui migrent spontanément contracter (par exemple, troponine cardiaque T). Myotuêtre la formation / du visage musculaire peut être observé visuellement par une longue allongée (jusqu'à 500 mm de longueur) cellules et / ou l'analyse de marqueurs musculaires spécifiques (par exemple, myogénine) secousses spontanément. En utilisant le système cre-lox chez la souris, le mésoderme progéniture peut être retracée par des journalistes fluorescentes sur cre-expression pendant culture ex vivo (figure 2A 'et 2B'). De même, avec ce procédé, il est possible d'étudier le sort de la descendance, dans lequel un gène d'intérêt spécifique est éliminé sous condition ou surexprimé, qui, sinon, conduire à une létalité embryonnaire précoce comme nous l'avons décrit précédemment 8.
Figure 1: embryon de souris (Mesp1 cre, AI9) 9,5 jours après la fécondation (E.9.5 >). (A) de l'embryon côté gauche. (PA: pharyngée Arche, OT: Outflow voies, LV:.. Ventricule gauche (A ') Mesp1 lignée trace; DP marque Mesp1 + cellules et de leur progéniture flèche indique DP + Mesp1-descendants dans PA2 qui est continue avec l'OT. (A '') de la ligne pointillée indiquer où couper PA1 et PA2 postérieure au coeur (B) PA1 papillon comme à droite et à gauche et PA2 après dissection de l'embryon FE:.. endoderme intestin antérieur (B.) marques de DP Mesp1 descendance . en PA1 et PA2 (B '') * et ** avec les lignes en pointillés indique où couper et relâchez PA1 et PA2 de l'OT et FE Barre d'échelle:.. 500 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2:. Arcs pharyngés de culture (A) PA1 de culture (3 jours de culture). (A ') RFP marque Mesp1 descendance dans PA1. Les flèches et les * indiquent la formation de myotubes tôt. (A '') Superposition d'expression de la DP dans PA1. (B) PA2 Cultured (8 jours de culture). (B ') des marques de DP Mesp1 descendance dans PA2. Les flèches et ** indiquent domaine de cardiomyocytes (modifié depuis Shenje et al. 8) battre. (B '') Superposition d'expression de la DP dans PA2. Barre d'échelle:. 250 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons comment isoler et de la culture premier et deuxième arcs pharyngés de 9,5 jours anciens embryons de souris. Arcs pharyngés sont transitoires, renflements qui apparaissent sur le côté craniolateral d'embryons en développement 9, qui contiennent plusieurs puissants blocs-de construction des cellules progénitrices cardiaques à faire le cœur pendant l'embryogenèse 10,11 -en deuxième arcs et des progéniteurs tête musculaires dans 8 premiers arcs segmentés .
Dissection d'arcs pharyngés nécessite avancées embryon de souris compétences de dissection. Une fois que les arcs ont été disséqués avec succès en utilisant ce protocole par étapes et transféré à des puits pré-enrobés, il est essentiel que les arcs se fixent à la surface de fond. Dans ce protocole, nous revêtir les puits avec 10% de FBS suivies par la culture dans la GDF résultant dans l'attachement et la croissance de> 75% des arches, cependant, d'autres matériaux de revêtement peuvent être utilisés (matrigel, la gélatine, fibronectine, etc.) ainsi que conta sériquemédias INING.
Les arcs pharyngiens sert primordia pour une multitude de structures au cours du développement. Après la formation initiale des arcs branchiaux (8 jours après la fécondation chez la souris), les CPC développer dans le PA2 et migrent dans la voie d'éjection cardiaque où ils se différencient en cellules cardiaques, servant ainsi une source renouvelable de CPC qui fournit les cellules nécessaires au maintien de coeur croissance. Comme les arcs branchiaux sont des structures temporelles de développement (de E8-11.5) et la migration des CPC dans les voies de sortie se produit d'environ E8-E10) cela apporte certaines limitations à la technique. Pour les études CPC, nous recommandons d'utiliser des arcs pharyngés disséqués entre E9-10, à ce stade, chaque PA2 contenir environ 5-800 DP + cellules (Mesp1 lignée trace).
Avec marquage fluorescent, cette culture ex vivo nous permet de surveiller progéniteurs en développement et leur différenciation en cardiomyocytes battant ou myotubes in en temps réel. En outre, cette ex vivo système de culture peut être utilisé pour étudier les rôles des facteurs de cellules autonomes et micro-environnementales affectant cardiaque prolifération / progénitrices de la cellule musculaire, la migration et la différenciation en utilisant des lignes Cre / loxP existants. En tant que tel, est attendu ce système pour faciliter les études progéniteur-de niche cardiaques / musculaires, qui peuvent conduire à une meilleure compréhension de coeur / formation du muscle et de la maladie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
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